مقالة منهجية

نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدجلي

17.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60998

⸱

أبريل 9, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن نصف سهل الاستخدام غزو القول للورم الأرومي الدبقي. هذا القول مناسب للخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي. كما يتم وصف ماكرو فيجي لسهولة تقدير كمية الغزو والهجرة والانتشار.

الملخص

ثنائية الأبعاد (2D) الثقافات الخلية لا تحاكي في نمو ورم الجسم الحي مرضية. لذلك ، تم تطوير نماذج كروية الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D). قد تكون هذه النماذج مهمة بشكل خاص في مجال الأورام العصبية. في الواقع، أورام الدماغ لديها ميل لغزو بيئة الدماغ صحية. نحن نصف هنا مثالية 3D الورم الأرومي الجليس spheroid القائم على القول أننا وضعت لدراسة غزو الورم. نحن نقدم جميع التفاصيل التقنية والأدوات التحليلية لتنفيذ هذا القول بنجاح.

المقدمة

في معظم الدراسات باستخدام خطوط الخلايا الأولية أو المتاحة تجاريا، يتم تنفيذ المقالات على الخلايا التي تزرع على الأسطح البلاستيكية كثقافات أحادية الطبقات. إدارة ثقافة الخلية في 2D يمثل عيوب، كما أنه لا يحاكي في بيئة الخلية 3D في الجسم الحي. في الثقافات 2D، سطح الخلية بأكملها هو على اتصال مباشر مع المتوسطة، وتغيير نمو الخلايا وتعديل توافر المخدرات. وعلاوة على ذلك، فإن سطح البلاستيك غير الفسيولوجي ة يثير تمايز الخلية1. وقد تم تطوير نماذج ثقافية ثلاثية الأبعاد للتغلب على هذه الصعوبات. لديهم ميزة محاكاة العمارة متعددة الخلايا وعدم تجانس الأورام2، وبالتالي يمكن اعتبارها نموذجًا أكثر ملاءمة للأورام الصلبة3. مورفولوجيا معقدة من spheroids يساهم في تقييم أفضل penetrance المخدرات والمقاومة4. عدم تجانس الورم في السفيرويد يؤثر على انتشار الأكسجين والمواد المغذية ، والاستجابة للعوامل الدوائية(الشكل 1A). يتم تغيير انتشار الأكسجين عندما يصل حجم السفيرويد إلى 300 ميكرومتر ، مما يؤدي إلى بيئة نقص الأكسكة في وسط السفيرويد(الشكل 1A ، C). الأيض هي أيضا أقل اختراق من خلال طبقات الخلية وردود الفعل الأيضية التعويضية تجري5. عندما يزيد قطر السفيرويد ، يمكن ملاحظة النوى النخرية ، مما يزيد من محاكاة الخصائص الموجودة في العديد من أنواع السرطان الصلبة ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي سرطان الدماغ العدواني (GBM)6.

وقد تم الإبلاغ عن العديد من المقالات الغزو 2D أو 3D للورم الأرومي الدبقي في الأدب7,8. المقالات ثنائية الأبعاد هي أساسا لدراسة الغزو في مستوى أفقي على طبقة مصفوفة رقيقة أو في غرفة Boyden اقدر9. وقد وصفت المقالات ثلاثية الأبعاد مع الثقافات الكروية 3D باستخدام خطوط الخلايا الأرومية الكلاسيكية10. يتم تمثيل المتغيرات الأكثر تعقيدا من قبل غزو الاعضاء في الدماغ من قبل السفير الورم في الثقافات المواجهة11. ومع ذلك، لا يزال من المهم تطوير نسخة سهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ متاحة لأي مختبر. لقد وضعنا بروتوكولا لتوليد الخلايا الجذعية الورم الأرومي الدبقي من عينات المريض. يمكن التحكم بسهولة في القياس الكمي لهذه المقالات ويتطلب فقط برامج مفتوحة الوصول عبر الإنترنت. لفترة وجيزة، يتم قطع قطع الورم إلى قطع صغيرة وهضمها بشكل أنزيمي. تزرع الخلايا المفردة المشتقة من عملية الهضم في الوسط العصبي. بعد 4-7 أيام ، تتشكل هياكل السبرويد تلقائيًا. عند زرع داخل الجمجمة في نماذج الفئران ، فإنها تشكل أورامًا تعرض نواة نخرمحاطة بخلايا زائفة12. هذا يشبه إلى حد كبير الخصائص الموجودة في المرضى GBM.

