نموذج مناعي لزرع خلايا القلب الهيترولوجي وخلايا عضلة القلب في الفئران

ملخص

نحن نصف نموذجًا لزراعة قلب البطن غير المعوثي في الفئران ، مما يعني تعديلات على الاستراتيجيات الحالية ، مما يؤدي إلى نهج جراحي مبسط. بالإضافة إلى ذلك، نحن نصف نموذج الرفض الجديد عن طريق الحقن داخل الأذن لخلايا عضلة القلب الحيوية، مما يسمح بإجراء المزيد من التحليلات المناعية لعملية زرع في الفئران.

الملخص

كانت زراعة القلب الهيتروبية في الفئران نموذجًا شائعالاستخدام للدراسات المناعية المتنوعة لأكثر من 50 عامًا. وقد أُبلغ عن عدة تعديلات منذ الوصف الأول في عام 1964. بعد 30 عامًا من إجراء زراعة القلب الغيرية في الفئران ، طورنا نهجًا جراحيًا مبسطًا ، والذي يمكن تعليمه وإجراؤه بسهولة دون مزيد من التدريب الجراحي أو الخلفية.

After dissection of the ascending aorta and the pulmonary artery and ligation of superior and inferior caval and pulmonary veins, the donor heart is harvested and subsequently perfused with ice-cold saline solution supplemented with heparin. بعد لقط وتقنين الأوعية البطن المتلقية، المتبرع يصعد الشريان الأورطا والشريان الرئوي هي anastomosed إلى الشريان الأورطا البطن المتلقي والوريد الوريد افينا السفلي، على التوالي، وذلك باستخدام غرز الجري المستمر.

اعتمادا على مجموعات مختلفة بين المانحين والمتلقي، يسمح هذا النموذج بتحليل الرفض الحاد أو المزمن للالوجرافات. ومما يعزز الأهمية المناعية لهذا النموذج من خلال نهج جديد من حقن داخل الأذن من خلايا عضلة القلب الحيوية والتحليل اللاحق لاستنزاف الأنسجة اللمفاوية عنق الرحم.

المقدمة

زرع القلب الهيتروتوبي هو نموذج تجريبي يستخدم بشكل متكرر للتحقيقات المختلفة المتعلقة بتحمل زراعة الأعضاء ، ورفض allograft الحاد والمزمن ، وإصابة نقص التروية وإعادة التروية ، وتضخم الآلة أو إعادة عرض القلب. من بين مزايا أخرى ، يمكن مراقبة وظيفة الكسب غير المشروع بشكل غير جراحي عن طريق الجس والفشل في الكسب غير المشروع لا يؤدي إلى ضعف حيوي للمتلقي على النقيض من الأعضاء الأخرى ، مثل الكلى أو الكبد.

في عام 1964، وصف أبوت وآخرون في البداية زرع قلب البطن التغايري في الفئران¹. في وقت لاحق، في عام 1966، وصفت تقنية من طرف إلى طرف لanastomoses من قبل توميتا وآخرون^2. تم الإبلاغ عن الأساس للنموذج المستخدم حاليا من قبل اونو وليندسي في عام 1969³. خلال العقود الماضية، تم نشر العديد من التعديلات لإنشاء أنواع مختلفة من الطعوم القلب البطيني تفريغ، محملة جزئيا أو محملة بما في ذلك الجمع بين غير النوبة زرع القلب والرئة^4،5،6. بالنسبة للتحليلات المناعية، يتم إجراء زراعة ترقيع القلب غير المحملة بالحجم الأكثر شيوعًا. في هذه الحالة، تدفق الدم يدخل إلى الوراء الشريان الأورطا الصاعد المانحة وبالتالي الشرايين التاجية. يحدث الصرف الوريدي على طول الجيوب الأنفية التاجية في الأذين الأيمن والبطين(الشكل 1A-B). لذلك ، يتم استبعاد البطين الأيسر من تدفق الدم ، بصرف النظر عن الكميات الهامشية من الدم من الأوردة البسية. وهذا أيضا يجعل من نموذج مفيد لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية خلال البطين الأيسر مساعدة الجهاز العلاج⁷.

