مقالة منهجية

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60960

⸱

أبريل 29, 2020

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Universitat Pompeu Fabra, 3Vall d'Hebron Institute of Oncology

في هذه المقالة

ملخص

نبلغ عن تطبيق التقاط توسوم كموئي متبوع بتسلسل عالي الإنتاجية في أجسام جنينية متولدة من خلايا جذعية جنينية. تسمح هذه التقنية بتحديد وكمية الاتصالات بين المحسّنين المفترضين ومناطق المروج لجين معين أثناء تمايز الخلايا الجذعية الجنينية.

الملخص

خلال تطور الثدييات، يتم تحديد مصائر الخلايا من خلال إنشاء شبكات تنظيمية تحدد خصوصية التعبير الجيني وتوقيته وأنماطه المكانية. كانت الأجسام الجنينية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات نموذجًا شائعًا لدراسة التمايز بين الطبقات الجرثومية الثلاث الرئيسية وتحديد الدوائر التنظيمية أثناء مواصفات مصير الخلايا. على الرغم من أنه من المعروف أن القدرة الخاصة بالأنسجة تلعب دورا هاما في هذه الشبكات من خلال التفاعل مع المروجين، وتعيينها إلى الجينات المستهدفة ذات الصلة لا يزال يشكل تحديا. ولجعل ذلك ممكناً، هناك حاجة إلى نُهج كمية لدراسة الاتصالات بين المروِّجيين ودينامياتهم أثناء التنمية. هنا ، قمنا بتكييف طريقة 4C لتعريف المحسّنات واتصالاتها مع مروجي cognate في نموذج التمايز EB. تستخدم هذه الطريقة قطع إنزيمات التقييد وسونيكيشن وبروتوكول PCR متداخل التطفل المتوافق مع مجموعات إعداد مكتبة الحمض النووي التجارية. وفي وقت لاحق، تخضع مكتبات 4C لتسلسل عالي الإنتاجية ويتم تحليلها من الناحية المعلوماتية الحيوية، مما يسمح بالكشف عن جميع التسلسلات التي لها اتصالات مع مروج مختار وتقديرها كمياً. ويمكن أيضا استخدام بيانات التسلسل الناتجة للحصول على معلومات عن ديناميات جهات الاتصال المحسن ة المروجة أثناء التمايز. من السهل تنفيذ التقنية الموصوفة لنموذج التمايز EB.

المقدمة

في الفئران، تحتوي كتلة الخلايا الداخلية (ICM) للأجنة التي يبلغ عمرها 3.5 يوم على خلايا جذعية جنينية متعددة القدرات. يتطور ICM إلى epiblast في اليوم 4.5 ، مما يولد ectoderm ، mesoderm ، وخلايا endoderm ، وهي الطبقات الرئيسية الثلاث الجرثومية في الجنين. على الرغم من أن الخلايا متعددة القدرات في ICM موجودة فقط بشكل عابر في الجسم الحي ، يمكن التقاطها في الثقافة عن طريق إنشاء الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs)1،2،3. تبقى mESCs في حالة غير متمايزة وتتكاثر إلى أجل غير مسمى ، ولكن على المحفزات الجوهرية والخارجية فهي قادرة أيضًا على الخروج من حالة القدرة المتعددة وتوليد خلايا الطبقات الجرثومية التنموية الثلاث2،4. ومن المثير للاهتمام، عندما مثقف في التعليق في قطرات صغيرة، mESCs تشكل مجاميع ثلاثية الأبعاد (أي EBs) التي تميز في جميع الطبقات الجرثومية الثلاث5. يعد وصف تشكيل EB أداة مهمة لدراسة عملية مواصفات النسب المبكرة.

أثناء مواصفات النسب، تحصل خلايا كل طبقة جرثومية على برنامج تعبير جيني محدد4. يتم تنظيم التعبير الزمني الدقيق للجينات من قبل العناصر التنظيمية المتنوعة لرابطة الدول المستقلة ، بما في ذلك المروجين الأساسيين ، والمحسنين ، وكواتم الصوت ، والعوازل6،7،8،9. محسنات، قطاعات الحمض النووي التنظيمية التي تمتد عادة بضع مئات من أزواج قاعدة، وتنسيق التعبير الجيني خاصة بالأنسجة8. يتم تنشيط المحسّنات أو إسكاتها عن طريق ربط عوامل النسخ والعوامل المساعدة التي تنظم بنية الكروماتين المحلية8،10. التقنيات الشائعة الاستخدام لتحديد المحسّنات المفترضة هي ترسيب مناعة الكروماتين على نطاق الجينوم يليه التسلسل (ChIP-seq) والقول لتقنيات الكروماتين التي يمكن الوصول إليها عبر الترانسبوماز باستخدام التسلسل (ATAC-seq). وهكذا، تتميز المحسّنات النشطة بعلامات هيستون نشطة محددة وبزيادة إمكانية الوصول إلى الحمض النووي المحلي11،12،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، ويعتقد أن القدرة التنموية تتطلب التفاعل المادي مع المروج cognate8،9. في الواقع، فقد ثبت أن المتغيرات محسن والحذف التي تعطل الاتصالات محسن المروج يمكن أن يؤدي إلى تشوهاتالتنموية 15. لذلك ، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة توفر معلومات إضافية لتحديد المحسّنين الوظيفيين الذين يتحكمون في التعبير الجيني التنموي.

