الاستئصال الليزري القائم على المجهر والتجدد في خلايا الحمار الوحشي Interneuromast

ملخص

الاستئصال بالليزر هو تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة التجديد في النظم البيولوجية. يصف البروتوكول المعروض استخدام مجهر confocal المسح الضوئي بالليزر القياسي للاستئصال بالليزر والتصوير اللاحق للفاصل الزمني للخلايا المُتدرِّب في الخط الجانبي للحمار الوحشي.

الملخص

خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تتوسط في الشعور بالسمع. لا تتجدد هذه الخلايا بعد تلف البشر، ولكنها تتجدد بشكل طبيعي في الفقاريات غير الثديية مثل الحمار الوحشي. نظام خط الوحشية الجانبي هو نموذج مفيد لتميز تجديد خلايا الشعر الحسية. يتكون الخط الجانبي من أعضاء تحتوي على خلايا الشعر تسمى الاعصاب، والتي ترتبط معا من قبل سلسلة من الخلايا الأرتورومية (INMCs). تعمل INMCs كخلايا سلف تؤدي إلى ظهور اعصاب جديدة أثناء التطوير. يمكن للـ INMCs إصلاح الثغرات في نظام الخط الجانبي الذي تم إنشاؤه بواسطة موت الخلايا. وهناك طريقة موصوفة هنا للاستئصال الانتقائي للفحص في الميك أو الميك أو الميكون باستخدام مجهر خلطات تقليدية مسح الليزر والأسماك المعدلة وراثياً التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الـ INMCs. ثم يتم استخدام المجهر الفاصل الزمني لمراقبة تجديد INMC وتحديد معدل إغلاق الفجوة. وهذا يمثل بروتوكولاً يمكن الوصول إليه لاجتثاث الخلايا لا يتطلب معدات متخصصة، مثل ليزر فوق البنفسجي النبضي عالي الطاقة. قد يخدم بروتوكول الاستئصال مصالح أوسع، حيث قد يكون مفيدًا في إزالة أنواع الخلايا الإضافية، باستخدام مجموعة أدوات متوفرة بالفعل للعديد من المستخدمين. وستمكن هذه التقنية من توصيف تجديد الـ INMC في ظل ظروف مختلفة ومن خلفيات جينية مختلفة، مما سينهض بفهم تجديد الخلايا الناذرة الحسية.

المقدمة

في جوهر فقدان السمع الأكثر تقدمية يكمن في تدمير خلايا الشعر الحسية، التي تنقل المحفزات السمعية الخارجية إلى نبضات عصبية يمكن اكتشافها من قبل الدماغ. يسبب موت خلايا الشعر القوقعة فقدان السمع الدائم، حيث تفتقر الثدييات البالغة إلى القدرة على تجديد هذه الخلايا بعد الضرر. وعلى العكس من ذلك، يمكن للفقاريات غير الثديية مثل سمك الحمار الوحشي تجديد خلايا الشعر المفقودة بسبب الصدمة الصوتية أو الإهانة السامة للثدي. خط الحمار الوحشي ميانوسنسنسوري الجانبي هو نظام الجهاز بسيطة والتلاعب بها بسهولة التي يمكن استخدامها لدراسة تجديد خلايا الشعر^1,2,3.

يتكون الخط الجانبي من بقع حسية صغيرة تسمى الزمرات العصبية ، والتي ترتبط أثناء التطوير بواسطة سلسلة من الخلايا الممدودة المعروفة باسم الخلايا الأرومية (INMCs). نظرا لقدرتها على الانتشار كخلايا جذعية واضحة تؤدي إلى ظهور أجهزة جديدة تحتوي على خلايا الشعر ، فإن سلوك INMCs له أهمية كبيرة للمجتمع^4،5. وقد اتسم الكثير من البحوث المتعلقة INMCs قمع انتشارها من قبل الخلايا شوان القريبة التي تلتف حول العصب الخط الجانبي، على الأرجح من خلال مثبطات لإشارات Wnt/β-catenin. ^6,7,8. وفي حين أن تنظيم انتشار الـ INMC والتمايز إلى أشكال عصبية جديدة قد تم وصفه بشكل جيد، فإن الآليات التي تحكم نمو INMC بعد الاستئصال لم يتم توضيحها. هذا البروتوكول بمثابة وسيلة لـ ablating INMCs الفردية وتحليل سلوكهم التجدد اللاحقة.

وقد نشرت مجموعة متنوعة من الطرق لتدمير خلايا الشعر، والخلايا الداعمة، وs neuromasts بأكملها، جنبا إلى جنب مع منهجيات لرصد الانتعاش. الاجتثاث الكيميائي يعمل بشكل جيد لخلايا الشعر، ولكن جرعات من المواد الكيميائية السامة مثل CuSO₄ يجب أن تزيد بشكل كبير لإزالة أنواع الخلايا الخط الجانبي الأخرى⁹. وفي حين أن الاستئصال الكهربائي تحت المجهر المفلور هو وسيلة فعالة وبسيطة لتدمير الـ INMCs لدراسة التجديد، فمن الصعب استهدافه بشكل ضيق، ومن المرجح بالتالي أن يؤدي إلى أضرار جانبية كبيرة. ونتيجة لذلك، يمكن أن يخفي هذا جوانب من السلوكيات الخاصة بـ INMC^10,11. وقد استخدمت بروتوكولات الاستئصال بالليزر، ولكنها تتطلب استخدام معدات متخصصة غير موجودة بالضرورة في المختبر العادي أو مرفق التصوير (أي أشعة الليزر النبضية عالية الطاقة^12). ويمكن تنفيذ الطريقة المذكورة هنا مع أي مجهر بالليزر المسح confocal مجهزة ليزر 405 نانومتر المشتركة، وعادة ما تستخدم لتصوير DAPI وغيرها من الفلوروفوريس الزرقاء. ومن مزايا هذه الطريقة أن التصوير confocal يمكن أن يؤدي مباشرة قبل وبعد تلف الخلايا دون إشراك أي أنظمة تحكم الليزر إضافية أو نقل إلى مجهر آخر مجهزة ليزر نبضي.