وقد أجريت زراعة القلب الهيتروبية في أنواع مختلفة بما في ذلك الفئران والأرانب والخنازير وحتى تم استخدامها كجهاز مساعدة أحادي أو ثنائي في البشر^8,9,10,11. لا يزال الجرذ يمثل الحيوان التجريبي الشعبي لنماذج زراعة الأعضاء ، خاصة وأن أوقات البقاء على قيد الحياة للكسب غير المشروع لتركيبات سلالات الفئران المختلفة كانت محددة بشكل جيد في الماضي وعدد كبير من الكواشف المناعية يمكن الوصول إليها^12،13. على عكس الفئران ، الفئران هي أكبر مما يجعل الجراحة والوصول إلى الأنسجة اللمفاوية للتحليلات المناعية أكثر جدوى^12. وعلاوة على ذلك، فإن إدخال تكنولوجيات الاستنساخ التجاري في الفئران في السنوات الأخيرة سيؤدي على الأرجح إلى الاهتمام المتكرر بنماذج الفئران التجريبية^14.

بشكل عام ، يمكن توصيل طعوم القلب الغيرية بالأوعية المتلقية إما عن طريق إجراء انستوموز عنق الرحم أو البطن. ومع ذلك، تشير بعض الدراسات إلى أن الأناستوموسيس الفخذي يسهل تحسين الرصد بسبب الوصول الأفضل للملامسة اليدوية أو تخطيط صدى القلب وإعادة النظر في الصدى، وبالتالي يسمح بالكشف بشكل أكثر دقة عن فشل الكسب غير المشروع^15،16.

وقد ثبت أنه لا يوجد فرق فيما يتعلق بوقت العملية ومعدل المضاعفات والنتيجة ووقت البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع بين كل من تقنيات anastomosis^17. ومن الواضح أن توافر عدد كاف من الغدد الليمفاوية المستنزفة يجب أن يذكر كفائدة من الانسطوموسات العنقية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فترات تدريب أطول. في المقابل ، فإن أنسح البطن أقل تعقيدًا وقيمة بنفس القدر للتحقيقات المناعية ، خاصة عندما يقترن بنتائج طريقة جديدة لحقن خلايا عضلة القلب المتعددة الألياف واستئصال الغدد الليمفاوية اللاحقة في عنق الرحم. مزيج من كلا النموذجين يقدم مجموعة واسعة من التحليلات المناعية بعد التدخل.

البروتوكول التالي يشير إلى التشغيل في أزواج من الجراحين من أجل تقليل وقت نقص التروية. ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب من قبل شخص واحد. يتم عرض إعداد الأدوات والمواد لزراعة القلب وزرع في الشكل 2A-B.

البروتوكول

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس المحلي لاستعراض الحيوانات الأخلاقية التابع للسلطات الإقليمية لحماية المستهلك وسلامة الأغذية في ساكسونيا السفلى (LAVES، أولدنبورغ، ألمانيا) بالموافقة على الـ IDs 12/0768 و 17/2472.

1. القلب explantation والتسريب

ملاحظة: كما المتبرعين الكسب غير المشروع، تم استخدام الفئران الإناث أو الذكور في سن 7-22 أسابيع.

1. قم بإضفاء التّزّرعلى الجرذ انثّيب التّرّجّر باستنشاق الإيزوفران (الحث بنسبة 5% والصيانة بنسبة 3% مع تدفق O₂ من 1 لتر/دقيقة). حقن 5 ملغ من Carprofen تحت الجلد لكل كيلوغرام من وزن الجسم للمسكن اتى الجراحة والتحقق من عدم وجود إصبع القدم قرصة سحب منعكس.
2. تطبيق زيوت التشحيم العين وإزالة الفراء البطن والصدر باستخدام مقص الميكانيكية.
3. ضع المتبرع في وضع ية، وأصلح الأطراف في قاعدة طاولة العملية بأربطة مرنة وتعقيم الجلد بالإيثانول بنسبة 70% أو بديل كاف ٍ آخر.
4. تُقسّس الجلد في اتجاه طولي وبعد تطبيق مخدر موضعي (على سبيل المثال، الليدوكائين 0.2%) إجراء عملية التنظير الوسيط باستخدام مقص.
5. إدراج المنقات، وتعبئة الأمعاء إلى يسار المتبرع، وفضح الوريد الوريد السفلي مع مسحات القطن المعقم.
6. لتخثر, حقن 500 وحدة دولية من الهيبارين حل في 1 مل من الجليد الباردة حل الخط اللاي متساوي التوتر عن طريق الوريد عن طريق ثقب الوريد الوريد الوريد السفلي فينا. وقف النزيف في موقع ثقب عن طريق ضغط الضوء مع مسحة القطن بعد التراجع عن الإبرة(الشكل 3A).
7. يُقنع الحجاب الحاجز ويُجري استئصال الصدر الجانبي على جانبي المتبرع.
8. دبوس الجدار البطني المعبأة من الصدر على طاولة العملية.
9. إزالة التاموروكارديوم والعصب المبهم عن طريق إعداد صريح باستخدام اثنين من أصحاب إبرة صغيرة.
10. إجراء استئصال الأوعية البطنية من أجل exsanguinate المتبرع وتفريغ القلب.
11. إدراج فرع صريح من مقص مدببة التحقيق في الجيوب الأنفية عبر الأقراص ويفصل الشريان الأورطا التصاعدي والشريان الرئوي كما distal ممكن تحت الجر السمرة الخفيفة للقلب مع ضغط الرطب(الشكل 3B).
12. Place a single 5-0 ligature around the superior and inferior vena cava and the pulmonary veins and tighten it as dorsal as possible (Figure 3C).
13. قطع الأنسجة الظهرية إلى الرباط واستخراج القلب(الشكل 3D).
14. perfuse القلب مبشور مع قنية 18 G من القسطرة الوريدية من خلال الشريان الأورطي التصاعدي والشريان الرئوي مع 30 مل من الجليد الباردة، حل محلول محلول الأيزون اتلاني تكملها 1000 وحدة دولية من الهيبارين ووضع القلب في أنبوب 15 مل مليئة محلول المالحة على الجليد(الشكل 3E-F).

