ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) يوفر إمكانية تشريح البرامج التنموية مع الحد الأدنى من معالجة الأعضاء والأنسجة. ينتج البروتوكول عن الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا المستهدفة ببروتين فلورسنت أخضر (GFP) يسمى وحدة فرعية من الريبوزيوم. تكشف أدوات التحليل المصب، مثل qRT-PCR أو RNA-seq، عن ملفات تعريف التعبير الخاصة بنوع الأنسجة والخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذه المقالة، نعطي تعليمات عملية للحصول على بيانات الترجمة من أنواع مختلفة من الخلايا الجذرية العربية dopsis thaliana عبر ترجمة التنقية تقارب الريبوسر (TRAP) ومتتالية الأمثل إعداد مكتبة منخفضة الإدخال.
كمادة البدء، ونحن توظيف خطوط النبات التي تعبر عن GFP الموسومة بروتين riبومRPL18 بطريقة محددة نوع الخلية عن طريق استخدام المروجين كافية. قبل المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي ، يتم تجميد الأنسجة ، مما يحافظ على سلامة الأنسجة ويسمح في الوقت نفسه بتنفيذ دراسات السلسلة الزمنية بدقة زمنية عالية. وتجدر الإشارة إلى أن هياكل جدار الخلية لا تزال سليمة، وهو عيب رئيسي في الإجراءات البديلة مثل الأساليب القائمة على فرز الخلايا المنشطة للفلورسينس والتي تعتمد على الأنسجة المصممة لعزل مجموعات الخلايا المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يلزم تثبيت الأنسجة كما هو الحال في تقنيات التقاط الميكروديزالقسمة بالليزر ، والتي تسمح بالحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة.
ومع ذلك، فإن أخذ العينات من المجموعات الفرعية للخلايا وعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالبوليبعض فقط يحد بشدة من غلة الحمض النووي الريبي. ولذلك، من الضروري تطبيق أساليب إعداد المكتبة الحساسة بما فيه الكفاية من أجل الحصول الناجح على البيانات من قبل RNA-seq.
يقدم TRAP أداة مثالية لأبحاث النبات حيث أن العديد من العمليات التنموية تنطوي على مسارات إشارات ميكانيكية ذات صلة بجدار الخلية. استخدام المروجين لاستهداف مجموعات محددة من الخلايا هو سد الفجوة بين الجهاز ومستوى الخلية الواحدة التي تعاني بدورها من دقة قليلة أو تكاليف عالية جدا. هنا، نطبق TRAP لدراسة الاتصالات الخلية الخلية في تشكيل الجذر الجانبي.
المقدمة
وبدافع من التطبيق المتزايد لتقنيات التسلسل من الجيل التالي، يمكن زيادة الاستبانة المكانية في البيولوجيا الإنمائية. تهدف الدراسات المعاصرة إلى تشريح الأنسجة وصولاً إلى أنواع الخلايا المتخصصة، إن لم يكن بخلية واحدة المستوى1،,2،,3،,4. ولتحقيق هذه الغاية، تم ابتكار عدد كبير من الطرق المختلفة على مدى السنوات الخمسين الماضية (انظر الشكل 1A)5،6،7،8،9،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1- استنساخ الجين المتحول وإنتاج الخطوط المحورة وراثياً والاختيار
- استنساخ المروج من الاختيار في ناقلات الإدخال المناسبة. استخدام طريقة الاستنساخ المستندة إلى إعادة الجمع(جدول المواد)وإعادة دمج المروجين في pDONRP4-P1r. استنساخ RPL18 (مع علامة تقارب أو بروتين الفلورسنت من اختيار) باستخدام الاستنساخ القائم على إعادة التركيب في pDONRP1-P249.
- الجمع بين ناقلات الدخول التي تحتوي على RPL18 مع ناقل الإدخال المحتوي على المروج في رد فعل إعادة تركيبة جزء اثنين في متجه الوجهة المناسبة مع كاسيت الاختيار السريع الأحمر50 لتسهيل الاختيار المباشر للبذور المعدلة وراثيا.