في هذه المقالة، نحن نصف بروتوكولنا لإنتاج spheroids من عدد محدد من الخلايا لضمان الاستنساخ. يمكن استخدام مصفوفتين متكاملتين لهذا الغرض: Matrigel ونوع الكولاجين I. Matrigel يتم تخصيبه في عوامل النمو ويحاكي الغشاء القاعدي الثديي المطلوب للتعلق بالخلايا والهجرة. من ناحية أخرى ، الكولاجين من النوع الأول ، وهو عنصر هيكلي من ستروما ، هو المصفوفة خارج الخلية الرجفانية الأكثر شيوعًا ويستخدم في المقالات غزو الخلية. هنا، ونحن نوضح نموذجنا SPheroid GBM من خلال تنفيذ الهجرة والانتشار المقالات. تم إجراء التحليل ليس فقط في نقاط زمنية محددة ولكن أيضا عن طريق رصد توسع الخلايا وانتقال الخلايا عن طريق التصوير الحي. وعلاوة على ذلك، تم إجراء المجهر الإلكتروني لتصور التفاصيل المورفولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى (من مستشفى هوكيلاد، بيرغن، النرويج وفقا للوائح لجنة الأخلاقيات المحلية). يتبع بروتوكولنا المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسستنا.

1. توليد حجم موحد ورم spheroids

ملاحظة: يتم استزراع الخلايا الشبيهة بالجذع في وسط عصبي مكمل بملحق B27، الهيبارين، FGF-2، البنسلين، والعقديات، كما هو موضح في المواد السابقة12. هذه الخلايا تشكل تلقائيا spheroids في الثقافة.

  1. غسل الخلايا السرطانية مع 5 مل الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS) واحتضان الخلايا مع إنزيم التفكك 0.5-1 مل (انظر جدول المواد)لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
  2. يغسل مع 4-4.5 مل PBS وإضافة 10 مل من متوسط النمو الكامل (كامل الوسط العصبي، cNBM).
  3. عد الخلايا باستخدام تقنية العد التلقائي مع trypan الأزرق وشريحة غرفة العد الخلية.
  4. لتوليد 100 spheroids مع 104 خلايا لكل spheroid (وفقا للحجم المفضل)، مزيج 106 خلايا في 8 مل من NBM مع 2 مل من 2٪ ميثيل سيلولوز.
  5. نقل التعليق إلى وعاء نظام معقم والاستغناء 100 μL/well مع ماصة متعددة القنوات في لوحة قاع مستديرة 96 جيدا.
  6. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و الرطوبة 95٪. سوف تشكل spheroids متساوية الحجم ويمكن استخدامها بعد 3-4 أيام.

