الهدف العام للبروتوكول هو إعداد أكثر من مليون من قطرات femtoliter أمر، موحدة ومستقرة ومتناسقة بيولوجيا على الركيزة 1 سم2 2 من الألواح التي يمكن استخدامها تخليق البروتين خالية من الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
A مجموعة القطيفة Femtoliter تخليق البروتين موازية على نطاق واسع من جزيئات الحمض النووي واحد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إن التقدم في التحليل المكاني وحساسية الكشف عن الأجهزة العلمية يجعل من الممكن تطبيق مفاعلات صغيرة في البحوث البيولوجية والكيميائية. لتلبية الطلب على ردود الفعل الدقيقة عالية الأداء، قمنا بتطوير مجموعة قطرات femtoliter (FemDA) الجهاز وتجسد تطبيقه في توليف البروتين خالية من الخلايا موازية على نطاق واسع (CFPS) التفاعلات. تم توليد أكثر من مليون قطرة موحدة بسهولة داخل منطقة بحجم الإصبع باستخدام بروتوكول ختم النفط من خطوتين. كانت كل قطرة راسية في غرفة صغيرة femtoliter تتألف من قاع هيدروفيلي وجانبية مبيدة للماء. الهيكل الهجين الهيدروفيلي في الرهاب المائي وزيوت الختم المخصصة والمواد الراكعة على السطح أمر حاسم للإبقاء بشكل ثابت على محلول الفاتوليتر المائي في الفضاء الفاتوليتر دون فقدان التبخر. تكوين femtoliter وهيكل بسيط من الجهاز FemDA سمح الحد الأدنى من استهلاك الكاشف. وقد جعل البعد الموحد للمفاعلات القطيرة قياسات كمية ومدى زمني واسع النطاق مقنعة وموثوقة. تكنولوجيا FemDA ربطت العائد البروتيني لرد فعل CFPS مع عدد جزيئات الحمض النووي في كل قطرة. قمنا بتبسيط الإجراءات المتعلقة بالتكبير الدقيق للجهاز ، وتشكيل قطرات femtoliter ، واكتساب وتحليل بيانات الصورة المجهرية. البروتوكول التفصيلي مع التكلفة المنخفضة الأمثل التشغيل يجعل التكنولوجيا FemDA في متناول الجميع الذين لديها مرافق غرف نظيفة القياسية والمجهر الفلورانس التقليدية في مكانها الخاص.
المقدمة
يستخدم الباحثون مفاعلات لتنفيذ التفاعلات البيولوجية/الكيميائية. وهناك جهود كبيرة بذلت لتخفيض حجم المفاعل وزيادة الإنتاجية التجريبية من أجل خفض استهلاك الكاشف مع تحسين كفاءة العمل. ويهدف كلا الجانبين إلى تحرير الباحثين من عبء العمل الثقيل، وخفض التكلفة وتسريع البحث والتطوير. لدينا خارطة طريق تاريخية واضحة حول تطوير تكنولوجيات المفاعل من وجهة نظر حجم رد الفعل والإنتاجية: قارور واحدة / قارورة / أنابيب الاختبار ، أنابيب المليلتر، أنابيب ميكروليتر، شرائط ميكروليتر 8 أنبوب، ميكرولتر 96/384/1536-well لوحة، وmicrofluidic nanoliter/picoliter/femtoliter مفاعلات1،,2،,3،,
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. Microfabrication من الركيزة الصفائف microchamber femtoliter
ملاحظة: إجراء تجربة microfabrication التالية في غرفة تنظيف. ارتداء القفازات وبدلة غرفة نظيفة قبل دخول غرفة التنظيف.
- تنظيف غطاء الزجاج الركيزة
- تعيين غطاء الزجاج على غطاء الزجاج تلطيخ رف. سونيكات الزجاج غطاء في 8 M هيدروكسيد الصوديوم (NAOH) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
تنبيه: إن Naة الصوديوم في تركيزات عالية أمر خطير للغاية على الجلد والعين. التعامل بلطف دون أي دفقة. - أخرج الحامل من محلول NaOH وشطف زجاج الغطاء باستخدام الماء لمدة عشر مرات. إبقاء غطاء الزجاج في الماء النقي.