- التحقق من المتج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ولتقييم الجودة، ينبغي بحث الإجراء المذكور أعلاه في عدة خطوات وسيطة: التحقق من صحة نمط التعبير في بلانتا، ومراقبة جودة الحمض النووي الريبي المتعدد الخصائص المعزول، فضلا عن المكتبات النهائية. يمكن إجراء qRT-PCR باستخدام جينات علامة معروفة ، بالإضافة إلى ذلك ، لتأكيد الاستجابة لحالة العلاج أو لضبط الظروف التجريبية.
تحليل بؤري لتوزيع إشارة GFP
للتحقق من كل من أنماط التعبير endodermal و XPP ، قمنا بتحليل خطوط متجا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التحقق من نمط تعريب RPL18
حاسمة لتجنب سوء تفسير البيانات من أي تجربة TRAP هو نمط التعبير السليم للوحدة الفرعية riبومال الموسومة. لذلك ، فإن دمج GFP كعلامة epitope إلى RPL18 يسمح بأناقة كبيرة بالتحقق من نمط التعبير المطلوب وعلى التوالي ، والسحب من الكسر المتعدد الأجزاء من نفس الأنسجة. يتبع جياو ومايرويتز 2010 النهج الأكثر توغلًا لضمان أنماط المروج المناسبة ، مما يتطلب تلطيخ GUS وفي Tian et al. 2019 الذي يعتمد على المناعة مع الأجسام المضادة المضادة للراية58،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر جان كلود والسر من مركز التنوع الوراثي في زيوريخ على مشورة الخبراء الحاسمة في المرحلة المبكرة من هذا المشروع. تم دعم العمل في مختبر فيرمير من خلال منحة الأستاذية SNF (PP00P3_157524) ومنحة معدات R'EQUIP (316030_164086) من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF) الممنوحة لـ JEMV.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > تعقيم < / قوي > | |||
| مبيض ، 13٪ | Sigma | 71696 | |
| دورق | VWR | 214-1172 / 74 / 75 | |
| مجفف مع صفيحة بورسلين (DURAN) | سيجما / ميرك | Z317454-1EA / Z317594-1EA | |
| EtOH ، p.a. | هانيويل | 02860-1 لتر | |
| حمض الهيدروكلوريك ، 37٪ | روث | 4625.1 | |
| توين 20 | سيجما | P9416 | |
| <قوي > نمو الصفيحة + حصاد < / أملاح قوية > | |||
| MS ، خليط الملح القاعدي ، بما في ذلك MES عازلة | Duchefa | M0254 | |
| مصنع أجار لزراعة الخلايا | Applicem / Panreac | A2111.1000 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| forcepts | Rubis Switzerland | 5-SA موديل | |
| KOH | Fluka | 60370 | |
| شريط ميكرو / جراحي | 3M | 1530-0 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| أطباق بتري 120x120 مم | مشرط | ||
| أنسجة VWR / Swann-Morton | 233-5454 | ||
| ، محايدة ، ذات طبقتين | أي مورد من | ||
| اختيارك <قوي > Immunoprecipitation < / قوي > | |||
| GFP الخرز: gtma-100 GFP-Trap_MA | Chromotek | على سبيل المثال gtma-100 | |
| Brij-35 | Sigma | P1254-500G | |
| أنابيب الطرد المركزي (وفقا ل أجهزة الطرد المركزي) | Beckman Coulter | 357001 | |
| Chloramphenicol | Applichem | C0378-25G | |
| قفازات قطنية | VWR | 113-7355 | |
| Cycloheximide ، HPLC grade | Sigma | 01810-1G | |
| DEPC | VWR | E174 | قد يكون لها أوقات تسليم طويلة |
| DTT | Fluka | 43815 | |
| EGTA | Sigma | 3054.3 | |
| DUALL 23 | KONTES GLASS CO (عبر VWR) | SCERSP885450-0023 (مجموعة) | SCERSP885451-0023 مدقة فقط - أسطوانة SCERSP885452-0023 فقط ؛ أوقات التسليم الطويلة |
| Igepal CA-360 | Sigma | I3021-100ml | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| MgCl2< / sub> hexahydrat | Roth | 2189.2 | |
| الملاط والمدقة | VWR | 470148-960 & 470019-978 | |
| PMSF | Roche | 10 837 091 001 | |
| بولي أوكسي إيثيلين-(10) -ثلاثي يديسيل / PTE | Sigma | P2393-500G | |