2. تجارب ثلاثية الأبعاد

  1. انتشار
    1. اعداد
      1. مثبطات تعليق (على سبيل المثال، الروتن كما هو الحال في الشكل 4A)والمواد الكيميائية في 100 ميكرولتر من المتوسط وإضافة إلى 100 ميكرولتر من المتوسط في كل بئر (أي واحد spheroid لكل بئر).
      2. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،و الرطوبة 95٪.
    2. الحصول على الصور وتحليلها
      1. التقاط الصور مع مجهر الفيديو في brightfield لخلق سلسلة من الظروف في T0 والأوقات التالية المتوقعة.
      2. استخدم فيجي لتحليل الصور إما يدويًا أو بطريقة شبه آلية. للقيام بذلك يدويا، رسم دائرة حول جوهر كرويويد مع أداة الاختيار الحر وقياس مساحة كل كرويرويد. لتحليل الصور بطريقة نصف آلية، استخدم الماكرو المعروض في المستند التكميلي 1 مع "المنطقة الأساسية فقط".
  2. الغزو
    1. اعداد
      1. إعداد مصفوفة الكولاجين في أنبوب على الجليد مع نوع I الكولاجين في 1 ملغ / مل التركيز النهائي، 1x PBS، 0.023xVالكولاجين،1 M هيدروكسيد الصوديوم، وعقيمة H2O. احتضان الحل على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      2. جمع spheroids من لوحة بئر القاع الجولة في 500 أنابيب ميكرولتر وغسل 2x مع 200 ميكرولتر 1x PBS.
      3. Pipette spheroids بعناية في 100 ميكرولتر من مصفوفة الكولاجين وإدراجها في وسط بئر في لوحات البئر العادية 96.
      4. احتضان هلام الكولاجين لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ثم إضافة cNBM على رأس هلام. يمكن إضافة مثبطات أو المنشطات (على سبيل المثال، كلوريد الهيدروجين كما هو مبين في الشكل 4B، 4C)إلى الوسط في هذه الخطوة.
    2. الحصول على الصور وتحليلها
      1. التقاط الصور بالتتابع مع مجهر الفيديو في وضع برايتفيلد 24 ساعة بعد إدراج الكولاجين.
      2. استخدم فيجي لتحليل الصور إما يدويًا أو بطريقة شبه آلية. للقيام بذلك يدويا، رسم حول جوهر والمساحة الإجمالية للspheroid مع أداة الاختيار الحر وقياس المنطقة الغازية من كل spheroid عن طريق طرح المساحة الإجمالية مع المساحة الأساسية. لتحليل الصور بطريقة نصف آلية، استخدم الماكرو كما هو مبين في المستند التكميلي 1 لتحديد المنطقة الغازية.
  3. الهجره
    1. اعداد
      1. معطف 6 لوحة جيدة مع Matrigel (0.2 ملغ / مل) في NBM لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم إزالة Matrigel وإضافة 2 مل من cNBM.
      2. نقل spheroids إلى 50 ميكرولتر من cNBM من لوحة بئر القاع الجولة إلى لوحة البئر 6.
      3. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية وانتظر 30 دقيقة لspheroids على الالتزام.
      4. بعد 24 ساعة من الحضانة، وصمة عار مع 10 نانوغرام / مل من Hoechst واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    2. الحصول على الصور وتحليلها
      1. الحصول على الصور باستخدام مجهر الفيديو في برايتفيلد. ويستخدم ليزر 405 نانومتر لتصور تلطيخ Hoechst.
      2. استخدام برامج فيجي لتحليل الصور وتشغيل الماكرو كما هو مبين في الوثيقة التكميلية 1.
        ملاحظة: لمس الجزء السفلي من البئر أو إزالة تماما الأضرار supernatant spheroids. للكولاجين نوع الأول معالجة هلام، والحفاظ على هلام على الجليد لتجنب البلمرة الكولاجين، لا تضيف مكون حمضي لأن التغيير في درجة الحموضة سوف تؤثر على ضغط هلام، وخلايا ماصة بسرعة في الكولاجين لمنع موت الخلية وتدهور الجل.

3- فيجي ماكرو

ملاحظة: فيجي هو برنامج تحليل الصور وضعت في المجال العام الذي يسمح لتطوير وحدات الماكرو لتسريع تحليل الصور. التحليل اليدوي ممكن أيضًا ، ولكن هذه عملية بطيئة وقد تدخل تحيزات. يمكن استيراد الصور عن طريق السحب والإفلات في البرنامج وقياسها كميًا باستخدام البرنامج المساعد أدوات مدير عائد الاستثمار. ويرد أدناه وصف للإجراء المستخدم في هذه الدراسة:

  1. فتح نافذة الماكرو: الإضافات | وحدات الماكرو | مترجم تفاعلي.
  2. نسخ ولصق الحلقة الأرجوانية المقتبسة التالية. الحفاظ على الجمل الأرجواني وإضافة الجمل الخضراء ذات الفائدة(وثيقة تكميلية 1).
  3. لتحليل السلسلة بأكملها، قم بضبط المعلمات باللون الأحمر للحصول على قياس كمي محدد وتشغيل الماكرو باستخدام وحدات الماكرو | تشغيل الماكرو أو الضغط على Ctrl +R.
  4. تحقق من المنطقة ذات الاهتمام وتكيفها يدويًا إذا لزم الأمر.

4. المجهر الإلكتروني من السفيرويدات

ملاحظة: يجب القيام بمعظم الخطوات التالية في غطاء محرك السيارة الكيميائي.

