يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد

7.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60915

⸱

مايو 23, 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

في هذه المقالة

ملخص

نحن بالتفصيل طريقة بسيطة لإنتاج أفلام عالية الدقة الفاصل الزمني من أسراب Pseudomonas aeruginosa التي تستجيب لbacteriophage (phage) والإجهاد المضادات الحيوية باستخدام ماسح ضوئي وثيقة مسطحة. هذا الإجراء هو طريقة سريعة وبسيطة لرصد ديناميات يحتشدون ويمكن تكييفها لدراسة حركية ونمو الأنواع البكتيرية الأخرى.

الملخص

يحتشدون هو شكل من أشكال حركية السطح لوحظ في العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa والإشريكية القولونية. هنا ، تتحرك مجموعات كثيفة من البكتيريا على مسافات كبيرة في مجتمعات مميزة على شكل وترلي على مدار ساعات. الدفء حساس لعدة عوامل بما في ذلك الرطوبة المتوسطة والرطوبة ومحتوى المغذيات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استجابة الإجهاد الجماعية ، التي لوحظت في P. aeruginosa التي يتم الضغط عليها من خلال المضادات الحيوية أو البكتيريا (phage) ، تصد أسراب من الاقتراب من المنطقة التي تحتوي على الإجهاد. وتتناول الأساليب الموصوفة هنا كيفية التحكم في العوامل الحرجة التي تؤثر على الاحترار. نقدم طريقة بسيطة لرصد الديناميكيات المحتشدة والاستجابة الجماعية للإجهاد بدقة زمنية عالية باستخدام ماسح ضوئي للمستندات المسطحة ، ووصف كيفية تجميع وإجراء تحليل كمي للأسراب. توفر هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة قياسًا كميًا دقيقًا وجيد التحكم فيه للاحترار ويمكن توسيعنطاقها لتشمل أنواعًا أخرى من المقالات النمو القائمة على الصفائح والأنواع البكتيرية.

المقدمة

يحتشدون هو شكل جماعي من الحركة البكتيرية المنسقة التي تزيد من مقاومة المضادات الحيوية وإنتاج عوامل الفوعة في المضيف1،2،3. يحدث هذا السلوك متعدد الخلايا على الأسطح شبه الصلبة التي تشبه تلك الطبقات المخاطية التي تغطي الأغشية الظهارية في الرئتين4،5. يتم إنتاج المواد البيولوجية السطحية عادة من قبل السكان يحتشدون للتغلب على التوتر السطحي على الأسطح ويتم تنظيم إنتاج هذه من قبل أنظمة الإشارات الخلايا المعقدة، والمعروفة أيضا باسم استشعار النصاب6،7،8. العديد من أنواع البكتيريا قادرة على يحتشدون، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، المكورات العنقودية أوريوس، والإشريكية القولونية9،10،11،12. الأنماط المحتشدة التي تخلقها البكتيريا متنوعة وتتأثر بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للطبقة السطحية بما في ذلك تكوين المغذيات والمسامية والرطوبة13،14. بالإضافة إلى خصائص السطح، تؤثر درجة حرارة النمو والرطوبة المحيطة على عدة جوانب من الديناميكيات الدافئة، بما في ذلك معدل الاحترار والأنماط12،13،14،15. تخلق متغيرات النمو التي تؤثر على الاحترار تحديات تؤثر على قابلية الاستنساخ التجريبي والقدرة على تفسير النتائج. هنا ، نحن نصف طريقة موحدة بسيطة لمراقبة ديناميات أسراب البكتيريا من خلال التصوير الفاصل الزمني. تصف الطريقة كيفية التحكم في ظروف النمو الحرجة التي تؤثر بشكل كبير على تطور الاحترار. بالمقارنة مع الطرق التقليدية لتحليل سرب، وهذا الأسلوب التصوير الفاصل الزمني تمكن تتبع حركية أسراب متعددة في وقت واحد خلال فترات طويلة من الزمن ومع دقة عالية. وتحسن هذه الجوانب من عمق البيانات التي يمكن الحصول عليها من أسراب الرصد وتيسر تحديد العوامل التي تؤثر على الاحترار.