منذ تطوير ضبط التّصيّاق الكروموسومي (3C) تقنية16، تم استخدام رسم خرائط المخالطين الكروموسومي بشكل مكثف لتقييم المسافة الفيزيائية بين العناصر التنظيمية. الأهم من ذلك، تم مؤخرا تطوير المتغيرات عالية الإنتاجية من تقنيات 3C، وتوفير استراتيجيات مختلفة لتثبيت، والهضم، والربط، واستعادة الاتصالات بين شظايا الكروماتين17. من بينها، في الموقع مرحبا- C أصبحت تقنية شعبية تسمح لتسلسل 3C ربط المنتجات الجينوم واسعة18. ومع ذلك ، فإن تكاليف التسلسل العالية المطلوبة للتوصل إلى حل مناسب لتحليل جهات الاتصال المحسنة المروجة يجعل هذه التقنية غير عملية لدراسة loci محددة. لذلك ، تم تطوير طرق بديلة لتحليل loci المستهدفة في قرار أعلى19،20،21،22. واحدة من هذه الطرق ، وهي 4C ، والمعروفة باسم واحد مقابل استراتيجية للجميع ، ويسمح الكشف عن جميع التسلسلات التي تتصل موقع مختارة كوجهة نظر. ومع ذلك ، فإن عيب تقنية 4C القياسية هو PCR المعكوس المطلوب ، والذي يضخم شظايا مختلفة الحجم ، وتفضل المنتجات الصغيرة والتقدير الكمي المتحيز بعد التسلسل عالي الإنتاجية. في الآونة الأخيرة، UMI-4C، تم تطوير متغير جديد من تقنية 4C باستخدام معرفات جزيئية فريدة من نوعها (UMI) لتنميط الاتصال الكروموسومي الكمي والمستهدف الذي يتحايل على هذه المشكلة23. ويستخدم هذا النهج القواطع المتكررة، وسونيكيشن، وبروتوكول PCR متداخل ة الربط بوساطة، مما ينطوي على تضخيم شظايا الحمض النووي مع توزيع طول موحد نسبيا. ويقلل هذا التجانس من التحيزات في عملية تضخيم تفضيلات PCR للتسلسلات الأقصر ويسمح بالاسترداد الفعال والعد الدقيق للجزيئات/الشظايا المتصلة مكانياً.

هنا نحن وصف بروتوكول الذي يكيف تقنية UMI-4C لتحديد وتحديد الاتصالات الكروماتين بين المروجين ومحسنات عوامل النسخ المفيدة النسب خلال التمايز EB.

البروتوكول

1. توليد الجسم الجنيني من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

  1. إعداد mESC خالية من المصل الثقافة المتوسطة: DMEM/F12 والمتوسطة العصبية مختلطة بنسبة 1:1. يتم استكمال الثقافة المتوسطة مع MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية الحل (1x), بيروفات الصوديوم (1 mM), L-الجلوتامين (2 mM), البنسلين-streptomycin (100 U/mL), بيتا ميركابتو الإيثانول (50 ميكرومتر) ومكملات N2 وB27 (1x) وPD0325901 (1 ميكرومتر) وCHIR99021 (3 ميكرون) وعامل مثبط لسرطان الدم (LIF) (1000 U/mL).
  2. إعداد EB التمايز المتوسطة: DMEM تكملها 10٪ مصل البقر الجنين (FBS)، MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (1x)، بيروفات الصوديوم (1 mM)، L-الجلوتامين (2 mM)، البنسلين-العقديات (100 U/mL)، بيتا ميركتوبوإيثانول (50 ميكرومتر).
  3. الثقافة mESCs على 10 سم أطباق بلاستيكية مسبقة المغلفة مع 0.1٪ (ث / في) الجيلاتين في mESC ثقافة خالية من المصل المتوسطة.
  4. عندما تصل mESCs إلى التقاء 60٪، قم بإزالة الثقافة المتوسطة واغسل بلطف 1x مع 2 مل من PBS المعقم.
  5. إزالة برنامج تلفزيوني تماما وإضافة 2 مل من خلية مفرزة المتوسطة. احتضان طبق الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
  6. تعطيل رد الفعل عن طريق إضافة 8 مل من وسيط التمايز EB إلى الطبق.
  7. فصل المستعمرات mESC عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 15-20 مرات للحصول على تعليق خلية واحدة.
  8. طرد الخلايا في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقيقة وإزالة بعناية supernatant.
  9. عد الخلايا (على سبيل المثال، باستخدام مقياس الهيموكيتومتر).
  10. إعادة تعليق بيليه الخلية مع وسيط التمايز EB وضبط التركيز إلى 2 × 104 خلايا / مل.
  11. عكس غطاء طبق ثقافة 15 سم واستخدام ماصة متعددة القنوات 200 ميكرولتر لإيداع 20 ميكرولتر قطرات من الخلايا التي أعيد تعليقها (~ 400 خلية / قطرة) على الغطاء.
  12. عكس الغطاء بعناية على الغرفة السفلية واحتضان الطبق مع قطرات معلقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 95٪ الرطوبة لمدة 3 أيام.
  13. جمع EBs عن طريق غسل الغطاء بلطف مع 10 مل من برنامج تلفزيوني ونقل التعليق المحتوي ة على EB إلى أنبوب بلاستيكي 50 مل.
  14. ضع الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة ، بحيث تغرق EBs إلى القاع عن طريق الجاذبية. إزالة بعناية supernatant.
  15. إعادة تعليق EBs بلطف مع 10 مل من متوسط التمايز EB الطازجة ونقلها إلى طبق بيتري البكتريولوجي 10 سم.
  16. تحقق من تشكيل EB بعد 3-6 أيام باستخدام المجهر المقلوب. يجب أن تكون EBs التي تم إنشاؤها مستديرة ومتجانسة في الحجم.
  17. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 95٪ الرطوبة. سوف تستمر EBs في التفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث ويمكن جمعها في نقاط زمنية مختلفة للتحليل.