ملاحظة: تخلص من النفايات القلوية إلى الخزان المعين. ويمكن إعادة....
- تعيين غطاء الزجاج على غطاء الزجاج تلطيخ رف. سونيكات الزجاج غطاء في 8 M هيدروكسيد الصوديوم (NAOH) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تتكون عملية microfabrication من تنظيف الركيزة ، وظيفية السطح ، طلاء CYTOP ، التصوير الضوئي ، النقش الجاف ، تجريد ضوئي ، والتنظيف النهائي. الأهم من ذلك، سمح البروتوكول المقدم إزالة كاملة من البوليمر CYTOP المياه داخل microchambers الشكل 3A)،وإنتاج هيكل موهب ماء في ماء على الركيزة الزجاجية غطاء القياسية. بمساعدة بروتوكول ختم النفط ، تم التحقق من البعد الموحد للقطرات الناتجة عن ذلك عن طريق تغليف محلول الفلورسنت في الزخرق الصغير (الشكل 3B). كثافة الفلوريسنس المستخرج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن القياس الكمي للغاية القائم على قطرات موحدة ومستقرة وعالية الاتساق في FemDA، مكّن التوزيع المنفصل، وهي السمة الفريدة لدراستنا التي تختلف عن غيرها. نحن بشكل منهجي الأمثل ومفصلة microfabrication و عمليات تكوين قطرات في هذه الورقة. 10- هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول القائم.
أولا ، طلاء موحد من البوليمر CYTOP لزجة للغاية على الركيزة الزجاج رقيقة مستطيلة يحدد إلى حد كبير نوعية الركيزة الناتجة. ونظرا لمسافة العمل قصيرة عموما من عدسة الهدف مع التكبير عالية (انظر الخطوة 6.1)، يجب استخدام الزجاج .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل رقم منحة JSPS KAKENHI JP18K14260 وميزانية الوكالة اليابانية لعلوم وتكنولوجيا البحار والأرض. نشكر شيجيرو ديغوتشي (JAMSTEC) وتيتسورو إيكوتا (JAMSTEC) على توفير مرافق التوصيف. نشكر كين تاكاي (JAMSTEC) على دعم البرمجيات التجارية. أجريت عملية القياس الدقيقة في Takeda Sentanchi Supercleanroom، جامعة طوكيو، بدعم من "برنامج منصة تكنولوجيا النانو" التابع لوزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT)، اليابان، رقم المنحة JPMXP09F19UT087.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان | سيجما ألدريتش | 440140 | |
| 1 مل حقنة | تيرومو | SS-01T | |
| 2-بروبانول | كانتو كيميكال | EL الصف | EL: للاستخدام الإلكتروني. |
| مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر ثلاثي الأبعاد | Lasertec | OPTELICS HYBRID | مجاهر أخرى مماثلة (على سبيل المثال ، Keyence VK-X1000 و Olympus LEXT OLS5000) قابلة للتطبيق أيضا. |
| حقنة 50 مل | Terumo | SS-50LZ | |
| 6،8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | قم بإعداد محلول مخزون 5 ملي في ثنائي ميثيل سلفوكسيد |
| الأسيتون | كانتو الكيميائية | EL الصف | EL: للاستخدام الإلكتروني. نقاء 99.8٪. |
| منفاخ الهواء | Hozan | Z-263 | |
| كتلة الألومنيوم | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| أنابيب دقيقة من الألومنيوم | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (عينة اختبار) | قد تتوفر عينة اختبار مجانية عند الاستفسار عن AGC. |
| BEMCOT PS-2 ممسحة | Ozu | 028208 | |
| خزعة لكمة مع مكبس | Kai | BPP-10F | |
| غطاء زجاج | ماتسونامي | زجاج رقم 1 (24 مم ومرات ؛ 32 مم ، سمك 0.13 ~ 0.17 مم) | حسب الطلب. |