يسهل الاحترار في P. aeruginosa من خلال إنتاج وإطلاق الرهامنوبيدات و3-(3-هيدروكسي الكانويللوكسي) الأحماض الهلوليك فيالمنطقةالمحيطة 6,16. إن إدخال الإجهاد الناجم عن التركيزات شبه المميتة للمضادات الحيوية أو العدوى بفيروس الفاتج يؤثر على تنظيم الأسراب. على وجه الخصوص، هذه الضغوط تحفز P. aeruginosa لإطلاق جزيء استشعار النصاب 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone، المعروف أيضا باسم إشارة الكينوالون السودوموناس (PQS)17،18. في المقايسات سرب التي تحتوي على مجموعتين من أسراب, PQS التي تنتجها السكان الناجمة عن الإجهاد يصد أسراب غير المعالجة من دخول المنطقة التي تحتوي على الإجهاد(الشكل 1). هذه الاستجابة الإجهاد الجماعي يشكل نظام إشارة الاتصالات الخطر الذي يحذر P. aeruginosa حول التهديدات القريبة18,19. آثار الإجهاد على P. aeruginosa، وتفعيل استجابة الإجهاد الجماعية ، وتنافر الأسراب يمكن تصورها باستخدام طريقة التصوير الفاصل الزمني الموصوفة هنا. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية: (1) إعداد لوحات أجار لليحتشّاب، (2) الثقافة P. aeruginosa لهذين النوعين من المقالات (المقالات التقليدية أو المقايسات الجماعية للاستجابة للإجهاد)(الشكل 1)،(3) الحصول على صور الفاصل الزمني، و(4) استخدام ImageJ لتجميع وتحليل الصور.

لفترة وجيزة، رصدت P. aeruginosa من ثقافة بين عشية وضحاها في منتصف لوحة أجار يحتشدون في حين رصدت P. aeruginosa التي يتم إصابة phage أو تعامل مع المضادات الحيوية في مواقع الأقمار الصناعية. يتم رصد تطور P. aeruginosa يحتشدون على ماسح ضوئي مسطح وثيقة المستهلك التي يتم وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية تنظم الرطوبة. يتم التحكم في الماسح الضوئي من خلال برنامج يقوم تلقائيًا بمسح اللوحات على فترات منتظمة خلال فترة نمو السرب ، عادة ً ما تكون 16-20 ساعة. هذه الطريقة تسفر عن أشرطة الفيديو الفاصل الزمني المتزامنة تصل إلى ستة لوحات 10 سم يحتشدون. يتم تجميع الصور في أفلام ويتم قياس نفور الأسراب من قبل السكان الناجمعن الإجهاد باستخدام برنامج ImageJ المتاح بحرية. ويولى اهتمام خاص لضمان الاتساق والاستنساخ بين مختلف التجارب المحتشدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد ألواح أجار يحتشدون لP. aeruginosa يحتشدون الوقت الفاصل التصوير

