يصف هذا البروتوكول كيفية تقطيع أنسجة القلب واستزراعها في ظل ظروف فسيولوجية لمدة 6 أيام. يمكن استخدام هذا النظام الثقافي كمنصة لاختبار فعالية علاجات فشل القلب الجديدة وكذلك الاختبار الموثوق به للسمية القلبية الحادة في نموذج القلب ثلاثي الأبعاد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح وزراعة قلوب الخنازير في ظل الظروف الفسيولوجية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من الأدوية الجديدة تفشل في الدراسات السريرية بسبب الآثار الجانبية السامة للقلب كما تتوفر حاليا في المقالات المختبرية وفي نماذج الحيوانات على الجسم الحي التنبؤ بشكل سيئ التزامات القلب البشري, تشكل عبئا بمليارات الدولارات على صناعة الأدوية. وبالتالي، هناك حاجة طبية غير ملباة في جميع أنحاء العالم إلى نهج أفضل لتحديد سمية القلب الدوائية قبل إجراء تجارب مكلفة وتستغرق وقتاطويلا "أولا في الإنسان". حاليا، يتم استخدام خلايا القلب غير ناضجة فقط (الإنسان المستحث ة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من القلب [hiPSC-CMs]) لاختبار الكفاءة العلاجية وسمية المخدرات لأنها الخلايا القلبية البشرية الوحيدة التي يمكن استزراعها لفترات طويلة مطلوب لاختبار فعالية الدواء والسمية. ومع ذلك، لا يمكن لنوع خلية واحدة تكرار النمط الظاهري لأنسجة القلب 3D المعقدة التي تتشكل من أنواع خلايا متعددة. والأهم من ذلك، يجب اختبار تأثير الأدوية على خلايا القلب البالغة، التي لها خصائص مختلفة واستجابات سمية مقارنة بـ hiPSC-CMs غير الناضجة. توفر هذه التقنية الوصول إلى نظام كامل متعدد الخلايا يحاكي أنسجة القلب البشرية ويعكس الظروف الفسيولوجية أو المرضية لعضلة القلب البشرية. في الآونة الأخيرة ، من خلال تحسين مكونات وسائل الإعلام الثقافية وظروف الثقافة لتشمل التحفيز الكهربائي المستمر في 1.2 هرتز والأوكسجين المتقطع للوسيط الثقافي ، قمنا بتطوير إعداد نظام ثقافة جديد يحافظ على قابلية البقاء وظائف الإنسان والخنازير شرائح القلب لمدة 6 أيام في الثقافة. في البروتوكول الحالي، نحن نفصّل طريقة تقطيع وزراعة قلب الخنزير كمثال. يستخدم نفس البروتوكول لثقافة شرائح من قلوب الإنسان أو الكلب أو الأغنام أو القطط. هذا النظام الثقافي لديه القدرة على أن يصبح الإنسان التنبؤية قوية في الموقع لاختبار السمية القلبية الحادة التي تسد الفجوة بين نتائج الاختبار قبل السريرية والسريرية.
المقدمة
السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي سبب رئيسي لانسحاب السوق1. في العقد الأخير منالقرن العشرين، تم سحب ثمانية أدوية غير قلبية وعائية من السوق لأنها أدت إلى الوفاة المفاجئة بسبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي العديد من العلاجات المضادة للسرطان (في حين أنها فعالة في كثير من الحالات) إلى العديد من الآثار السامة للقلب بما في ذلك اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي كل من العلاجات التقليدية (مثل الجمرة الخبيثة والإشعاع) والمستهدفة (على سبيل المثال، trastuzumab) علاجات سرطان الثدي إلى مضاعفات القلب والأوعية الدموية في مجموعة فرعية من المرضى
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وكانت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات متفقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة لويزفيل ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. التحضير للتشريح (قبل يوم واحد من تشريح)
- إعداد الميكروتوم المهتز
- ضع شفرة السيراميك في حاملها باتباع هذه الخطوات: بعد فك شفرة بعناية، ضع الحافة الحادة أولاً في فتحة أداة الشفرة. ثم، تناسب شفرة في حامل عن طريق تخفيف مسامير اثنين على ذراعي حامل والشريحة شفرة تحت كل الزواة ودفعها بقوة مرة أخرى ضد توقف الخلفي. تشديد مسامير لتأمين شفرة.
ملاحظة: لا ينبغي تشديد البراغي. - معايرة النصل باستخدام بروتوكول المعايرة والأدوات وفقا لبروتوكول....