| غطاء رف تلطيخ زجاجي | ناكاياما | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe ممسحة نظيفة | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| حصيرة القطع | Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| خلاط إزالة الهواء | Thinky | AR-100 | |
| قاطع سطح المكتب | Roland | STIKA SV-8 | |
| على شركة Merck للمطورين | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials قد يكون المطورون القلويون الآخرون قابلين للتطبيق أيضا ولكن يجب أن يتطلبوا تحسين ظروف التطوير (الوقت ودرجة الحرارة وما إلى ذلك) |
| شريط فيلم كابتون لاصق مزدوج المغلفة | Teraoka Seisakusho | 7602 # 25 | |
| الإيثانول | كانتو الكيميائية | EL الصف | EL: للاستخدام الإلكتروني. نقاء 99.5٪. |
| فيجي | : ImageJ 1.51n | ||
| قاطع الكابلات المسطحة | طوكيو-IDEAL | MT-0100 | |
| زيت Fomblin | Solvay | Y25 ، أو Y25 / 6 | قد تكون عينة الاختبار المجانية متاحة عند الاستفسار عن Solvay. Fomblin Y25 / 6 هو بديل إذا لم يكن Y25 متاحا بسهولة. |
| الصفيحة الساخنة | كإبرة | TH-900 | |
| Terumo | NN-2270C | 22G & Times ؛ 70 مم | |
| مجهر مضان مقلوب | مواصفات نيكون | Eclipse Ti-E | Epifluorescence ، كاميرا CCD أو sCMOS ، المرحلة الآلية ، نظام التركيز التلقائي ، وعدسة موضوعية NA العالية. |
| KaleidaGraph | Synergy | : 4.5 | |
| محاذاة القناع | SUSS | MA-6 | أيضا تطبيق محاذاة القناع الأخرى طالما أن وضع التلامس بالفراغ متاح. |
| ماصة ميكرومان | جيلسون | E M250E | طرف المكبس الشعري: CP250 |
| Microsoft Excel | إصدار Microsoft | : 16.16.15 | |
| غرفة فراغ صغيرة | كواحد | MVP-100MV | |
| ماء خال من Nuclease | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| أنبوب PCR | NIPPON Genetics | FG-021D / SP | |
| طبق بتري | بقطر | GD90-15 | 90 مم ، ارتفاع 15 مم. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials من قبل Merck. AZ P4620 هو بديل. |
| قارئ الألواح | BioTek | POWERSCAN HT | |
| قفازات البولي إيثلين | AS ONE | 6-896-02 | الاسم التجاري: Saniment. |
| مجموعة تخليق البروتين PURExpress في المختبر | New England Biolabs | E6800S أو E6800L | لتفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا. |
| نظام النقش الأيوني التفاعلي | Samco | RIE-10NR | RIE الأخرى قابلة للتطبيق أيضا ولكن يجب أن تتطلب تحسينا لظروف RIE (معدل تدفق الغاز ، وضغط الغرفة ، وطاقة التردد اللاسلكي ، ووقت النقش ، وما إلى ذلك) |
| مثبط RNase | New England Biolabs | M0314S | |
| شريط سكوتش | 3M | 810-1-18D | |
| محلول هيدروكسيد الصوديوم | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | تركيز 8 M ؛ خطر. |
| تدور المغطي | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 السطحي | AGC | (عينة الاختبار) | قد تكون عينة الاختبار المجانية متاحة عند الاستفسار عن AGC. |
| SYLGARD 184 سيليكون المطاط | Dow | Sylgard184 | التركيب الكيميائي: بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان. نسبة الخلط الافتراضية هي القاعدة: عامل المعالجة = 10: 1 (م / م). |
| ملاقط | مثالية تيك | 2WF. SA.1 2A | |
| منظف بالموجات فوق الصوتية | كواحد | ASU-2M | |
| فراغ تشاك | أوشيجان | (حسب الطلب) | المواد: delrin ؛ مرحلة عينة مستطيلة مع ثقوب متعددة (48 ثقوب ، كل منها بقطر 1 مم) ؛ يتم تخصيص الحجم ليناسب حجم زجاج الغطاء (24 مم ومرات ؛ 32 مم). |
المراجع
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