  1. إعداد 1 L من 5x M8 الحد الأدنى وسائل الإعلام في زجاجة بإضافة 64 غرام من نا2HPO4• 7H2O، 15 غرام من KH2PO4،و 2.5 غرام من NaCl في 500 مل الماء المقطر المزدوج (ddH2O). ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 1 L مع ddHإضافية 2O. أوتوكلاف لتعقيم وتخزين الوسائط السائلة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد 100 مل من 1 M MgSO4 (كبريتات المغنيسيوم) في زجاجة بإضافة 24.6 غرام من MgSO4• 7H2O في 50 مل ddH2O. ضبط الحجم النهائي إلى 100 مل مع ddHإضافية 2O. أوتوكلاف لتعقيم. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد 100 مل من 20٪ أحماض كاسامينو في زجاجة عن طريق إضافة 20 غرام من الأحماض casamino في 50 مل ddH2O. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع ddHإضافية 2O. أوتوكلاف لتعقيم. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد 100 مل من الجلوكوز 20٪ في زجاجة عن طريق إضافة 20 غرام من الجلوكوز في 50 مل ddH2O. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع ddHإضافية 2O. تعقيم عن طريق الترشيح مع مرشح 0.22 ميكرومتر. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  5. لجعل 10 لوحات أجار يحتشدون، إضافة 1 غرام من أجار في 100 مل من ddH2O وضبط حجم النهائي إلى 160 مل مع ddHإضافية 2O في قارورة إرلينماير 250 مل. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف.
    1. مباشرة بعد الأوتوكلاف، وضع محلول أجار في حمام مائي 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. إزالة محلول الأجار من حمام الماء وإضافة 40 مل من 5x M8 الحد الأدنى من وسائل الإعلام، 200 ميكرولتر من 1 M MgSO4،2 مل من الجلوكوز 20٪، و 5 مل من 20٪ أحماض كاسامينو15. انتقل إلى الخطوة 1.6 مباشرة بعد الاختلاط.
      ملاحظة: التركيزات النهائية هي 0.5٪ أجار، 1 mM MgSO4،0.2٪ الجلوكوز، و 0.5٪ أحماض كاسامينو.
  6. باستخدام ماصة 25 مل لحجم ثابت، إضافة 20 مل من محلول أجار يحتشدون لكل 10 سم قطرها طبق بيتري.
    ملاحظة: حجم ثابت من محلول أجار مهم، حيث يؤثر الحجم على وقت التجفيف ومحتوى الرطوبة في agar. تجنب فقاعات عند جعل لوحات أجار يحتشدون.
  7. السماح للأجار لترسيخ عن طريق وضع لوحات أجار يحتشدون في كومة واحدة مع أغطية على لمدة 1 ساعة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل مزيل الرطوبة لتقليل الرطوبة النسبية للغرفة إلى 40-50٪ 1 ساعة قبل الخطوة التالية.
  8. تجفيف لوحات الأجار يحتشدون لمدة 30 دقيقة إضافية مع الأغطية قبالة في غطاء تدفق لامي في 300 قدم3/ دقيقة مع 40-50٪ الرطوبة النسبية في درجة حرارة الغرفة. تجفيف المناطق الداخلية من الأغطية عن طريق وضعها الوجه حتى في غطاء تدفق لاميدنار. تخزين لوحات أجار يحتشدون في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
  9. إعداد أسود 10 سم أغطية طبق بيتري للتصوير عن طريق تنعيم داخل الغطاء مع الصنفرة. وضع الأغطية داخل صندوق التعبئة والتغليف ووضع مربع التعبئة والتغليف تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. رش داخل الأغطية باستخدام طلاء رذاذ أسود. السماح للأغطية لتجف.
    ملاحظة: قد يتم إعادة استخدام الأغطية السوداء لإجراء تجارب إضافية. من المهم أن يتم طلاء الأغطية بحيث لا تعكس الضوء أثناء المسح الضوئي.