2- انفصام الـ EBs

  1. جمع EBs من اثنين إلى ثلاثة أطباق 10 سم في أنبوب بلاستيكي 50 مل. طرد مركزي EBs في 300 × ز في RT لمدة 5 دقيقة، ثم إزالة بعناية supernatant.
  2. إعادة تعليق EBs مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي EBs في 300 × ز في RT لمدة 3 دقيقة وإزالة supernatant.
  3. إضافة 2 مل من التربسين-EDTA (0.25%) إلى بيليه واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. Pipette صعودا وهبوطا كل 3 دقيقة للحصول على تعليق خلية واحدة.
  4. إضافة 8 مل من وسيط التمايز EB لوقف رد فعل التربسين. تحقق من انفصام EB تحت المجهر وعد الخلايا.

3. التثبيت

  1. إعادة تعليق الخلايا في المتوسط ثقافة EB الطازجة في 1 × 106 خلايا / مل. لأنبوب 50 مل، استخدم بحد أقصى 4.5 × 107 خلايا في 45 مل من المتوسط.
  2. إضافة paraformaldehyde من مخزون 37٪ (لا يزيد عن 6 أشهر) إلى تركيز نهائي 1٪.
    تنبيه: اتبع لوائح الصحة والسلامة المناسبة أثناء التعامل مع بارافورمالديهايد لأنه مادة كيميائية خطرة.
  3. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT تحت التناوب.
  4. إرواء الفورمالديهايد بإضافة الجليسين إلى تركيز نهائي قدره 0.125 متر.
  5. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT تحت التناوب.
  6. نقل الخلايا الثابتة إلى الجليد والحفاظ على الباردة في 4 درجة مئوية من الآن فصاعدا.
  7. بيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في جهاز طرد مركزي المبردة.
  8. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني الباردة (1 مل ل5 × 106 خلايا)، ثم نقل إلى أنابيب 1.5 مل آمنة القفل.
  9. بيليه الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية، والتخلص من supernatant، والمفاجئة تجميد الكريات في النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية أو المضي قدما مع البروتوكول أدناه.

4. خلية الانزيم وتقييد هضم الانزيم

  1. بلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.25 مل من الثلج الطازج الباردة العازلة العازلة (10 mM Tris-HCl pH = 8.0, 10 mM NaCl, 0.2% Igepal CA630, و 1x مثبطات البروتياز) لكل 2-5 × 106 خلايا. لإعداد 5 مل من المخزن المؤقت لليليس، راجع الجدول 1.
  2. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على الجليد.
  3. الطرد المركزي عند 1000 × غرام لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant والحفاظ على بيليه، الذي يحتوي على النوى.
  4. غسل النوى بيليه مع 500 ميكرولتر من العازلة الزل الباردة.
  5. بلطف إعادة تعليق بيليه في أنبوب 1.5 مل مع 50 ميكرولتر من 0.5٪ SDS في 1x عازلة 2، ثم احتضان الأنبوب في كتلة التدفئة في 62 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  6. إزالة الأنابيب من كتلة التدفئة وإضافة 170 ميكرولتر من المخزن المؤقت الهضم تحتوي على 25 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 لإرواء SDS. مزيج جيدا عن طريق الأنابيب، وتجنب الرغوة المفرطة.
  7. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. أضف 25 ميكرولتر من عازل الهضم، واخلط بالعكس، وخذ 8 ميكرولتر كتحكم غير مهضوم. الحفاظ على عينة التحكم غير مهضوم ة في -20 درجة مئوية. إضافة 100 U MboI تقييد الانزيم (4 ميكرولتر من 25 U/ μL المخزون) إلى النوى المتبقية وهضم الكروماتين لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية تحت التناوب. إضافة أخرى aliquot من 100 U من MboI واحتضان لمدة 2 ساعة إضافية.
  9. إضافة 100 U أخرى من MboI واحتضان تحت التناوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  10. في اليوم التالي، إضافة 100 U أخرى من مبوي واحتضان لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية تحت التناوب.
  11. خذ 8 ميكرولتر كعينة تحكم مهضومة. دي crosslink هضم عينات التحكم وعينات التحكم غير مهضوم من الخطوة 4.8 بإضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 mM تريس درجة الحموضة = 8، 1 mM EDTA) و 10 ميكرولتر من بروتينات K (10 ملغ / مل). احتضان في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  12. تشغيل 20 μL aliquots على هلام 0.6٪ للتحقق من كفاءة الهضم. تظهر عمليات الهضم الناجحة في الغالب شظايا في نطاق 3.0-0.5 كيلوبايت.

5. ربط القرب وعكس الوصلة المتقاطعة

  1. احتضان العينات مبوري هضم في 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة لمدة 20 دقيقة لتنشيط MboI، ثم بارد إلى RT.
  2. طرد مركزي أنابيب لمدة 5 دقيقة في 1000 × ز في RT، وإزالة supernatant، وتذوب بيليه في 200 ميكرولتر من الحاجز الرباطي الطازج.
  3. إضافة 1000 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي إلى كل عينة. لإعداد 1000 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للربط، راجع الجدول 2.
  4. مزيج عن طريق العكس واحتضان في RT بين عشية وضحاها مع دوران بطيء (9 دورة في الدقيقة).
  5. القضاء على الحمض النووي الريبي وبقايا البروتين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من بروتينات K (10 ملغ / مل) و 10 ميكرولتر من RNase A (10 ملغ / مل). عينات الاحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
  6. مواصلة احتضان العينات في 65 درجة مئوية لمدة إضافية 4 ساعة.