وقد وصفت طريقة مماثلة للخلايا العصبية ablating في الحبل الشوكي حمار وحشي¹³. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب السابق وحدة نمطية FRAP لاجتثاث الخلية، وهو ليس مطلباً لهذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ونظرا لخصائص متميزة لأنواع مختلفة من الخلايا (أي سطوع الفلورس عبرجين، عمق داخل الجسم، وشكل الخلية)، فمن المرجح أن تكون هناك حاجة إلى تعديلات كبيرة اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. البروتوكول مفصلة هنا هو أكثر عرضة لتكون فعالة للخلايا أكثر سطحية، كما يدعمها مظاهرة من الاستئصال الخلوية الشعر الحسية باستخدام نفس الطريقة. كما تم توضيحها هو فحص التجديد لتقييم معدلات الانتعاش INMC بعد الاجتثاث، والتي لم تكن سمة من سمات الدراسة المذكورة أعلاه.

بروتوكول استئصال الخلايا القائم على الليزر المفصل هنا يلتقط القدرة التجديدية للـ INMCs من خلال تحسين ظروف الليزر والتصوير قبل والاستئصال بعد الاستئصال والمجهر الفاصل الزمني. هذه العناصر معا لتصوير شامل INMC إعادة النمو وإغلاق الفجوة في مجملها. بينما يتم استخدام هذا البروتوكول هنا لتدمير INMCs، فإنه يمكن تطبيقه على عمل آخر يتطلب تقييمًا موثوقًا وفعالًا للاستئصال الخلوي. بل هو أيضا تكنولوجيا يمكن الوصول إليها، لأنه يمكن إجراؤها على أي مجهر confocal مجهزة ليزر 405 نانومتر.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الحيواني المؤسسية لجامعة بيس بموجب البروتوكول 2018-1.

1- إعداد يرقات أسماك الحمار الوحشي

1. إعداد التزاوج 3-5 أيام قبل إجراء التجربة، بحيث تكون اليرقات 2 يوما بعد الإخصاب (dpf) إلى 4 dpf في العمر عندما شنت للاستئصال بالليزر.
   ملاحظة: وEt(krt4:EGFP)sqEt20 (مختصرة كما ET20) خط فخ محسن، الذي يتم تصنيف خلايا interneuromast بوضوح مع تعزيز البروتين الفلورسنت الخضراء (eGFP)، يسمح لتحديد الخلية سهلة نسبيا والاستئصال^11،14. لتأكيد خصوصية الاجتثاث بالليزر والمرونة ، يتم تربيتها ET20 الأسماك مع TG (neuroD:tdTomato) الأسماك ، التي وصفت عصب الخط الجانبي مع البروتين الفلورسنت الأحمر أو مع TG (myo6b: βactin -GFP) لتسمية خلايا الشعر الحسية مع GFP^15،16.
2. بعد جمع الأجنة في اليوم التالي، احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية في E3 المتوسطة التي تحتوي على 0.0001٪ الميثيلين الأزرق حتى جاهزة ل التخدير وجبل.

2. إعداد حلول agarose وtricaine الغيلينغ المنخفضة

1. إلى قارورة 250 مل زجاج Erlenmeyer، إضافة 48 مل من 1X E3 المتوسطة، 2 مل من 15 mM tricaine الأسهم الحل، و 0.5 غرام من أغاروز منخفضة الذوبان.
2. الميكروويف الحل على ارتفاع لمدة 30 ق ودوامة (ارتداء قفازات واقية من الحرارة) إلى حل agarose. كرر دورات التدفئة 30 s حتى يتم حل agarose تماما.
3. تخزين agarose في حاضنة ساخنة إلى 42 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

3- تخدير يرقات أسماك الحمار الوحشي

1. إلى أنبوب مخروطي 50 مل، أضف 24 مل من 1x E3 متوسطة و1 مل من محلول مخزون التريكائين (15 مل م) إلى تركيز نهائي يبلغ 600 ميكرومتر. دوامة لمزجها.
2. قم بتحميل واحدة من الآبار الستة لصفيحة استزراع الخلايا المسطحة ذات القاع مع 8 مل من E3 تحتوي على 600 ميكرومتر تريكايين.
3. استخدام ماصة نقل لنقل يرقات حمار وحشي في 74 μm شبكة القاع إدراج نقل.
4. نقل إدراج شبكة القاع في بئر من لوحة ستة جيدا تحتوي على حل E3 + tricaine. السماح لليرقات بالبقاء في البئر لمدة 3 دقائق كحد أدنى أو حتى تخدير كامل. اختبار التخدير عن طريق النقر على إدراج. اليرقات لا ينبغي أن تذهل وتسبح استجابة للصنبور.