2- نمو P. aeruginosa وظروف الطلاء

  1. إعداد 400 مل من مرق الليسوجيني (LB) عن طريق إضافة 10 غرام من مزيج مسحوق LB-Miller إلى 400 مل ddH2O. لأطباق LB-agar Petri 2٪، أضف 8 غرام إضافية من أجار. الأوتوكلاف للتعقيم.
  2. صب 20 مل من المتوسط LB-agar المنصهرة في أطباق بيتري قطرها 10 سم والسماح لهم لترسيخ في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. تخزين وسائل الإعلام السائلة في درجة حرارة الغرفة ولوحات أجار في 4 °C.
  3. خط P. aeruginosa على طبق LB-agar Petri من مخزون مجمد مخزنة عند -80 درجة مئوية باستخدام حلقات معقمة أو عصي خشبية. احتضان طبق بيتري رأسا على عقب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تخزين لوحة LB-agar في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
  4. اختيار مستعمرة واحدة من طبق بيتري مع حلقة معقمة أو عصا خشبية، تطعيمه إلى 2 مل LB المتوسطة، واحتضان الثقافة إلى التشبع بين عشية وضحاها (16-18 ح) في 37 درجة مئوية في طبل الأسطوانة مجموعة في 100 دورة في الدقيقة.
  5. Pipet 5 μL من الثقافة بين عشية وضحاها من الخطوة 2.4 باستخدام أنبوب P20 وبقعة في وسط لوحة أجار يحتشدون عن طريق الاقتراب من طرف pipet في زاوية (10-45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة اكتشاف، pipetting وصولا الى المحطة الأولى، ولمس أغار مع قطرة السائل فقط(الشكل 1B).
    1. تجنب لمس أجار مع طرف pipet كما أنه يضر أجار. استخدام قالب من أجل وضع بقعة باستمرار عبر لوحات أجار مختلفة(الرقم التكميلي S1).
    2. بالنسبة للمقالات التقليدية، استخدم مركز المركز فقط وانتقل إلى الخطوة 2.8. للحصول على الاستجابات الإجهاد الجماعي الأقوال الاستمرار في الخطوة 2.6 (لعدوى phage) أو الخطوة 2.7 (للإجهاد المضادات الحيوية).
  6. للعدوى phage، مزيج 30 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها من P. aeruginosa من الخطوة 2.4 مع 6 ميكرولتر من 1 × 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
    1. Pipet 6 μL من P. aeruginosa-phageخليط من الخطوة 2.6 باستخدام أنبوب P20 وبقعة في 6 مواقف الأقمار الصناعية متساوية البعد على دائرة نصف قطرها 2.8 سم متحدة المركز التي تركز تتركز في طبق بيتري عن طريق الاقتراب من طرف pipet في زاوية (10 إلى 45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة اكتشاف، الأنابيب وصولا إلى المحطة الأولى، ولمس أجار مع قطرة السائل فقط(الشكل 1C).
    2. تجنب لمس أجار مع طرف pipet كما أنه يضر أجار. استخدام قالب الطلاء للاتساق(الرقم التكميلي S1). انتقل إلى الخطوة 2.8.
  7. للعلاجات بالمضادات الحيوية، مزيج 30 ميكرولتر الثقافة بين عشية وضحاها P. aeruginosa من الخطوة 2.4 مع 6 ميكرولتر من 3 ملغ / مل جنتاماشين، 10 ميكرولتر من 100 ملغ / مل كاناماين، أو 7.5 ميكرولتر من 100 ملغ / مل fosfomycin. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
    1. Pipet 6 μL من المضادات الحيوية المعالجة P. aeruginosa من الخطوة 2.7 باستخدام ماصة P20 وبقعة في 6 مواقف الأقمار الصناعية متساوية البعد على دائرة نصف قطرها 2.8 سم متحدة المركز حول مركز الطبق عن طريق الاقتراب من طرف pipet في زاوية (10 إلى 45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة الاكتشاف ، والأنابيب وصولا إلى المحطة الأولى ، ولمس agar مع قطرة السائل فقط(الشكل 1D).
    2. تجنب لمس أجار مع طرف pipet كما أنه يضر أجار. استخدام قالب الطلاء للاتساق(الرقم التكميلي S1). انتقل إلى الخطوة 2.8.
  8. استبدال أغطية طبق بيتري واضحة مع أغطية سوداء المحرز في الخطوة 1.9(الشكل 2A).
  9. ضع لوحات أجار المحتشدة على ماسح ضوئي في حاضنة محددة عند 37 درجة مئوية مع حمام مائي سعة 10 لتر للحفاظ على الرطوبة بنسبة 75٪(الشكل 1E، الشكل 2B).
    تنبيه: لا تزعج الخلايا المرقطة على لوحات أجار المحتشدة. الحفاظ على لوحات تواجه في جميع الأوقات.