2. زرع القلب

ملاحظة: كمستلمين، تم استخدام الفئران الأنثوية أو الذكور القديمة من 10-14 أسبوعًا. وكان وزن المانحين والمتلقين تقريبا.

1. إجراء التخدير من الفئران المتلقي باستخدام استنشاق الايفلوران أيضا (التعريفي في 5٪ والصيانة في 1.5-2٪ مع تدفق O₂ من 1 لتر / دقيقة). حقن 5 ملغ من Carprofen تحت الجلد لكل كيلوغرام من وزن الجسم للمسكن اتى الجراحة والتحقق من عدم وجود إصبع القدم قرصة سحب منعكس.
2. تطبيق زيوت التشحيم العين، وإزالة الفراء في البطن، وإصلاح الأطراف وتعقيم الجلد على نحو مماثل لإعداد المانحة. للحصول على النتيجة المثلى بعد الجراحة، قم بإجراء العملية على حصيرة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم داخل العملية.
3. بعد الشق الطولي للجلد، ضعي مخدرًا موضعيًا، مثل الليدوكائين (0.2%)، على اللفافة البطنية. فتح تجويف البطن عن طريق عملية اللاباتورات الوسطى وإدراج المنقات.
4. تعبئة الأمعاء إلى الجانب الأيسر العلوي من المتلقي ووضعها في ضغط دافئ ومبلل.
5. بعد تعبئة الاثني عشر وjejunum القريبة ، على التوالي ، وذلك باستخدام المجهر الجراحي (أو النظارات المكبرة) مع التكبير 5-7x ، وفضح الأبهر البطني والوريد السفلي عن طريق إعداد صريح مع مسحات القطن. لا تفصل الأوعية البطنية.
6. رفع الأوعية البطن باستخدام اثنين من أصحاب إبرة صغيرة دون إصابة الأوردة القطنية ووضع المشبك كولى الأوعية الدموية(الشكل 4A).
7. ثقب الأوعية البطنية مع 30-45 درجة مقوسة 27 غ قنية(الشكل 4B).
8. تكبير موقع ثقب باستخدام مقص بوتس لإنشاء شق طولي يطابق حجم تجويف الأوعية المانحة(الشكل 4C-D)وperfuse الأوعية المتلقية مع محلول المالحة من أجل إزالة الجلطات ومنع تجلط الدم بعد العملية الجراحية.
9. وضع الكسب غير المشروع في الجلوس ومثبت المانح يصعد أورتا إلى أورتا البطن المتلقي من قبل اثنين من غرز بسيطة توقف (8-0 monofilament غير resorbable خياطة) في الزاوية القحفية وcaudal من شق طولي(الشكل 4E).
10. Anastomose أورتا الصاعد للمتبرع مع أبهر البطن من المتلقي عن طريق تشغيل 8-0 خيوط monofilament في خطوتين: أولا، وضع الكسب غير المشروع على يمين الأوعية المتلقية وأداء النصف الأول من anastomosis(الشكل 4E). في وقت لاحق ، ضع الكسب غير المشروع على يسار الأوعية المتلقية وقم بالنصف الثاني من الانستوموس(الشكل 4F).
11. تثبيت الشريان الرئوي المتبرع إلى الوريد الوريد البطني السفلي على نحو مماثل لanastomosis الشريان الأبهري (8-0 monofilament غير resorbable خياطة). خياطة النصف الأول من الانستوموموسيس ووينوس من الجانب intraluminal من السفينة(الشكل 4G-H).
12. تدفق anastomoses مع المالحة مباشرة قبل تشديد عقدة لمنع الانسداد المحيطي.
13. وضع شاش hemostatic حول كل من anastomoses والإفراج بعناية المشبك كولى الأوعية الدموية بحيث يمكن أن تبدأ reperfusion من الكسب غير المشروع. التعامل مع نزيف على طول anastomoses عن طريق ضغط الضوء مع مسحات القطن المعقم.
    ملاحظة: يجب أن يبدأ الكسب غير المشروع في الضرب بعد حوالي 60 s.
14. استبدال الأمعاء في meander مثل الموضة. تأكد من عدم وجود سوء دوران للأشعة الميستيرية لمنع نخر الأمعاء أو الانسداد الميكانيكي.
15. أغلق عضلات البطن/اللفافة والجلد بشكل منفصل باستخدام خيوط الجري المستمرة 3-0.