4- فحص الفلورسنت ليرقات أسماك الحمار الوحشي المُخَدَّرة

1. الماصات واحدة اليرقة تخدير في البئر على 12 شرائح مغلفة جيدا مغطى بالدهر للفحص. تأكد من وجود انحناء الحد الأدنى من الغضروف المفصلي الذي تم تشكيله في كل بئر من الشريحة لتقليل التشويه البصري عند الفحص. ويمكن القيام بذلك عن طريق إزالة حجم صغير من E3 من كل بئر بعد وضع اليرقات.
2. تحت هدف 10x على مجهر مستقيم (مجهزة بمصباح قوس زئبق، مصباح معدني هاليد، أو مصدر ضوء LED ومكعب مرشح مناسب)، شاشة لليرقات التي تعبر عن eGFP في الزمرة العصبية والخلايا الدّورومية في نظام الخط الجانبي.
   1. حدد اليرقات مع التعبير أقوى مما أدى إلى eGFP أكثر إشراقا، والتي يفترض أن تكون homozygous لtransgene.
      ملاحظة: في خط ET20، يتم التعبير عن eGFP في حلقة من خلايا العباءة المحيطة بكل ورم عصبي وكذلك الشريط الضيق للخلايا الدكورية التي تربط هذه الأعضاء. إن التعبير الأقوى eGFP (التألق الأكثر إشراقًا) يساهم في الاستئصال الأكثر فعالية.
   2. لدراسة خصوصية الاجتثاث، استخدم يرقات مزدوجة المحورة وراثيا مع كل من ET20 و Tg (neuroD:tdTomato) transgenes. إذا كان فحص لناقلات (العصبية: tdTomato) ، استخدم مكعب مرشح RFP لتحديد التصحيح الأحمر مشرق فقط الخلفي للأذن التي تمثل العقدة الخط الجانبي الخلفي.
   3. لتسهجين خلايا الشعر في الأحرف العصبية الخط الجانبي، استخدم Tg(myo6b:βactin-GFP) محورة وراثياً وشاشة لتوطين GFP في وسط كل من الزمرة العصبية.
3. حدد اليرقات التي لها تباعد نمطي للـ neuromasts. قد تشير الاختلافات في المباعدة بين السحيق العصبي إلى ترسب عصبي غير طبيعي أثناء التطوير ، مما يشير إلى سلوك مهاجر معيب أو انتشار الخلايا في الخط الجانبي البدائي^17. وقد تؤثر هذه العيوب أيضاً على سلوك المهاجر أو التجديدي للـ INMCs بعد الاستئصال.
   ملاحظة: تشمل العيوب الشائعة في التباعد مسافة كبيرة بشكل غير عادي بين الجزء الأمامي الأكثر عصبية التي أودعها أول بدائي مهاجر (prim1L1) وثانية عصبية أودعها نفس البدائية (prim1L2)، وغالبا ما ترتبط مع اكتظاظ من الاعصاب أكثر الخلفي.

5. اليرقات المتصاعدة للاستئصال بالليزر والتصوير

1. الماصات 3 - 4 يرقات تخدير في قطرة صغيرة من محلول E3/tricaine في وسط طبق زلة سفلي للغطاء (طبق 35 مم مع عدد 14 مم 1.5 غطاء). إزالة حل الزائدة بحيث تبقى اليرقات في قطرات صغيرة، فقط كبيرة بما يكفي لاحتوائها.
2. نقل الطبق إلى مرحلة المجهر ستيريو مناظير والتلاعب التكبير والتركيز بحيث تكون جميع اليرقات في مجال الرؤية.
3. إزالة قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على نقطة انصهار منخفضة agarose من الحاضنة ساخنة. استخدام ماصة نقل لنقل agarose حل على شريحة الغطاء لإنتاج طبقة رقيقة. سحب agarose الزائدة حتى السائل يملأ فقط البئر في الجزء السفلي من الطبق، مع الحرص على عدم التعرق أي يرقات.
4. ترتيب بسرعة اليرقات في حل agarose باستخدام سكين الشعر أو حلقة الشعر بحيث يتم محاذاة مع بعضها البعض وتوجه مع الرسترالية إلى اليسار.
5. اضغط بلطف على اليرقات إلى أسفل ضد الزجاج بسكين الشعر ، بحيث تقع في ملف التعريف مع جانبها الأيمن إلى أسفل. اليرقات الأكبر سنا من 3 dpf تميل إلى تعويم بسبب المثانة السباحة المتضخمة، لذلك قد تحتاج إلى أن تضغط مرارا وتكرارا أسفل ضد الزجاج حتى يبدأ agarose هلام.
6. بعد حوالي 60 s سيبدأ agarose في ترسيخ ، ولن تتمكن اليرقات من إعادة توجيهها. السماح لحوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لأغاروز على زلة الغطاء لترسيخ تماما. مرة واحدة وقد توطد agarose، واستخدام ماصة نقل لملء الطبق في منتصف الطريق مع E3 تحتوي على 1x tricaine.