3. الحصول على صورة مع الماسح الضوئي

  1. قم بتقليل الإضاءة المحيطة لأطباق بيتري عن طريق ربط النسيج الأسود غير اللامع برف 40-60 سم فوق ماسح المستندات المسطح. تأمينه باستخدام العلاقات الرمز البريدي(الشكل 2B).
  2. سيتم التحكم في الماسح الضوئي باستخدام برنامج المسح الضوئي وبرنامج البرمجة النصية التلقائي.
    1. في برنامج المسح الضوئي، حدد الوضع المنزلي (الشكل 3A). التقاط الصور بالألوان عن طريق تحديد اللون تحت نوع الصورة. لتعيين جودة الصورة، حدد جودة أخرى ضمن الوجهة وضبط الدقة إلى 300 نقطة في البوصة. الحفاظ على الحجم القياسي للصور عن طريق تحديد الأصل لحجم الهدف. اترك جميع الخيارات ضمن تعديلات الصور دون تحديد لجودة الصورة القياسية.
      ملاحظة: يتم تعيين حجم الهدف إلى الأصل بشكل افتراضي. لتحديد خيارات أخرى لحجم الهدف، انقر على المعاينة أولاً.
  3. تعيين مسار حفظ الصور عن طريق النقر على رمز المجلد إلى يمين المسح الضوئي لفتح إعدادات حفظ الملف(الشكل 3A).
    1. حدد وجهة المجلد لحفظ الصور عن طريق تحديد أخرى تحت الموقع وانقر على استعراض. اختر مجلدًا لحفظ الصور.
    2. قم بتسمية الصور في مربع نص البادئة. تعيين رقم البدء 001 لبدء تسمية تسلسل للصور. تعيين تنسيق الملف إلى JPEG عن طريق اختيار JPEG (*.jpg) للكتابة تحت تنسيق الصورة وانقر على خيارات لضبط التفاصيل. تعيين جودة تنسيق الصورة عن طريق ضبط مستوى الضغط إلى 16، الترميز إلى قياسي، والتحقق من تضمين ملف تعريف المحكمة الجنائية الدولية. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة(الشكل 3B).
    3. اترك الخيار الأول دون تحديد ("الكتابة فوق أي ملفات تحمل نفس الاسم") وتحقق من الخيارات التالية 3 ("إظهار مربع الحوار هذا قبل الفحص التالي"، و"فتح مجلد الصور بعد المسح الضوئي"، و"إظهار مربع حوار إضافة صفحة بعد المسح الضوئي"). انقر فوق موافق لإغلاق النافذة
    4. تحقق من جودة الصورة من خلال النقر على معاينة. تظهر نافذة المعاينة، ويصبح رمز الفحص وظيفيًا(الشكل 3C).
  4. استخدم برنامج البرمجة لأتمتة الحصول على الصورة. نقرات البرنامج النصي المقدمة على المسح الضوئي في إطار المسح الضوئي وموافق في إطار إعدادات حفظ الملفات في 30 دقيقة فترات.
    1. استيراد البرنامج النصي عن طريق النقر على المهمة | استيراد وتحديد كل من Single_scan.tsk و Idle_scanning.tsk (ملفات TSK المقدمة كملفات تكميلية 1 و 2). انظر الشكل 3دال.
      ملاحظة: Single_scan.tsk النقرات على زر المسح الضوئي في إطار المسح الضوئي وموافق في إطار إعدادات حفظ الملفات. Idle_scanning.tsk ينشط Single_scan.tsk كل 30 دقيقة. يمكن للمرء تغيير تردد المسح الضوئي عن طريق تغيير تنشيط Idle_scanning.tsk.
    2. تمكين المسح التلقائي على فترات 30 دقيقة عن طريق تحديد كل من المسح الخمول (المستوردة) والمسح الضوئي الفردي (المستوردة)، والنقر على الحق في المسح الخمول (المستوردة)، والنقر على اليسار على تمكين (الشكل 3D، الرقم التكميلي S2).
      ملاحظة: يعمل المسح التلقائي حتى يقوم المستخدم بإيقاف البرنامج النصي يدويًا. لإيقاف البرنامج النصي، حدد المسح الخمول (المستوردة)، انقر فوق الحق في المسح الخمول (المستوردة)، وانقر علىاليسار تمكين . ستتم إزالة علامة الاختيار.