3. الرعاية بعد الجراحة

1. للمسكن بعد الجراحة، قم بتزويد المتلقين بحقنة إضافية تحت الجلد من 5 ملغ من كاربروفين لكل كيلوغرام من وزن الجسم في أول يوم بعد الجراحة (POD). بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1 غرام من Metamizol إلى 500 مل من مياه الشرب حتى POD الثالث.
2. ابدأ في مراقبة وظيفة ترقيع القلب عن طريق ملامسة البطن اليومية على POD الثالث.
   ملاحظة: في حالة فشل الكسب غير المشروع قبل POD الثالث، يجب النظر في فشل جراحي بدلاً من فشل مناعي. ومع ذلك ، فإن هذا بالطبع يعتمد على مجموعة السلالة المختارة والنموذج المناعي لكل منهما (على سبيل المثال ، الرفض الحاد بعد التمنيع السابق).
3. بعد رفض الكسب غير المشروع ، واستخراج الأنسجة مثل استنزاف العقد الليمفاوية الرجعية الجمجمة من anastomoses ، الطحال ، الدم ، الغدة الصعترية والكسب غير المشروع لمزيد من التحليلات المناعية عن طريق قياس خلايا التدفق أو الكيمياء المناعية.

4. الهضم الأنزيمي للقلب والحقن تحت الجلد لخلايا القلب في الأذن

1. إجراء زراعة القلب والتسريب على نحو مماثل لزراعة القلب الغيرتوب (انظر الخطوة 1).
2. أجاد القلب في كتل 3 مم × 3 مم باستخدام مشرط معقم أو مقص معقم واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في وسط الثقافة الذي يحتوي على 0.5 ملغم/مل كولاجانز.
   ملاحظة: من المهم استخدام الثقافة المتوسطة التي تحتوي على البنسلين والعقدتوميسين والغلوتامين دون مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) خاصة وأن FCS يمنع هضم الكولاجين.
3. إضافة الأنسجة المهضومة إلى منخل كبير pored، في حين إزالة المتوسطة الثقافة والمفروم تماما للحصول على تعليق خلايا عضلة القلب الحيوية، ومعظمهم من خلايا القلب الواحدة الميتة وخلايا الدم المتبقية. اغسل تعليق الخلية مرتين بمحلول محلول ملاهوي معقم.
   ملاحظة: إعدادات الطرد المركزي: 10 دقيقة، 200 × ز، 20 درجة مئوية
4. تصفية التعليق باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وجمع التكوينات الخلية الحيوية عن طريق مسح مصفاة الخلية مع 5-10 مل من محلول محلول محلول ملاهوتوني.
5. After centrifugation, resuspend the cardiac muscle cells in saline solution dissolved at a concentration of 5x10⁵ cells/mL and draw the cell solution up into a 1 mL syringe.
6. إجراء التخدير على نحو مماثل للبروتوكول الموصوف للنارخة المتلقي (انظر الخطوة 2) لزراعة القلب غير المتجانسة.
7. ضع المستلم في وضع جانبي وأصلح الأذن بإصبع باستخدام شريط مزدوج الجانب(الشكل 5A).
8. حقن 20 ميكرولتر من محلول خلايا عضلة القلب (الذي يحتوي على 1 × 10⁴ خلايا) عبر 27 G قنية s.c. بالقرب من الأوعية الشعرية البصرية في أذن المتلقي(الشكل 5B).
9. بعد فترة مراقبة محددة (اعتمادًا على تركيبة السلالة المختارة وقوة الرفض) ، استخرج الغدد الليمفاوية العنقية المنستنزفة وإجراء المزيد من التحليلات مثل قياس التدفق الخلوي أو الثقافات المشتركة(الشكل 5C).
   ملاحظة: وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل النسيجي للpinna لتحديد تسلل الخلايا.