6- تحديد الأهداف المحتملة والتصوير قبل الاستئصال

1. قم بتشغيل الطاقة إلى نظام المجهر الميكوني المسحي بالليزر و تهيئة من خلال برنامج التصوير المتكامل. حدد 63x خطة-Apochromat النفط الغمر الهدف (الفتحة العددية 1.40) أو ما شابه ذلك. تطبيق زيت الغمر وتأمين الطبق في مرحلة دائرية إدراج بحيث وجه اليرقات مع الجانب من جانبها على اليسار.
2. تحت إنارة تباين التداخلات الساطعة أو التفاضلية، حدد إحدى اليرقات المثبتة للتصوير. ضبط التركيز مع مقبض التركيز بحيث الجلد على جانب السمك الأقرب إلى غطاء هو في التركيز، يمكن التعرف عليها من قبل نمط بصمات الأصابع من الخلايا حول الدمرة.
3. مرة واحدة في التركيز، والتحول إلى الإضاءة epifluorescent في قناة GFP. حدد موقع الخط الجانبي الخلفي بواسطة تعبير GFP على طول myoseptum الأفقي. تشير حلقات الخلايا الفلورية إلى خلايا عباءة الورم العصبي ، وخيوط الخلايا الممدود هي خلايا interneuromast.
4. بدءا منstst primIL1، وتقع عادة مجرد الظهر إلى صفار، واستخدام عصا التحكم في مرحلة أو غيرها من مرحلة التحكم في الحركة لمسح بصريا caudally على طول myoseptum الأفقي.
   1. اتبع سلسلة من الخلايا الزناة حتى الوصول إلى المنطقة بين primIL3 وprimIL4 (L3 و L4) العصبية(الشكل 1A).
      ملاحظة: يمكن أيضاً استهداف مناطق أخرى، ولكن هذا القسم من الجذع والذيل يميل إلى أن يكون الأقرب إلى الزجاج غطاء، وبالتالي، الأكثر قابلية للاستئصال.
   2. إذا كان تصوير عدة يرقات، تعيين موقف المرحلة الأولى، ثم إلغاء تنشيط خيارات مواضع المرحلة المتعددة عن طريق إلغاء تحديد خانة الاختيار المناسبة.
   3. كرر الخطوات 6.4.1-6.4.2. لكل موضع المرحلة المطلوبة (كل يرقة).
5. وبعد تحديد أجسام الخلايا في منطقة L3-L4، انتقل إلى وضع الاكتساب.
   1. قم بتنشيط مسار تصوير GFP باستخدام الليزر 488 نانومتر أو 491 نانومتر.
   2. إضافة ضوء المرسلة (أنبوب الmultiplier الضوء المنقولة أو T-PMT) قناة إلى تنشيط 488 نانومتر مسار الليزر عن طريق تفعيل مربع الاختيار T-PMT تحت القائمةالمنسدلة "إعداد التصوير".
   3. تعيين قوة الليزر إلى 6٪، حجم الثقب إلى 1 مكافئ وحدة هوائية، واكسب رقمي إلى 750 ليرقات التصوير ET20. قد تختلف قوة الكسب والليزر الدقيقة لأي يرقة معينة ، اعتمادًا على مدى قربها من زلة الغطاء التي يتم تركيبها وسطوع الفلور. ضبط كسب مثل تلك الأجسام الخلية مشبعة لالتقاط التوقعات قاتمة خلاف ذلك و filipodia.
   4. ضبط المعلمات إلى حجم الإطار من 1024 بكسل × 1024 بكسل، التكبير الرقمي من 0.7 (145.2 μm × 145.2 μm حجم الصورة). تعيين متوسط إلى 2 لتحسين جودة الصورة.
6. تحقق من مربع z-المكدس لإحضار القائمة المنسدلة موضع ض. أثناء المسح السريع ، والتركيز حتى الخلايا interneuromast هي مجرد من التركيز. تعيين الشريحة الأولى، ثم التركيز من خلال العينة حتى خلايا interneuromast مرة أخرى خارج التركيز. تعيين الشريحة الأخيرة. تأكد من أنها تشمل مجموعة من z-المكدس حوالي 25 ميكرومتر. تعيين الفاصل الزمني للتصوير إلى 1 ميكرومتر.
7. بدء التجربة لالتقاط ما قبل الاستئصال ي كومة (الشكل 1B). إذا تمت إضافة مواضع المرحلة، إلغاء تنشيط خيار المواضع بحيث يتم تصوير الموضع الحالي فقط. حفظ الملف بمجرد التقاطه.

7. الاستئصال بالليزر من الأجسام الخلوية

1. انقر على "إظهار كافة الأدوات". يقع هذا الخيار في الجزء العلوي من واجهة الامتلاك.
2. انقر على القائمة المنسدلة لـ "التصوير إعداد ". في "إعداد التصوير"، انقر فوق " إضافةمسار جديد" (ممثلة باسم "+").
3. في "التصوير إعداد"، انقر على القائمة المنسدلة ل "صبغ". حدد DAPI كصبغة.
4. انقر على القائمة المنسدلة لـ"القنوات"ثم قم بإلغاء تحديد كافة المسارات الأخرى عن طريق إلغاء النقر على خانات الاختيار الخاصة بهم. تأكد من تحديد مسار DAPI فقط.
5. في المسار DAPI، انقر على 405ل"ليزر الإعداد". زيادة قوة الليزر إلى 75٪. قم بـ"إلغاء النقر فوق قناة DAPI" لإيقاف تشغيل الليزر أثناء المسح الضوئي للأجسام الخلية المرشحة للاستئصال.
6. مع الجسم من خلية interneuromast تركزت في مجال الرؤية، والتكبير في إطار المسح الضوئي إلى 20x-22x. قد تحتاج إلى ضبط موضع الإطار للحفاظ على جسم الخلية في الوسط كما يتم تطبيق التكبير. توقف عن المسح المباشر بمجرد أن يملأ جسم الخلية مجال الرؤية.
   ملاحظة: يجب أن يحتل جسم الخلية مجال العرض بأكمله. في هذا المستوى التكبير، سوف يبيض GFP بسرعة. تقليل وقت التعرض بالليزر عن طريق العمل بسرعة. استخدم التكبير بدلاً من تحديد منطقة ذات أهمية لزيادة توزيع طاقة الليزر على مساحة صغيرة.
7. تحقق من 405 نانومتر مربع مصراع الليزر لتنشيط المسار. ضبط قوة الليزر إلى 75٪. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 45 s. قم بتنشيط المسح الضوئي المستمر وابدأ تشغيل جهاز ضبط الوقت. توقف عن المسح الضوئي على الفور عند 45 s.