- ضع شفرة السيراميك في حاملها باتباع هذه الخطوات: بعد فك شفرة بعناية، ضع الحافة الحادة أولاً في فتحة أداة الشفرة. ثم، تناسب شفرة في حامل عن طريق تخفيف مسامير اثنين على ذراعي حامل والشريحة شفرة تحت كل الزواة ودفعها بقوة مرة أخرى ضد توقف الخلفي. تشديد مسامير لتأمين شفرة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام محفز كهربائي لثقافة الخلية المتاحة تجاريًا يمكنه استيعاب ثمانية 6 لوحات بئر في وقت واحد ، قمنا بمحاكاة الوسط القلبي للبالغين عن طريق تحفيز التحفيز الكهربائي عند التردد الفسيولوجي (1.2 هرتز) ، وفحصنا للمكونات المتوسطة الأساسية لإطالة مدة شرائح قلب الخنزير الوظيفية في الثقافة13. منذ الخنازير وقلوب الإنسان متشابهة في الحجم والتشريح15، وضعنا نظام ثقافة شريحة القلب المحاكاة الحيوية باستخدام قلوب الخنازير والتحقق من صحتها في وقت لاحق في ش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نحن وصف بروتوكول الفيديو مفصلة لطريقتنا نشرت مؤخرا لإنتاجية متوسطة مبسطة (عمليات تصل إلى 48 شرائح / جهاز) الأسلوب الذي يتيح ثقافة شرائح قلب الخنزير لفترة طويلة بما فيه الكفاية لاختبار سمية القلب الحادة13. تحاكي الظروف المقترحة بيئة القلب، بما في ذلك تواتر التحفيز الكهربائي، وتوافر المغذيات، والأكسجين المتقطع. نحن نعزو قابلية شرائح القلب لفترات طويلة في ثقافتنا المحفزة للمحاكاة الحيوية إلى تركيزنا على إعادة خلق الظروف الفسيولوجية التي يعاني منها القلب السليم. ويدعم هذا المفهوم من قبل بياناتنا ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
TMAM حاصل على أسهم في تينايا للعلاجات. لم يبلغ المؤلفون الآخرون عن أي تعارضات.
شكر وتقدير
ويدعم TMAM من قبل المعاهد القومية للصحة منحة P30GM127607 وجمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG29950012. ويدعم RB من قبل P01HL78825 وUM1HL113530.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1,000 مل ، 0.22 & ميكرو ؛ م ، فلتر فراغ / أنظمة التخزين | VWR | 28199-812 | |
| 2،3-بوتانيديون مونوكسيم (BDM) فيشر | AC150375000 | ||
| 500 مل ، 0.22 وميكرو ؛ م ، فلتر الفراغ / أنظمة التخزين | VWR | 28199-788 | |
| غطاء طبق C 6 آبار (غطاء لوحة التحفيز الكهربائي) | أيون أوبتكس | CLD6WFC | |
| ألواح 6 آبار | فيشر | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| المضاد الحيوي المضاد للفطريات | الحرارية | 15-240-062 | |
| C-Pace EM ( محفز كهربائي للخلية) | أيون أوبتكس | CEP100 | |
| كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>) شفرات | فيشر | C79-500 | |
| لاهتزاز Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| ضام الصدر كولي | ميلينيوم جراحي | 63-G5623 | |
| D-جلوكوز | فيشر | D16-1 | |
| مشرط يمكن التخلص منه # 20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| مصافي خلية الصقر ، معقمة ، Corning | VWR | 21008-952 | |
| مصل الأبقار الجنيني | الحراري | A3160502 | |
| ملقط Graefe | فيشر | NC9475675 | |
| ملح الصوديوم الهيبارين | سيجما ألدريتش | H3149-50KU | |
| هيبس | فيشر | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue Glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/< / a> | |
| Iris Spring | مقص فيشر | NC9019530 | |
| قزحية مستقيمة | فيشر | 731210 | |
| إيزوفلوران ، USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| مكمل الوسائط السائلة | ITS Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| كيتامين هيدروكلوريك (500 مجم / 10 مل) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>) مقص | |||
| Mayo SuperCut الجراحي | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut & trade; 07.164.17 | |
| Medium 199 ، Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| منظم الأكسجين | Praxair | ||
| خزانات الأكسجين - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur ماصات | فيشر | 13-711-48 | |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | فيشر | AC193780010 | |
| حزام توقيت الطابعة | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/< / a> | |
| شفرات مستطيلة | شائكة فيشر | 12-640 | |
| مؤتلف الإنسان FGF الأساسي | R& D Systems | 233-FB-025 / CF | |
| المؤتلف البشري VEGF | R & D Systems | 293-VE-010 / CF | |
| مشارط قابلة للسحب | فيشر | 22-079-716 | |
| بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>) | فيشر | AC217125000 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | فيشر | AC327300010 | |
| تهتز Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 مجم / مل) | هارتلاند للإمدادات البيطرية | NADA 139-236 |
المراجع
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10(2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