النتائج

في الماضي ، تم معالجة القضايا المناعية المختلفة على أساس النموذج ، الذي تم التحقق من صحته في مجموعة العمل بأكثر من 500 عملية زرع بنسبة بقاء تزيد عن 95٪^13،18،^{19,،20،21،22،23،24.} عادة ً لم يتجاوز إجمالي أوقات التشغيل (بما في ذ...

المناقشة

تعتمد الطريقة الموصوفة سابقًا لزراعة القلب الغيرتوب في الفئران بشكل رئيسي على وصف Ono و Lindsey في عام 1969^3. ومنذ ذلك الحين، أدخلت عدة تعديلات على أنواع مختلفة مما أدى إلى تنوع واسع في هذا النموذج. الجمع بين العديد من هذه التعديلات وإدخال تجربتنا الخاصة الناتجة عن أكثر من 30 عاما من إجراء عمليات زرع القلب الهيتروبية في المختبر، أنشأنا نهجا جراحيا ممكنا، والتي لا تتطلب فترات تدريب طويلة أو خلفية جراحية. وفي ما يلي، سنناقش القيود العامة لهذا النموذج ونؤكد على الخطوات الحاسمة للبروتوكول. وعلاوة على ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جهاز التخدير (بما في ذلك مبخر الأيزوفلوران) حلول	التخدير Summit	لا يوجد رقم كتالوج متاح
قنية (27 جم)	BD Microlance	302200
كاربروفين	فايزر	ريماديل 50 مجم / مل
أنابيب سيلستار (15 مل) مصفاة	GreinerBioOne	188271
(40 & micro; م)	BD Falcon	2271680
نوع الكولاجيناز CLSII	Biochrome	C2-22
كمادات 5x5 سم	Fuhrmann	31501
كمادات 7.5x7.5 سم	Fuhrmann	31505
مسحات قطنية	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5٪)	Bayer	"Bepanthen"
ملقط DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
	B. ملقط Braun	Aesculap BD557R
	ملقط B. براون	Aesculap BD313R
ملقط	B. Braun	Aesculap BD35
حصيرة تسخين	Gaymar Industries	"T / Pump"
شاش مرقئ	Ethicon	Tabotamp
الهيبارين ناتريوم 25 000 أي	Ratiopharm	لا يوجد رقم كتالوج متاح
Isofluran CP	CP-Pharma	لا يوجد رقم كتالوج متاح
منخل كبير المسام (الفولاذ المقاوم للصدأ)	Forschungswerkst & auml ؛ tten كلية الطب في هانوفر	لا يوجد رقم كتالوج متاح
Lidocaine	Astra Zeneca	2٪ Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 مجم / مل
ملقط دقيق	B. Braun	Aesculap BD3361
حامل إبرة صغيرة	Codman، Johnson & جونسون ميديكال	كودمان 80-2003
حامل إبرة صغيرة	ب. حامل إبرة مايكرو براون	Aesculap BD336R
	ب. براون	Aesculap FD241R
مقص مايكرو	ب. براون	Aesculap FD101R
مقص مايكرو	ب. حامل إبرة براون	Aesculap FM471R
	ب. براون	Aesculap BM221R
البنسلين / الستربتومايسين / الجلوتامين (100x)	PAA	P11-010
القسطرة الوريدية الطرفية (18 جم)	ب. براون	4268334B
القسطرة الوريدية الطرفية (22 جم)	ب. براون	4268091B
مسبار مقص مدبب	ب. براون	Aesculap BC030R
مباحثات	Forschungswerkst ä tten كلية الطب في هانوفر	لا يوجد رقم كتالوج متاح
متوسط ثقافة RPMI	محلول ملحي Lonza	BE12-702F
(كلوريد الصوديوم 0.9٪)	باكستر	لا يوجد رقم كتالوج متاح
مقص	ب. براون	أسكولاب BC414
المجهر الجراحي	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
خيوط (مفاغرة)	Catgut	ماريديرم 8-0 خيوط مونوفيل
(ربط)	خيوط ريسوربا	سيلك 5-0 بوليفيل
(الجلد ، اللفافة)	إيثيكون	ميرسيلين 3-0
(1 مل)	ب. حقنة براون	9166017 فولت
(10 مل)	ب. حقنة براون	4606108 فولت
(20 مل)	ب. براون	4606205 فولت
مشبك الأوعية الدموية	ب. براون	Aesculap FB708R

خلايا حقنة