8. التصوير بعد الاستئصال والمجهر الفاصل الزمني لدراسة التجديد

1. انقر على القائمة المنسدلة لـ "قنوات". في القنوات، قم بإلغاء النقر على"DAPI"المسار إلى تعطيل الليزر الاستئصال. انقر على القائمة المنسدلة لـ "وضع الاستحواذ".
2. في وضع الاكتساب، انقر على "تكبير".
3. إنقاص التكبير/التصغير إلى 0.7 إما باستخدام شريط التمرير أو عن طريق الكتابة في"0.7."
   1. لضمان نجاح الاستئصال الخلية، وزيادة كسب إلى 900 وبسرعة مسح مجال الرؤية.
      ملاحظة: لا يجب أن يكون GFP مرئياً داخل الخلايا أو الخلايا المستهدفة. إذا كان لا يزال يتم ملاحظة الفلوريس، ارجع إلى الخطوات 7.1-7.3.
   2. باستخدام نفس أو ما شابه ذلك مثل تلك التي وصفت لتصوير ما قبل الاستئصال ، والتقاط وحفظ صورة ما بعد الاستئصال(الشكل 1C). إذا كشفت الصورة عن بقايا خلايا الفلورسنت أو أجسام خلايا إضافية تحتاج إلى إزالتها، كرر خطوات الاستئصال بالليزر لإنشاء فجوة مرئية في سلسلة خلايا الأورام الداخلية.
   3. فحص صورة قناة T-PMT للتأكد من حدوث تلف خلوي. سوف يكون للخلايا التالفة مظهر حبيبي، وكثيرا ما تنتفخ النوى أو تصبح غير منتظمة في الشكل (الشكل 2).
4. بعد التقاط صورة ما قبل الاستئصال، واستئصال الخلايا حسب الضرورة، والتقاط صورة ما بعد الاستئصال لكل موضع مرحلة فردية، قم بإعداد المجهر الفاصل الزمني عن طريق تنشيط كل من موضع المرحلة وخيارات الوقت لالتقاط الصور. تعيين معلمات الوقت إلى 24 ساعة أو آخر نقطة النهاية المطلوبة و 15 دقيقة الفواصل الزمنية. بدء التجربة للحصول على الصور وحفظ الملف الناتج عند اكتمال (في اليوم التالي).
5. إذا كان لليرقات أن تدرس أو ترفع أكثر، إزالتها بعناية من agarose باستخدام ملقط غرامة، ثم نقل إلى E3 المتوسطة دون tricaine للانتعاش. إذا لم يتم استخدامها أكثر من ذلك ، euthanize وفقا للبروتوكول الحيواني المعتمدة (الغمر السريع والمستمر في حمام الجليد هو وسيلة شائعة) والتخلص منها على النحو المطلوب من قبل المؤسسة.

9. تحليل الصور

1. فتح ملف بعد الاستئصال z-المكدس في برنامج معالجة الصور المفضلة(جدول المواد). تقسيم القنوات بحيث تكون كل قناة في جزء عرض منفصل.
2. في إطار قناة GFP، استخدم أداة الخط لرسم خط مستقيم بين نصائح INMCs المتبقية. قد يكون هذا المساعدة عن طريق التمرير لأعلى و أسفل خلال مكدس z أو عن طريق تنفيذ إسقاط كثافة الأقصى قبل رسم الخط.
3. استخدم أداة"قياس"للحصول على المسافة بين نهايات INMC في طائرات س و ص.
4. قم بالتمرير عبر شرائح z في مكدس z الأصلي لتحديد المسافة بين INMCs في المستوى z.
5. احسب المسافة الإجمالية بين نهايات INMC باستخدام نظرية فيثاغورس⁽² + ب² = ج²). الوتر هو المسافة الإجمالية (أو حجم الفجوة).
6. أدخل قياس المسافة الناتجة في تطبيق جدول بيانات لتحليل البيانات.
7. راجع ملفات المجهر الفاصل الزمني التي تم جمعها في الخطوة 8.2-8.3 باستخدام إما برنامج التصوير المتكامل على نظام confocal أو برامج تحليل الصور المتاحة بحرية. تحديد النقطة الزمنية التي تم ملء الفجوة بين الخلايا التوريورومية في من قبل إسقاط الخلايا. ويمكن أن يساعد ذلك بفحص شرائح z متعددة لتأكيد إغلاق الفجوة في جميع الأبعاد.
8. لتحقيق أدق قياس للوقت لإغلاق الفجوة، استخدم ختم وقت الصورة بعد الاستئصال (مرئي في Finder أو مستكشف الملفات) كنقطة زمنية صفر؛ قد يؤدي قياس الوقت من بداية كومة الصور الفاصل الزمني إلى تقليل الوقت إلى الإغلاق ، اعتمادًا على مقدار الوقت المنقضي أثناء وضع موضع مرحلة إضافية ، إلخ.
9. اشتقاق معدل الإغلاق ببساطة عن طريق قسمة حجم الفجوة الأصلي (μm) على الساعات أو الدقائق اللازمة لإغلاق الفجوة كاملة.

النتائج

من أجل اخصاء INMCs وتسجيل التجديد ، تم تركيب يرقات حمار وحشي مُفَرَّبة من GFP للخط المعدل وراثيا ET20 في يومين أو ثلاثة أيام بعد الإخصاب للاستئصال على النحو المبين في الخطوة 5-4. يمكن تركيب العديد من الأسماك في وقت واحد بحيث يمكن التقاط هفوات زمنية متعددة في تجربة واحدة. تم تحديد منطقة الخط الجانبي الواقع بين primIL3 وprimIL4 العصبية primIL4، والتقطت صور ما قبل الاستئصال كما هو موضح في الخطوات 6.5-6.7(الشكل 1A, B).