6. الحمض النووي القص واختيار الحجم

  1. أنابيب باردة إلى RT.
  2. الطرد المركزي لمدة 5 دقيقة عند 1000 × غرام عند 4 درجات مئوية.
  3. تقسيم العينة إلى ثلاثة 400 μL aliquots في 2 أنابيب مل وإضافة 2 ميكرولتر من الجليكوجين (20 ملغ / م) ، 40 ميكرولتر من خلات الصوديوم (3 M ، درجة الحموضة = 5.2) ، و 2.5x وحدات التخزين (1 مل) من الإيثانول 100 ٪ إلى كل أنبوب. مزيج عن طريق المقلوب واحتضان في -80 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
  4. الطرد المركزي في 16،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. الحفاظ على الأنابيب على الجليد بعد الغزل وإزالة بعناية supernatant عن طريق الأنابيب.
  5. اغسل كريات الحمض النووي عن طريق إعادة التعليق في 800 ميكرولتر من الإيثانول 70٪. الطرد المركزي عند 16,000 × ز عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقيقة.
  6. إزالة supernatant وأداء غسل مرة أخرى مع 800 ميكرولتر من الإيثانول 70٪.
  7. إذابة بيليه في 130 ميكرولتر من 1x Tris المخزن المؤقت (10 mM Tris-HCl, درجة الحموضة = 8) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإذابة الحمض النووي تماما. إذا لزم الأمر، استخدم الأنابيب لإعادة تعليق أي مترسب.
  8. قياس العائد الحمض النووي؛ يمكن توقع 2.5-5 ميكروغرام من الكروماتين لخلايا 1 × 106. تحقق من الربط عن طريق تشغيل ± 200 نانوغرام من المنتج 3C على هلام agarose 0.6٪. تظهر عمليات الربط الناجحة في الغالب شظايا الحمض النووي > 3 كيلوبايت. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  9. تمييع عينة في أنبوب 0.65 مل مناسب للسونيكيشن إلى 10 نانوغرام/ميكرولتر في 100 ميكرولتر من حجم المخزن المؤقت 1x Tris (1 ميكروغرام لكل أنبوب). المبلغ القياسي المستخدم لإعداد المكتبة هو 3 ميكروغرام، لذلك قم بإجراء صوتنة في ثلاثة أنابيب منفصلة إذا لزم الأمر.
  10. قص الحمض النووي إلى حجم 150-700 bp (متوسط = 400-500 bp) باستخدام المعلمات التالية على sonicator: دورات: 6-8 من 20 ق على -60 ق قبالة. وهذا من شأن ذلك أن يجعل الحمض النووي مناسبًا لإعداد مكتبة التسلسل عالي الإنتاجية باستخدام متسلسلات Illumina.
  11. نقل الحمض النووي القص إلى أنبوب قفل آمن جديد عادي. تجمع سونيكات متعددة من نفس العينة.
  12. دافئ زجاجة من خرز تنقية الحمض النووي في RT. من الآن فصاعدا، استخدم نصائح ملزمة منخفضة.
  13. إضافة 1.8x وحدات تخزين من الخرز إلى أنبوب الحمض النووي وإعادة تعليق بلطف.
  14. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  15. جمع الخرز مع رف المغناطيسي. غسل الخرز 2x مع 1 مل من الإيثانول أعدت حديثا 80٪ مع الحفاظ على أنابيب في الرف المغناطيسي.
    ملاحظة: إزالة جميع الإيثانول، بما في ذلك قطرات المتبقية.
  16. الهواء الجاف الخرز لفترة وجيزة (2-3 دقيقة) في RT.
    ملاحظة: لا الخرز الجاف أطول من 5 دقيقة. هذا سيقلل من عائد الحمض النووي.
  17. إعادة تعليق الخرز مع 90 ميكرولتر من 1x تريس المخزن المؤقت (10 mM تريس-HCl، درجة الحموضة = 8) لتمكث الحمض النووي.
  18. قياس العائد الحمض النووي وتحليل 5 μL aliquot على هلام 1.5٪. يجب أن يكون هناك خسارة قليلة جدا بالمقارنة مع العائد قبل الصوتية.