4. تجميع الصور الفاصلالزمني وقياس سرب التنافر

  1. إجراء تحرير الأفلام وتحليل الصور باستخدام ImageJ.
  2. استيراد جميع الصور الممسوحة ضوئيا إلى ImageJ عن طريق النقر على ملف | استيراد | تسلسل الصور وتحديد الصور. في إطار خيارات التسلسل، تحقق من التحويل إلى RGB للحفاظ على الصور بالألوان. يشير عدد الصور إلى عدد الصور المحددة.
  3. حافظ على بدء الصورة عند 1 للبدء من الصورة الأولى في المجلد ومقياس الصور بنسبة 100٪ للحفاظ على الحجم الأصلي للصور. اترك استخدام المكدس الظاهري دون تحديد. انقر فوق موافق وانتظر الصور لتحميل(الشكل 4A).
  4. تعيين مستوى ضغط الفيديو إلى 100 بالنقر على تحرير | خيارات | الإدخال / الإخراج... وضبط جودة JPEG إلى 100.
  5. حفظ الملف كـ .avi بالنقر على ملف | حفظ كما | AVI. ضبط الضغط على JPEG ومعدل الإطار إلى 5 إطارا في الثانية(الشكل 4B). حفظ الفاصل الزمني .avi في المجلد المطلوب.
  6. لتحديد مسافات التنافر سرب، فتح صورة بالقرب من نهاية الفترة يحتشدون في ImageJ. انقر على ملف | فتح الصورة وتحديدها. ضبط المقياس من خلال النقر على تحليل | تعيين المقياس وتحديد المسافة بالبكسل إلى 118، والمسافة المعروفة إلى 1، ونسبة العرض إلى الارتفاع من البكسل إلى 1.0، ووحدة الطول إلى الطول(الشكل 4C). اترك العالمية دون رادع. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
  7. انقر على رمز مستقيم وقياس من وسط المستعمرة في موقف الأقمار الصناعية إلى حافة السكان يحتشدون. حدد تحليل | قياس لجعل نافذة جديدة تظهر مع القياسات (طول)(الشكل 4D).
    ملاحظة: استخدم "+" للتكبير بشكل أقرب و"-" للتصغير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تمثيل الخطوات اللازمة لنمو P. aeruginosa، والإجهاد الخلايا ، وصورة لوحات أجار يحتشدون في الشكل 1. نحن تلقيح مستعمرة واحدة من البرية من نوع P. aeruginosa UCBPP-PA14 سلالة من لوحة LB-agar في 2 مل من مرق LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ورصدت 5 ميكرولتر في وسط لوحة أجار يحتشدون. يكشف تصوير هذه اللوحة عن النمو الأولي في شكل مستعمرة في المركز ثم انتشار الأوتار شعاعياً من المستعمرة(فيديو 1). للحصول على التقييمات الجماعية للاستجابة للإجهاد ، بالإضافة إلى اكتشاف P. a...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يركز هذا البروتوكول على تقليل التباين في لوحات الاجار المحتشدة وتوفير طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة للحصول على صور الفاصل الزمني لP. aeruginosa يحتشدون ويستجيبون للإجهاد. يمكن توسيع هذا الإجراء لتصوير الأنظمة البكتيرية الأخرى عن طريق تكييف تكوين الوسائط وظروف النمو. لP. aeruginosa، على الرغم من M9 أو FAB الحد الأدنى من المتوسطة يمكن استخدامها للحث على يحتشدون16،21، البروتوكول المعروض هنا يستخدم M8 المتوسطة مع الأحماض casamino ، الجلوكوز ، وسلفات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ج.- ل.ب. كتب ونقح المخطوطة. صمم جميع المؤلفين التجارب. J.-L.B. أجرى التجارب والتحليلات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة K22AI112816 وR21AI139968 منحة لA.S. ومن قبل جامعة كاليفورنيا. ن. م. هـ-ك. تم دعمه من قبل زمالات لوندبيك R220-2016-860 و R251-2017-1070. ولم يكن للممولين أي دور في قرار تقديم العمل للنشر. ليس لدينا مصالح متنافسة لنعلنها