| RNase المياه الخالية | من Roth | T143.3 | |
| RNAZap | Thermo Fisher | AM9780 / AM9782 | لتنظيف الأسطح تريس |
| ، >99.3٪ | روث | AE15.3 | |
| تريتون X-100 | فلوكا | T8787-250 مل | |
| توين 20 | سيجما | P9416-100 مل | |
| < قوي > استخراج الحمض النووي الريبي < / قوي > | |||
| 2-بروبانول ، p.a. | سيجما | 33539-1L-GL-R | |
| الكلوروفورم ، HPLC الصف | Scharlau | CL02181000 | |
| EtOH ، p.a. | منخفضة الاحتباس من هانيويل | 02860-1 | |
| لتر ، 1.5 مل | Eppendorf / Sigma | Z666548-250EA | LoBind |
| RNase خالية من DNase | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| كاشف TRIzol | ThermoFisher / Ambion | 15596018 | |
| إعداد المكتبة< / قوي> | |||
| 15/50 مل أنبوب فاصل مغناطيسي | Abraxis | PN 472250 | |
| أمبير الخرز | بيكمان كولتر | A63881 | |
| طقم الفهرس A | Illumina | FC-131-2001 | |
| الفهرس D | Illumina | FC-131-2004 | |
| مغناطيس النيوديميوم | أمازون / نطاق | 6 × 1.5 مم آخر: N42 (NdFeB) | |
| مجموعة Nextera XT | Illumina | FC-131-1024 / 1096 | https://emea.support.illumina.com/< / a> |
| PCR شرائط | ThermoScientific | AB-0266 | |
| SMARTer v4 طقم | Takara Bioscience | 634892 | https://www.takarabio.com/< / a> |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument المعدات | المتخصصة لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي / الحمض |
| النووي Tapestation | Agilent | 4200 Tapestation | Instrument المعدات المتخصصة لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي / الحمض النووي |
| محلل الشظايا | Agilent | 5400 نظام محلل الشظايا | معدات متخصصة لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي / الحمض النووي (إنتاجية عالية) |
| LabChip | PerkinElmer | LabChip GX Touch Nucleic Accessr | معدات متخصصة لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي / الحمض النووي (إنتاجية عالية) |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher | Q33239 < / a> | معدات متخصصة لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي / الحمض |
| النووي < قوي>qRT-PCR< / قوي> | |||
| GATA23 | microsynth | fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC | |
| GH3.3 | Microsynth | fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT | |
| LBD29 | Microsynth | fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA | |
| UBC21 | Microsynth | fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT ؛ rev: TCATCCTTTCT AGGCATAGCG | |
| Sso Advanced Universal SYBR Green | Bio-Rad | # 172-5270 | |
| iScript Adv cDNA Kit | Bio-Rad | # 172-5038 | |
| < قوي > متنوعات < / قوي > | |||
| أنابيب فالكون 15 مل ، سيلستار | جرينر بيو ون | 188261 | |
| أنابيب فالكون 50 مل ، سيلستار | جراينر | 210261 | |
| 1 مل | نصائح مرشح Axygen | TF-1000-R-S | |
| 10 & micro ؛ ل | نصائح مرشح Axygen | TF-10-R-S | |
| 100 & micro ؛ ل | نصائح مرشح Axygen | TF-100-R-S | |
| 20 & micro ؛ ل | نصائح مرشح Axygen | TF-20-R-S | |
| 200 & micro ؛ ل | الدقيقة Axygen | TF-200-R-S | |
| 1.5 مل | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| بروبيديوم يوديد | سيجما | P4170-100MG | |
| شركة التسلسل | Novogene | en.novogene.com< / أ> |
المراجع
- Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
- Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