7- إعداد المكتبة للتسلسل

  1. أضف 15 ميكرولتر من المزيج الرئيسي من مجموعة إعداد المكتبة. لإصلاح نهايات الحمض النووي القص، والجمع بين 10 μL من 10x نهاية إصلاح رد الفعل المخزن المؤقت و 5 μL من نهاية مزيج إنزيم الإصلاح.
  2. احتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة حجم 1.1x من خرز تنقية الحمض النووي وإعادة تعليق بلطف.
  4. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  5. جمع الخرز مع رف المغناطيسي. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من الإيثانول أعدت حديثا 80٪ مع الحفاظ على أنابيب في الرف المغناطيسي. إزالة الإيثانول.
  6. الهواء الجاف الخرز لمدة 2-3 دقيقة في RT. إعادة تعليق الخرز مع 42 ميكرولتر من 1x تريس عازلة (10 mM تريس-HCl، درجة الحموضة = 8) لتملز الحمض النووي.
  7. إضافة 8 μL من المزيج الرئيسي dA-tailing إلى كل عينة. لإعداد المزيج الرئيسي dA-tailing، اجمع بين 5 ميكرولتر من 10x dA-tailing رد الفعل المخزن المؤقت و 3 ميكرولتر من إكسو قطعة Klenow ناقص.
  8. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  9. إضافة 2 μL العجل القلوية الفوسفاتاز (CIP) إلى الحمض النووي إزالة الفوسفور.
  10. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم 60 دقيقة في 50 درجة مئوية.
  11. إضافة 1.1x وحدات التخزين من خرز تنقية الحمض النووي وإعادة تعليق بلطف.
  12. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  13. جمع الخرز مع رف المغناطيسي. غسل الخرز 2x مع 1 مل من الإيثانول أعدت حديثا 80٪ مع الحفاظ على أنابيب في الرف المغناطيسي.
  14. الهواء الجاف الخرز لفترة وجيزة (2-3 دقيقة) في RT. إعادة تعليق الخرز مع 35 ميكرولتر من 1x تريس عازلة (10 mM تريس-HCl، pH = 8) لتنكب الحمض النووي.
  15. تنفيذ رد فعل ربط المحول. استخدام تركيزات محول/رباط مخفضة كما هو مذكور في الجدول 3.
  16. احتضان في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  17. إضافة 3 ميكرولتر من خليط من حمض الأوراسيل الحمض النووي glycosylase والحمض النووي glycosylase lyase endonuclease السابع (على سبيل المثال، المستخدم) إنزيم، مزيج عن طريق الأنابيب، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  18. زيادة حجم إلى 100 ميكرولتر مع الماء، يغلي 5 دقيقة عند 96 درجة مئوية، ثم الحفاظ على العينات على الجليد.
  19. إضافة 1.1x وحدات التخزين من خرز تنقية الحمض النووي وإعادة تعليق بلطف.
  20. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  21. جمع الخرز مع رف المغناطيسي. غسل الخرز 2x مع 1 مل من الإيثانول أعدت حديثا 80٪ مع الحفاظ على أنابيب في الرف المغناطيسي.
  22. الهواء الجاف الخرز لمدة 2-3 دقيقة في RT. إعادة تعليق الخرز مع 50 ميكرولتر من 1x تريس عازلة (10 mM تريس-HCl، درجة الحموضة = 8) لتملز الحمض النووي.

8. 4C الكروماتين مكتبة التفاعل تضخيم وتنقية

  1. تضخيم مكتبة 4C باستخدام 10 ميكرولتر من المكتبة لتنفيذ PCR الأولى. يمكن العثور على إعداد PCR والبرنامج في الجدول 4.
  2. تنفيذ PCR متداخلة. يمكن العثور على إعداد PCR المتداخلة والبرنامج في الجدول 5.
  3. تجمع منتجات PCR لكل مكتبة وتنقية مع 1.1x حبات تنقية الحمض النووي.
  4. قياس العائد الحمض النووي وتحليل 5 μL aliquot على هلام 1.5٪.
  5. ضبط تركيز المكتبة وتسلسل المكتبة. إذا تمت فهرستها، يمكن تجميع المكتبات قبل التسلسل.

النتائج

بعد ستة أيام من تحريض التمايز ESC في القطرات المعلقة ، حصلنا على مجموعة متجانسة من EBs التي تم استخدامها لمزيد من التحليلات(الشكل 1). قمنا بتكييف طريقة UMI-4C23 لتحديد تفاعل كروماتين محدد عند مروجي جينات محددة للنسب في EBs24. ويرد لمحة عامة تخطيطية من البروتوكول مع المواد الهلامية مراقبة الجودة التمثيلية في خطوات مختلفة في الشكل 2A. تم تنفيذ أول مراقبة الجودة لتحديد كفاءة هضم إنزيم تقييد MboI. وأظهرت كفاءة الهضم حجم جزء من أقل من 3 كيلوبايت في الثانية(الشكل 2B). من الجدير بالذكر، mESC وEB كروماتين الهضم كان صعبا وأحيانا استمرت الكروماتين المتبقية غير المهضومة. تم تنفيذ مراقبة الجودة الثانية بعد الربط للتحقق من أن معظم الشظايا كانت الآن > 3 كيلوبت في الثانية(الشكل 2B). ثم، تم تحليل شظايا الكروماتين التي تم الحصول عليها بعد سونيكيشن بواسطة الكتروفوريس هلام. وكان من المتوقع أحجام شظايا من 400-500 نقطة أساس(الشكل 2B).

بعد إزالة الفوسفور والربط محول واحد نهاية، تم تنفيذ جولتين من PCR لتضخيم الأهداف ذات الفائدة. تم استخدام نهج متداخل لتصميم مجموعة من اثنين من التمهيديات لكل locus. وقد ساعد ذلك على تحسين التحديد. تم تضخيم كل هدف بشكل منفصل مع اثنين من أزواج التمهيدي مختلفة لتحسين ظروف PCR (أي، أزواج التمهيدي A و B لLocus Pou5f1 وأزواج التمهيدي C و D للوضع T، على التوالي) وأسفر عن مسحة الحمض النووي حوالي 400 bp(الشكل 2C). وبدلاً من ذلك، تم تنفيذ تعدد الـ PCR لتضخيم الهدفين A و C في وقت واحد(الشكل 2D)وأسفر عن حجم جزء مماثل بعد التنقية(الشكل 2D). يمكن العثور على التمهيدات المستخدمة لإعداد مكتبة 4C (loci من Pou5f1 و T)في الجدول 6.