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كواشف < / قوي >
باكتو أجار ، مجففBD Difco214010للوحة LB-agar ولوحة أجار المحتشبة
أحماض الكازامينوBD Difco223050لوسائط الاحتشاد
D-GlucoseFisher ChemicalD16500سكر العنب. لوسائط الاحتشاد
Fosfomycin ملح ثنائي الصوديومطوكيو للصناعة الكيميائيةF0889تركيز المخزون: 200 مجم / مل. مذاب في ddH2< / sub>O
كبريتات جنتاميسينسيجما-ألدريتشG1914تركيز المخزون: 3 مجم / مل. مذاب في ddH2O
كبريتات الكاناميسينسيجما-ألدريتش60615تركيز المخزون: 100 مجم / مل. مذاب في ddH2< / sub>O
LB-MillerBD Difco244620لمرق LB وألواح LB-agar
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتسيجما ألدريتش230391لوسائط الاحتشاد
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما-ألدريتشP0662لوسائط 5x M8
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS9888لوسائط
5x M8فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي هيدراتفيشر الكيميائيةS373لوسائل الإعلام 5x M8
< قوية > سلالات < / قوية >
< م > سودوموناس زنجار < / em> مختبرSiryapornAFS27E.1 18< / sup>PA14 سلالة
DMS3virO'Toole labDMS3vir 20< / sup>العاثية
< قوي > مستلزمات < / قوي >
ورق صنفرة أكسيد الألومنيوم3M150 غرامةللأغطية السوداء
قماش أسودجوانPRD7089قماش أسود
بخاخ أسودكريلون5592 أسود غير لامعللأغطية السوداء
قارورة ErlenmeyerKimax26500250 مل
زجاجات تخزين زجاجيةPyrex13951 لتر250 مل ، 500 مل ، 1,000 مل
8 بوصات أربطة بسحابGardnerBender E173770من القماش الأسود غير اللامع
(100 مم × 15 مم)فيشرFB0875712100 مم × 15 مم ألواح البوليسترين
العصي الخشبيةفيشر23-400-102لخطوط وتلقيح البكتيريا
< قوية > معدات < / قوية>
الأوتوكلاففورج إندستريزSTM-Eلتعقيم الكواشف
25 مل ماصةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، Inc.1072-5410لسحب 20 مل لاحتشاد ألواح أجار
مزيل الرطوبةFrigidaireFAD704DWD 70 لترللحفاظ على الرطوبة النسبية للغرفة عند حوالي 45٪
ImageJNIHv1.52aبرنامج لتحليل الصور
حاضنةVWR89032-092لنمو البكتيريا عند 37 درجة ؛ C
Isotemp حمام مائيفيشر15-462-21Qلتبريد وسائل الإعلام إلى 55 درجة ؛ غطاء
التدفق الصفحيشركة بيكرSG603Aلتجفيف الألواح
P-20 ماصةجيلسونF123601اكتشاف على ألواح أجار المحتشدة وحدة
تحكم الماصةالعلامة التجاريةTechaccu-jetTo pipet 20 مل لاحتشاد ألواح أجار
أسطوانةنيو برونزويكTC-7لنمو البكتيريا عند 100 دورة في
الدقيقة الماسح الضوئيإبسونEpson Perfection V370Photo Scanner للوحات التصوير
برنامج أتمتة الماسحالضوئي RoboTask Litev7.0.1.932للتصوير الداخلي لمدة 30 دقيقة
برنامج الحصول على صور الماسحالضوئي برنامج إبسونv9.9.2.5USللوحات التصوير
طلاء لربط أطباق بتري ألواح سوق C

المراجع

  1. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  2. Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
  3. Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
  4. Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  5. Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
  6. Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
  7. Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
  8. Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
  9. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  10. Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698(2015).
  11. Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
  12. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  13. Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
  14. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).
  15. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
  16. Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  17. Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
  18. Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
  19. van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
  20. Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
  21. Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888(2011).
  22. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
  23. Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).
  24. Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Pseudomonas aeruginosa ImageJ AVI
تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.