تم استهداف ثلاث أجسام خلايا للاستئصال بالليزر لخلق فجوة في سلسلة INMC تبلغ حوالي 40 ميكرومتر. وأكد المسح بعد الاجتثاث مع مكاسب عالية والتصوير اللاحق أن لا توجد أجسام الخلايا لا تزال في المنطقة المائلة، وترك فجوة بين الإسقاطات ممدود من INMCs المجاورة (الشكل 1C). وقد ثبت أيضا موت الخلايا من خلال فحص قناة T-PMT بعد الاستئصال. تم وضع علامات على الخلايا التالفة والمحتضرة من قبل تورم وعلى شكل غير منتظم النوى وكذلك مظهر الحبيبية(الشكل 2، المبينة). في بعض الحالات، كشف التصوير الفاصل الزمني أيضًا عن تجنيد خلايا الأميبيدة الكبيرة التي كانت على الأرجح عبارة عن تانفيس(الشكل 2، العلامة النجمية). أشارت المناطق المظلمة المحيطة بـ INMCs المموجة إلى الاحتراق الضوئي في خلايا محيط الدم فوقية. ولم تظهر هذه الخلايا أنها تضررت أو تُدمَّر بسبب التشعيع بالليزر في هذه التجارب؛ بدلا من ذلك ، تم تخفيض الفلوريس بشكل مؤقت. يكشف المجهر الفاصل الزمني أن هذه الخلايا عادة ما تتعافى بعد الاستئصال ولا تغير الشكل أو تظهر على خلاف ذلك معطوبة (النتائج غير المنشورة، Volpe et al.).

لدعم خصوصية تدمير INMC ، تم إجراء عمليات الاستئصال في يرقات ET20 و Tg (neuroD:tdTomato) التي يتم فيها تسمية عصب الخط الجانبي (الذي يعمل فقط ميكرون أسفل الخلايا الدربية) بالبروتين الفلوري الأحمر. الاجتثاث من عدة خلايا التي خلقت فجوات كبيرة في سلسلة INMC كان لها تأثير ضئيل أو معدوم على العصب الخط الجانبي على أساس الفلوريسين الأحمر(الشكل 3). وقد تجلت مرونة تقنية لخلايا مُترجم سطحيًا من خلال التدمير الانتقائي لخلايا الشعر الحسية الفردية داخل الزمرات العصبية للخط الجانبي. باستخدام أساسا نفس البروتوكول مفصلة أعلاه (القسمين 7 و 8)، تم تدمير خلايا الشعر المفرد في Tg (myo6b:βactin-GFP) دون ضرر واضح للخلايا المجاورة(الشكل 4). لم خلايا الشعر مُلَجَّحة لم تسترد الفلورنس بعد المجهر الفاصل الزمني، وكانت نوياتها محببة بشكل ملحوظ ومشتاغبة بعد التعرض بالليزر(الشكل 4B). وعلى غرار عمليات الاستئصال التي يقوم بها المركز الوطني للأشعة والأشعة، كثيراً ما تم توظيف الضامة الظاهرة في موقع التعرض بالليزر (النتائج غير المنشورة Volpe et al.).

بعد الاستئصال بالليزر والتقاط صورة ما بعد الاستئصال، تم قياس حجم الفجوة باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة بحرية. أظهرت أداة القياس أحجام الفجوة التي تتراوح بين بضعة ميكرونات تصل إلى 100 ميكرون ، اعتمادًا على عرض INMCs الفردية وعدد الخلايا التي تم اختيارها للاستئصال(الشكل 5). تم استخدام المجهر Timelapse لتسجيل السلوكيات INMC أثناء التجديد. في 50 تجربة، 15 فجوات (30%) أغلقت عن طريق التجديد خلال فترة 24 ساعة. وفي معظم الحالات، قام هذا النظام في غضون الساعات الأولى من التصوير. تم تعريف الاسترداد بأنه النقطة الزمنية التي وصلت فيها الإسقاطات من الخلايا المجاورة إلى تلامس، والتي حدثت 16 ساعة بعد الاستئصال لفجوة تبلغ حوالي 40 ميكرومتر(فيلم 1). تم فحص رصات Z بعناية للتأكد من أن الاتصال الخلوي الخلوي حدث داخل طائرة واحدة من المستوى z ، وتجنب القطع الأثرية المحتملة بسبب الإسقاطات z. وكشف تحليل التحوف اللوجستي أن احتمال إغلاق الفجوة يرتبط بحجم الفجوة (p = 0.0453)، مع احتمال أكبر للشفاء من الثغرات الأصغر حجماً. وأسفرت فجوة 55.5 ميكرومتر عن احتمال إغلاق 50%(الشكل 5).

وفي 70 في المائة من الحالات، لم يتمكن الـ INMCs من سد الفجوة التي نشأت عن الاستئصال تماماً. ومع ذلك ، حتى في هذه الحالات كنا قادرين على رصد تشكيل التوقعات الطويلة من INMCs المجاورة ، والتي تشبه في بعض النواحي توسيع مخاريط النمو العصبي(فيلم 2). وبالتالي، يمكن أن توفر هذه التجارب أيضا نظرة ثاقبة في سلوكيات INMCs بعد الضرر.