لتحليل البيانات ، تم محاذاة قراءات التسلسل الخام أولاً ضد جينوم الماوس refence mm10 ، وتم تكرارها جميعًا ، وتمت إزالة القراءات منخفضة الجودة (< 20). لكل طعم، تم الحصول على المعلومات الخاصة بكل جزء من القيود عن طريق حساب عدد أجزاء القراءة، وتم الحصول على ملف تعريف اتصال أولي. بعد ذلك، تم تعريف منطقة الاهتمام على أنها جميع أجزاء التقييد مع مسافة 2 كيلوبت في الثانية و 250 كيلوبت في الثانية إلى الطعم. تم زيادة حجم كل جزء من القيود عن طريق تجميع أجزاء التقييد المجاورة بشكل تسلسلي لتنعيم الملفات الشخصية حتى تم الوصول إلى عتبة 5٪ من إجمالي عدد جهات الاتصال الخام في المنطقة ذات الاهتمام. لضمان دمج النسخ المتماثلة، ومقارنة الظروف، قمنا بتضمين كل من المنحدرات والمعترضات العشوائية على مستوى جزء التقييد. تم رسم متوسط التشكيل الجانبي لكل شرط وتغيير الطي بينهما كما هو موضح في الشكل 3. خلال التمايز EB، وانخفضت الاتصالات بين محسنات والمروج للجين متعدد القدرات Pou5f1، في حين محسن المروج الاتصالات من النسب mesendoderm عامل النسخ مفيدة T زيادة(الشكل 3)،وتوفير رؤى وظيفية حول هذه المحسات التنموية.

figure-results-1
الشكل 1: صور تمثيلية لـ mESC والأجسام الجنينية المشتقة. اليوم 0 mESC المستزرعة في ظروف خالية من المصل (يسار) ومتجانسة اليوم 6 EBs (يمين) لوحظ من قبل المجهر مقلوب. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: سير العمل 4C والصور التمثيلية للخطوات الرئيسية للبروتوكول. (أ)سير العمل التخطيطي للكمية 4C. RS = موقع التقييد؛ الولايات المتحدة = المنبع؛ DS = المصب; UP = التمهيدي العالمي; D = المسافة بين RS و DS يجب أن تكون مثالية 5-15 bp.(B)أمثلة من الكروماتين مبوري المهضوم (I) ، في النوى الاسبانية الكروماتين (الثاني) ، والكروماتين سونيكاتين (III). الأرقام على اليسار تشير إلى أحجام الحمض النووي التي يحددها سلم الحمض النووي تشغيل لكل عينة. (C)أمثلة على تضخيم PCR في اثنين loci: Pou5f1 (التمهيديين A و B) و T (التمهيدي C و D). (D)أمثلة على تضخيم PCR متعدد المضاعفات في Pou5f1 و T loci باستخدام التمهيديين A و C. ES = الخلايا الجذعية الجنينية؛ EB = الأجسام الجنينية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أمثلة على ملفات تعريف 4C. الملامح الكمية 4C للطعوم الموجودة على المروجين الجينات Pou5f1 و T assayed في mESCs واليوم 6 EBS. وتبين اللوحة العليا قطع اقطع من متوسط الاتصالات المتولدة من اثنين من النسخ البيولوجية المستقلة؛ تعرض اللوحة السفلية متوسط تغيير أضعاف الاتصال لليوم 6 EBs مقابل mESCs (متوسط التكرارين). تشير المربعات الزرقاء الفاتحة إلى موقع المحسّنات مع التغيرات الديناميكية أثناء التمايز. الشكل مقتبس من تيان وآخرون24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مقابل 5 مل
1M تريس-HCl، pH8.050 ميكرولتر
5M NaCl10 ميكرون لتر
10% إيجيبال CA630100 ميكرولتر
50x روش مثبطات البروتياز كاملة100 ميكرولتر
مياه ميليكيو4.74 مل

الجدول 1: المخزن المؤقت ليسيس.

لـ 1000μL
مياه ميليكيو869 ميكرولتر
10X NEB T4 الحمض النووي Ligase المخزن المؤقت120 ميكرولتر
20mg/mL بوريفين مصل الألبومين6 ميكرولتر
2000 U/μL T4 الحمض النووي Ligase5 ميكرولتر

الجدول 2: إعداد مزيج الربط الرئيسي.

مقابل 15 ميكرولتر
5X سريع ربط رد الفعل المخزن المؤقت10 ميكرون لتر
محول NEBNext3 ميكرولتر
سريع T4 الحمض النووي ligase2 ميكرولتر

الجدول 3: رد فعل ربط المحول.

إعداد PCR
محول ربط المكتبة على الموتى10 ميكرون لتر
الماء من الدرجة PCR20.25 ميكرولتر
10 ميكرومتر الهدف التمهيدي محددة3.75 ميكرولتر
10 ميكرومتر NEB مؤشر التمهيدي3.75 ميكرولتر
هيركولاز الثاني 5X المخزن المؤقت10 ميكرون لتر
10 ملم dNTPs1.25 ميكرولتر
هيركولاز الثاني بولميراز1 ميكرولتر
إجمالي الحجم50 ميكرولتر
برنامج PCR
الخطوة الأولى: 98 درجة مئوية - 2 دقيقة
الخطوة الثانية: 98 درجة مئوية - 20s
الخطوة الثالثة: 65 درجة مئوية - 30s
الخطوة الرابعة: 72 درجة مئوية - 45 درجة
الخطوة 5: انتقل إلى الخطوة 2 لجعل ما مجموعه 15-18 دورات
الخطوة السادسة: 72 درجة مئوية - 3 دقيقة
الخطوة 7: 4 درجات مئوية – عقد

الجدول 4: تضخيم مكتبة التفاعل اللوني 4C، PCR الأول.

إعداد PCR متداخل
جزء الحمض النووي من PCR الأولى10 ميكرون لتر
الماء من الدرجة PCR20.25 ميكرولتر
10 ميكرومتر التمهيدي محددة + P5 Illumina التمهيدي3.75 ميكرولتر
10 ميكرون P7 أولير إيلومينا3.75 ميكرولتر
هيركولاز الثاني 5X المخزن المؤقت10 ميكرون لتر
10 ملم dNTPs1.25 ميكرولتر
هيركولاز الثاني بولميراز1 ميكرولتر
إجمالي الحجم50 ميكرولتر
برنامج PCR متداخل
الخطوة الأولى: 98 درجة مئوية - 2 دقيقة
الخطوة الثانية: 98 درجة مئوية - 20s
الخطوة الثالثة: 65 درجة مئوية - 30s
الخطوة الرابعة: 72 درجة مئوية - 45 درجة
الخطوة 5: انتقل إلى الخطوة 2 لجعل ما مجموعه 15-18 دورات
الخطوة السادسة: 72 درجة مئوية - 3 دقيقة
الخطوة 7: 4 درجات مئوية – عقد

الجدول 5: تضخيم مكتبة التفاعل اللوني 4C، PCR متداخلة.