  1. خطوة التثبيت
    1. جمع spheroid مع قطع تلميح ماصة، ووضعها في أنبوب 1.5 مل، وغسل 1x مع 0.1 M الفوسفات المخزن المؤقت (PB).
    2. إصلاح كرويرويد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في 2٪ الجلوتالديهيد/2٪ paraformaldehyde (PFA) في 0.1 M PB.
    3. استبدال حل التثبيت مع حل 1٪ PFA في 0.1 M PB متبوعاً إعداد العينة.
  2. إعداد العينة
    1. نقل spheroids في مصفاة ووضعها في كوب زجاجي من أجل تجنب الضرر الكروي.
    2. غسل بعناية 3x مع 0.1 M PB.
    3. احتضان مع osmium لمدة 2 ساعة في الظلام. تمييع osmium إلى 4٪ في 1٪ 0.1 M PB المخزن المؤقت.
    4. غسل بعناية 3x مع 0.1 M PB.
      1. التجفيف على النحو التالي: نقع في الإيثانول 50٪ لمدة 10 دقيقة، 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة، 2x 90٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة، 2x 100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة، و 2x الأسيتون لمدة 30 دقيقة.
    5. احتضان العينات في خليط 50/50 من الأسيتون / الراتنج لمدة 2 ساعة. خلال هذه الخطوة، قم بإعداد راتنج EPON (تضمين-812: 11.25 غرام؛ DDSA: 9 ز; NMA: 4.5 غرام).
    6. تخلص من خليط الأسيتون/الراتنج، واستبدله بالراتنج المعد حديثاً ويحتضنه بين عشية وضحاها.
    7. استبدال الراتنج من قبل واحد جديد واحتضان بين 2-6 ساعة.
    8. إضافة السفيرويدات في الراتنج في قالب في 60 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إعداد Spheroids على النحو المبين في قسم البروتوكولات وأبديت ملاحظات بشأن الهجرة والغزو والانتشار والمجهر. لقياس نقص الأكسجة في مناطق متميزة من الهيكل الكروي ، تم استخدام تلطيخ الأنهيدراك الكاربوكسي التاسع لتحديد النشاط الناقص(الشكل 1A-C). ولوحظ تهيئة المزيد من الخلايا الإيجابية CAIX في مركز كرويويد(الشكل 1A-C). الخلايا hypoxic الموجودة في جوهر كرويرويد تميل إلى أن تكون أكثر غليكوليتيك من تلك ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم تكييف المقالات السفية الورم بشكل جيد لدراسة خصائص الورم بما في ذلك الانتشار والغزو والهجرة ، فضلا عن موت الخلايا والاستجابة للمخدرات. تغزو الخلايا السرطانية المصفوفة ثلاثية الأبعاد التي تشكل ورمًا صغيرًا غازيًا ، كما رأينا في الشكل 4B, C. خلال العملية الغازية، مصفوفة metalloproteinases (MMP) مصفوفات هضم المحيطة الخلايا السرطانية13،ومثبطات MMP (على سبيل المثال، GM6001 أو Rebimastat) قد تضعف غزو الخلايا ولكن ليس الهجرة14. اله...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل ترانسكان 2017، ARC 2017، Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et la Charente-Maritime). جورس غيون هو حاصل على زمالة من مستشفى جامعة تولوز (CHU Toulouse).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 بئر لوحة مستديرة القاعFalcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-01مخزنة في 4 درجة ؛ C ، إنزيم تفكك المجال
B27Gibco12587مخزن عند -20 درجة ؛ C ، تذويب قبل الاستخدام
نمو الخلايا الليفية الأساسيةPeprotech100-18Bالمخزنة في -20 درجة ؛ C ، تذويب قبل الاستخدام
شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسةInvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-500مخزنة في 4 درجات ؛ C
فيجي البرمجياتImageJتستخدم لتحليل الصور
قارورة 75 سم 2< / sup>Falcon10497302
MatrigelCorning354230مخزنة في -20 درجة ؛ C ، مخفف إلى تركيز نهائي قدره 0.2 مجم / مل في NBM البارد
ميثيل السليلوزSigmaM0512المخفف في NBM للتركيز النهائي 2٪
NBMGibco21103-049المخزن عند 4 درجة ؛ ج
الوسط العصبيالقاعدي 21103049 تخزين جيبكوعند 4 درجات ؛ C
Penicillin - StreptomycinGibco15140-122مخزنة عند 4 درجات ؛ C
Trypan blue 0.4٪ThermoFisherT10282يستخدم في عد الخلايا
من النوع الأول من الكولاجينCorning354236المخزنة عند 4 درجات ؛ ج
عامل

المراجع

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219(2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fiji hydrase IX

مقالات ذات صلة