الشكل 1: الاستئصال الانتقائي للخلايا الزائدة عن طريق التشعيع بالليزر. (أ)تم اختيار الخلايا المُتدرِّبَة بين الأورام العصبية primIL3 وprimIL4 للاستئصال. تعرض هذه الخلايا شكل مغزل مميز مع إسقاطات ممدود متداخلة مع أجسام الخلايا المجاورة. (ب) التصوير قبل الاستئصال تحديد الأجسام الخلية التي يمكن أن تكون مراوغة لإنتاج فجوة. (ج)يؤكد التصوير بعد الاستئصال نجاح الاستئصال كما يدل على ذلك عدم وجود أجسام الخلايا في منطقة الفجوة. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصوير بعد الاستئصال يوضح موت الخلايا استجابة للتعرض بالليزر في الخلايا المُدرِّبِةِ في GFP. يشير التصوير المُرسل للضوء (T-PMT) إلى وجود خلية نخرية ذات مظهر حبيبي (مطوقة) بالإضافة إلى تجنيد خلايا غير منتظمة الشكل من المحتمل أن تكون عبارة عن خلايا إنارة (*). يؤكد دمج قنوات GFP وT-PMT أن موت الخلية ونشاط الضامة حدث في موقع الاستئصال. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: خصوصية استئصال الأورام الزائدة. (أ)قبل الاستئصال GFP المسمى الخلايا المُضنِع (الأخضر) و tdTomato المسمى العصب الخط الجانبي (أحمر) في Tg مزدوجة المحورة وراثيا (ET20؛ NeuroD:tdTomato) يرقة. تم استهداف أجسام الخلايا على مقربة من عصب الخط الجانبي للاستئصال. (ب)التصوير بعد الاستئصال يدل على الاستئصال من الأجسام الخلية المستهدفة مع عصب خط الجانبي سليمة. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: استئصال خلايا الشعر الحسية باستخدام المجهر confocal. (أ) التصوير قبل الاستئصال حددت GFP المسمى خلية الشعر الحسية (*) المستهدفة للاستئصال في مزدوجة المعدلة وراثيا Tg(ET20; myo6b:βactin-GFP) حمار وحشي. يُكشف التصوير المُرسل للضوء المُنْقل (T-PMT) عن مورفولوجيا خلايا الشعر الطبيعية، مع مقطع عرضي دائري. (ب)التصوير بعد الاستئصال يؤكد نجاح استئصال خلية الشعر المستهدفة. تشير صورة T-PMT إلى عدم انتظام في شكل خلايا الشعر وزيادة الحبيبات بعد التعرض بالليزر ، مما يشير إلى موت الخلايا بدلاً من الاحتراق الضوئي. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: نماذج الانحدار اللوجستية احتمال إغلاق الفجوة كدالة لعرض الفجوة (بالميكوم). ويمثل الرقم 0 إغلاق الفجوة الكامل، في حين أن الدرجة 1 تمثل إغلاق الفجوة غير المكتملة. وتشير النتائج إلى أن تأثير عرض الفجوة على قدرة الخلايا الأرومية على سد الثغرات ذات الصلة له دلالة إحصائية (p = 0.0453, n = 24 total; n = 12 الفجوات المغلقة, n = 12 فجوات مغلقة بشكل غير كامل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1: المجهر الفاصل الزمني مما يدل على إغلاق الفجوة (~ 40 ميكرومتر) بعد 16 ساعة. تم التقاط الصور كل 15 دقيقة، وتم إجراء إسقاط z أقصى كثافة لجميع نقاط الوقت. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيلم 2: المجهر الفاصل الزمني من فجوة INMC التي لم تغلق. وتظهر الإسقاطات الممدودة والمتفرعة للبلدان غير المُكمّلة المتبقية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

المناقشة

يصف البروتوكول طريقة متعددة الاستخدامات لاجتثاث الخلايا بالليزر التي يمكن إجراؤها على أي مجهر خلطي مجهز بالليزر شبه فوق البنفسجي (طول موجي 405 نانومتر). يتناول هذا البروتوكول قيود الأساليب المستخدمة سابقاً مثل الاستئصال الكهربائي (الذي يسبب أضرارًا أكثر انتشارًا¹¹⁾والاستئصال النبضي بالليزر للأشعة فوق البنفسجية (الذي يتطلب معدات متخصصة إضافية^12). قبل وما بعد الاستئصال التصوير confocal تقديم ردود فعل سريعة بشأن نجاح التجربة. يقدم المجهر الفاصل الزمني اللاحقة مقايسة بسيطة للتجديد في نوع الخلية الحرجة لتطوير النظام الحسي.

ومن الأهمية بمكان أن يتم إجراء فحص مسبق للسمك الوحشي المعدل وراثياً الذي يعبر عن GFP بقوة في سحيقات الأعصاب و INMCs. اليرقات مع الفلوري مشرق والمباعدة حتى تقريبا من الاعصاب المشتقة من الطراز الأولي هي المرشحين المثاليين للاستئصال بالليزر. حتى في هذه الأسماك، هناك أحياناً باهتة INMCs التي قد في أول كشف الهروب. يمكن أن تبقى هذه الخلايا وراء بعد الاستئصال بالليزر، ومنع تشكيل فجوة حقيقية بين INMCs. وينبغي تعديل الكسب الرقمي للكشف عن هذه الخلايا المختف أثناء التصوير قبل الاستئصال بحيث يمكن أيضا أن تكون مستهدفة مع الليزر 405 نانومتر (الخطوة 8.2).