اسمتسلسل (5'-3')
DS-Oct4-AAATGATACGGCGACCACCTCTACCTTCCCTaCACGACG
CTCTTCCGATCTTCTTGCAaAAAAGAGCACGCCAG
الولايات المتحدة-Oct4-ATCTCTtGCAAAAAACTAAGCACGCC
DS-Oct4-BAATGATACGGCGACCACCTCTACCTTCCCTaCACGACG
CTCTTTCCGATCTGTGGGGCAGCAGGGGGGGAGCCGGGCT
الولايات المتحدة-Oct4-BACCAGGTGGGGGGGGGGGGCAGCAGGGCT
DS-T-CAATGATACGGCGACCACCTCTACCTTCCCTaCACGACG
CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTCCACTCGCCAAGAGGC
الولايات المتحدة-T-Cجاتاكتكجيغتكتكتكتكتكاتاتاتمجلس التعاون الخليجي
DS-T-DAATGATACGGCGACCACCTCTACCTTCCCTaCACGACG
CTCTTCCGATCTGGCTTTGGGGGTAGAGGAGACCCGGGGGG
الولايات المتحدة-T-DGCTGAGCTTTGGGGGTCAAGGAGACC
UP-4CCAAGCAGAAGACGGACGA
Adap-i1CAAGCAGAAGACGGGAGAGAGAGTGTGTGGGGGAGTTCAGA
CGTGTGTTCCGATC
Adap-i2CAAGCAGAAGACGGGAGAGAGATACCGGGGGAGTTCAGA
CGTGTGTTCCGATC
Adap-i3CAAGCAGAAGACGGACAGAATGCCAAGGGGGAGTTCAGA
CGTGTGTTCCGATC
Adap-i4CAAGCAGAAGACGGAGAAGGAGGTCAGTGGGGGAGTTCAGA
CGTGTGTTCCGATC

الجدول 6: الآلات التمهيدية المستخدمة لإعداد مكتبة 4C.

المناقشة

لا تحتاج طريقة ثقافة الإفلات المعلق إلى عوامل نمو إضافية أو السيتوكينات وتولد بشكل مستنسخ مجموعات متجانسة من EBs من عدد محدد مسبقًا من mESCs5. هنا نصف بروتوكول من 4C الكمية تكييفها من نهج UMI-4C لتحديد الاتصال محسن المروج من عوامل النسخ المحددة النسب في نموذج التمايز EB. حددنا مناطق الكروماتين التي تتصل بمروجي جينات Pou5f1 و T بطريقة ديناميكية خلال تمايز EB. تم downregulationed Pou5f1 خلال تمايز EB وتناقص تردد الاتصال بين المروج Pou5f1 ومحسن ه distal. وعلى العكس من ذلك، تم رفع T خلال تمايز EB وحددنا ثلاثة محسنات يتم تقليل ترددات الاتصال مع مروجها(الشكل 3). لتأكيد تحديد الهوية، يمكن إجراء فحص الترسيب المناعي اللوني (ChIP) من علامة الهستون النشطة H3K27ac24، حيث ثبت أن هذه العلامة الهستون مرتبطة بتنشيط محسن والقدرة تفقد هذه العلامة أثناء تعطيلها11.

وقد استخدمت تقنية قياسية 4C على نطاق واسع لمسح ملف الاتصال الكروماتين لمواقع الجينوم محددة25. غير أن هذا النهج يصعب تفسيره كمياً حتى بعد التطبيع الواسع النطاق26و27,,و28 بسبب التحيزات التي أدخلها عدم تجانس حجم تجزؤ الـ PCR واستحالة التمييز بين تكرارات PCR. لدينا طريقة 4C الكمية متطابقة إلى حد كبير إلى تقنية UMI-4C التي تسمح بالقياس الكمي للجزيئات الفردية باستخدام سونيكيشن وخطوة PCR بوساطة الربط المتداخلة لتجاوز الحد من نهج 4C الكلاسيكي23. ومع ذلك ، على عكس UMI-4C التي تستخدم معرفات جزيئية فريدة من نوعها ، يسمح بروتوكول4C الكمي لدينا بالقياس الكمي للجزيئات المفردة استنادًا إلى كسر الحمض النووي المحدد الذي تنتجه خطوة سونيكيشن. يجعل بروتوكولنا متوافقًا مع مجموعات إعداد مكتبة الحمض النووي التجارية ، مما يغني عن الحاجة إلى الالتمهيديات ذات المعرفات الجزيئية الفريدة.