وبالمثل، فإن استهداف الليزر في بعض الأحيان لن يدمر الخلية بالكامل؛ بل سيدمر الخلايا بشكل كامل. بدلا من ذلك ، فإنه سيتم تبييض الفلوريسنس ، مما أدى إلى فشل في خلق فجوة حقيقية. هذه الخلايا سوف تزيد عموما في الفلوريسنس أثناء المجهر timelapse. يساعد التعديل في عملية التصوير بعد الاستئصال مع التصوير T-PMT(الشكل 2)على ضمان إزالة جميع الخلايا المستهدفة بشكل فعال. فإنه يتطلب بشكل متكرر اثنين أو ثلاثة الاجتثاثات الخلية الفردية لإنتاج فجوة في سلسلة INMC. يمكن الكشف عن موت الخلايا عن طريق blebbing أو مظهر محبب في الخلايا المستهدفة؛ على الرغم من أن هذا قد يتطلب فترة انتظار قصيرة بعد استهداف الليزر (وفي بعض الحالات ، يتم ملاحظة شخصيات مُنقبة أو نخرية بعد ذلك بوقت قصير).

ومن القيود التي يفرضها هذا الإجراء أنه قد يتطلب إجراء تجارب تجريبية متعددة قبل أن يتم تحسين ظروف الليزر ونجاح تجديد INMC. قد تتطلب قوة الليزر ووقت الإقامة الكلي لليزر كل تعديل طفيف لعينات مختلفة. وقد وجد أن تطبيق الليزر المفرط يمكن أن يضعف قدرة الخط الجانبي لإصلاح نفسه. وهذا يشمل كلا من 1) التعرض المفرط للخلايا الفردية للإشعاع بالليزر، ويفترض أن يسبب ضررا إضافيا للأنسجة المحيطة بها، وكذلك 2) استئصال خلايا كثيرة جدا في السلسلة، مما يؤدي إلى فجوة أكبر. يجب على المستخدمين تحقيق التوازن بين الخلايا تشعيع بما فيه الكفاية لضمان تدميرها وليس الإفراط في تعريض الخلايا، والتي يمكن أن تبطئ أو تمنع التجديد. مع الإعدادات المناسبة، فقد وجد أنه يمكن إزالة INMCs دون ضرر مرئي للأعصاب الخط الجانبي الخلفي، مما يشير إلى أن الأضرار الجانبية يتم تقليلها مع هذا البروتوكول على عكس الاستئصال الكهربائي¹¹. في أي حال من الحالات كانت العصبية الجديدة تشكل في الفجوة الملاحظة، ويفترض أن لأن العصب الخط الجانبي لا تزال سليمة والخلايا الدبقية الكامنة لا تزال وتمنع انتشار INMCs^6،7،8،11.

وقد ثبت أن هذه الطريقة من الاستئصال بالليزر confocal يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى أيضا، لا سيما في تلك الموجودة سطحيا داخل الحيوان بما في ذلك خلايا الشعر الحسية (الشكل 4). ويمكن استخدام بروتوكول مماثل لاستئصال خلايا الجلد لفحص إصلاح الجروح أو الخلايا العصبية لدراسات تجديد محور عصبي, كما سبق وصفه¹³. ومن المتوقع أن تصبح هذه التقنية إضافة مفيدة إلى الذخيرة التجريبية للمختبرات التي تمتلك مجهراً confocal ولكن لا معدات متخصصة أخرى للاستئصال بالليزر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
12 بئر PTFE الشرائح المطبوعة	علوم المجهر الإلكتروني	63425-05
15 ملي متر محلول مخزون التريكائين	Sigma	E10521	15 ملي مولار تريكايين في ماء التناضح العكسي
1X E3 + 600 & M Tricaine			مخفف 15 ملي مخزون Tricaine 25X في وسائط 1X E3
وسائط 1X E3			مخففة 60X E3 إلى 1X في ماء التناضح العكسي (16.7 مل / لتر)
60 × وسائط E3	جميع المكونات المشتراة من Sigma-Aldrich		34.4 جم كلوريد الصوديوم ، 1.52 جم كلوريد النيتروجين ، 5.8 جم كالسيطرية العاصيمة < الفرعي >2< / الفرعي >.2 ساعة < الفرعية >2 < / فرعي > ، 9.8 جم MgSO4< / sub>.7H2< / sub>0 في 1 لتر ماء التناضح العكسي
Bx60 مجهر مركب مع مضان مصباح قوس الزئبق	Olympus
LSM 700 مجهر متحد البؤر مجهز بالليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 555 أو 561 نانومتر Carl	Zeiss Microscopy، LLC		تم استخدام ليزر 5 ميجاوات 405 نانومتر للاستئصال ؛ تم إجراء الاستئصال والتصوير من خلال هدف 63x Plan-Apochromat مع NA 1.40
FIJI / ImageJ برنامج معالجة الصور	العديد من المساهمين		يمكن تنزيله في https://fiji.sc/
تشريح إبرة معدلة إلى سكين شعر	فيشر ساينتفيك	19010	تم لصق رمش على نهاية إبرة تشريح بمقبض خشبي
برنامج Microsoft Excel	Microsoft Corp.		أوراق Google هي بديل مجاني لأطباق Microsoft Excel
Glass السفلية مقاس 35 مم مع غطاء رقم 1.5 ، نافذة 20 مم	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	طبق بتري 35 مم ، نافذة زجاجية 20 مم
Immersol 518F زيت	الغمر فيشر Scientific	12-624-66A
منخفض التبلور Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
إدراج Corning Netwell مع شبكة بوليستر 74 um ، 24 مم إدراج	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio برنامج	Rstudio PBC		قابل للتنزيل في https://rstudio.com/
SMX-168-BL مجهر ستيريو	ماصة نقل موتي
	فيشر Scientific	13-711-7M
برنامج ZEN	Carl Zeiss Microscopy، LLC