يتضمن بروتوكولنا عدة خطوات رئيسية ينبغي النظر فيها. كما هو الحال في الطريقة الكلاسيكية 4C28، والعوامل الحاسمة لبروتوكولنا هي كفاءة الهضم والربط أثناء إعداد جزيئات 3C. انخفاض كفاءة الهضم / الربط يمكن أن تقلل بشكل كبير من تعقيد التفاعل مع جزء من الاهتمام ، مما يؤدي إلى انخفاض الدقة. كما وصف سابقا23، خطوة أخرى حاسمة من البروتوكول هو تصميم التمهيديات لتضخيم المكتبة. وينبغي أن يكون موقع التمهيديات رد فعل PCR الثاني 5-15 nt من موقع التقييد استجواب. في قراءة تسلسل 75 NT، يسمح هذا لما لا يقل عن 40 nt اليسار من طول الالتقاط لتعيين. وينبغي تصميم التمهيدي المستخدم في رد الفعل الأول لتفاعل تفاعل الـ PCR في المنبع من التمهيدي الثاني دون أي تداخل، وينبغي أن يكون كلاهما محددًا بما يكفي لضمان تضخيم الحمض النووي الفعال. لmultixing، يجب تصميم التمهيديات بشكل مستقل، تهدف إلى درجة حرارة ذوبان (Tم)من 60-65 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، أما بالنسبة لتقنيات 3C الأخرى، يتم تحديد دقة الطريقة 4C الكمية من قبل إنزيم تقييد المستخدمة في البروتوكول25. يستخدم هذا البروتوكول إنزيم تقييد مع موقع التعرف على 4 bp، MboI. الحد الأقصى للقرار مع هذا الانزيم حوالي 500 bp، ولكن هذا هو مركز تعتمد للغاية ونادرا ما يتحقق. تقييد آخر هو أن التفاعلات التي تحدث بين العناصر الموجودة في جزء القيد نفسه غير قابلة للكشف. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تمييز التفاعلات التي تحدث على مسافة موقع تقييد واحد عن الخلفية غير المهضومة. قد يسمح استخدام خطوة تعبئة قبل الربط بالكشف عن هذه التفاعلات.

الكمية 4C هو مناسبة بشكل مثالي لاستجواب المخالطين الاتصالات من loci المستهدفة. ومع ذلك، فإن خطوة تضخيم PCR المحددة تحد من عدد loci التي يمكن التحقيق فيها في وقت واحد. وهناك طريقة لزيادة عدد loci المستهدفة هو متعدد الخطوات PCR لتضخيم العديد من الأهداف في وقت واحد، ولكن هذا يتطلب التوافق من التمهيديات المستخدمة واختبار كل زوج التمهيدي قبل التنفيذ. إذا كانت التغييرات العالمية في العمارة الكروماتين في المروجين مرغوبة ، فإن النهج على نطاق الجينوم مثل Hi-C أو PC Hi-C أو HiChIP سيكون أكثر ملاءمة29،30،31.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ونود أن نشكر ف. لو ديلي، ور. ستادهودرس، وأعضاء مختبر غراف على نصائحهم ومناقشاتهم. تم دعم G.S. من قبل زمالة ماري سكلودوسكا كوري (H2020-MSCA-IF-2016، miRStem)، T.V.T من قبل زمالة خوان دي لا سيرفا ما بعد الدكتوراه (MINECO، FJCI-2014-22946). وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاريالسابع FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome، اتفاقية المنح 609989 إلى T.G.)، ووزارة الاقتصاد والصناعة والقدرة التنافسية الإسبانية (MEIC) إلى شراكة EMBL، Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 وبرنامج CERCA Generalitat de Catalunya.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1٪ EmbryoMax الجيلاتينEMD MilliporeES-006-Bثقافة الخلايا
0.25٪ Trypsin-EDTA25200072
AMPure XPBeckman Coulter101362244C / DNA تنقية
B27 مكملغذائي Gibco17504044زراعة الخلايا
بيتا ميركابتو إيثانولجيبكو31350010ثقافة الخلايا
Bioruptor PicoDiagencodeB010600104C / صوتنة
BSANEBB9000S4C
CHIR99021Selleck ChemicalsS1263ثقافة الخلية
CIPNEBM02124C
cOmplete Protease Inhibitor كوكتيلRoche46931160014C
DMEM / F12 خلية 11320033 جيبكو ثقافة
dNTPNEBN0447S4C
ESGRO عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) EMDMilliporeESG1107زراعة
الخلايا محلول الفورمالديهايد (37٪)Sigma252549-25ML4C
GlycinSigmaGE17-1323-014C
GlycogenThermoFischerR05514C
Herculase II Fusion DNA بوليميرازأجيلينت6006754C
IGEPAL CA-630SigmaI3021-50ML4C
Knockout DMEM10829018
L-glutamineGibco25030081زراعة الخلايا
MboINEBR0147M4C
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140050زراعة الخلايا
N2 ملحقGibcoA1370701زراعة الخلايا
NEBNext مكتبة الحمض النووي الإعداديةNEBE60404C
NEBuffer 2.1NEBB7202S4C / الهضم
الوسط العصبيالقاعدي Gibco21103049زراعة الخلايا
PD0325901Selleck ChemicalsS1036زراعة الخلايا
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140122زراعة الخلايا
Proteinase KNEBP8107S4C
Qubit 4 FluorometerThermoFischerQ332384C
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFischerQ328514C
RNase AThermoFischerEN05314C
محلول بيروفات الصوديومGibco11360070زراعة الخلايا
كاشف تفكك الخلايا StemPro AccutaseGibcoA1110501زراعة الخلايا
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202S4C
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBM0202M4C
المتوسطة

المراجع

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Martello, G., Smith, A. The nature of embryonic stem cells. Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  4. Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).
  5. Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International. 2012, 738910(2012).
  6. Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).
  7. Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).
  8. Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).
  9. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  10. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  13. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  14. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  15. Lettice, L. A., et al. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  19. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  20. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  21. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  22. van de Werken, H. J., et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).
  23. Schwartzman, O., et al. UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling. Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).
  24. Tian, T. V., et al. Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification. Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).
  25. Chen, H., et al. Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity. Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).
  26. Apostolou, E., et al. Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).
  27. de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).
  28. Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. 4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis. Methods. , (2019).
  29. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  30. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  31. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

4C T Pou5f1
تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.