يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الرجعية Overexpression من CXCR4 على الخلايا B-1a مورين والنقل بالتبني للهجرة الخلايا B-1a المستهدفة إلى نخاع العظام وإنتاج IgM

4.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61003

⸱

مايو 31, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

في هذه المقالة

ملخص

هنا نصف طريقة لفرط في التعبير الرجعية ونقل بالتبني من الخلايا B-1a المورين لفحص في حالة انتقال الخلية B-1a والتعريب. يمكن تمديد هذا البروتوكول للمقالات الوظيفية المتنوعة في المصب بما في ذلك التحديد الكمي لتوطين الخلايا B-1a المانحة أو تحليل العوامل المفرزة المشتقة من الخلايا المانحة بعد النقل بالتبني.

الملخص

كما تتأثر وظيفة الخلية بعوامل متخصصة في البيئة الدقيقة الخلوية، وطرق تشريح توطين الخلية والترحيل يمكن أن توفر المزيد من البصيرة على وظيفة الخلية. الخلايا B-1a هي مجموعة فرعية فريدة من نوعها خلية B في الفئران التي تنتج الأجسام المضادة IgM الطبيعية الواقية ضد epitopes الأكسدة الخاصة التي تنشأ أثناء الصحة والمرض. B-1a إنتاج الخلية IgM يختلف اعتمادا على موقع الخلية B-1a، وبالتالي يصبح من المفيد من وجهة نظر علاجية لاستهداف B-1a التعريب إلى منافذ داعمة لإنتاج الأجسام المضادة عالية. هنا نحن وصف طريقة لاستهداف هجرة الخلايا B-1a إلى نخاع العظام عن طريق التعبير المفرط بوساطة الرجعية من مستقبلات كيموكين زفكرة C-X-C 4 (CXCR4). يمكن أن يكون تحريض الجينات في خلايا المورين B الأولية تحديًا وعادةما ينتج كفاءة نقل منخفضة بنسبة 10-20٪ اعتمادًا على التقنية. هنا نثبت أن نقل الفيروس الرجعي من الخلايا الأولية B-1a الخلايا يؤدي إلى 30-40٪ كفاءة نقل. تستخدم هذه الطريقة نقل الخلايا بالتبني للخلايا B-1a المستحثة إلى فئران متلقية ناقصة الخلية B بحيث يمكن تصور ترحيل الخلايا B-1a وتوطينها. يمكن تعديل هذا البروتوكول لبنيات أخرى من الفيروسات الرجعية ويمكن استخدامها في المقالات الوظيفية المتنوعة بعد نقل بالتبني، بما في ذلك تحليل الخلية المانحة أو الخلية المضيفة فيلوب ووظيفة، أو تحليل العوامل القابلة للذوبان تفرز بعد نقل الخلية B-1a. كما أن استخدام فئران مانحة ومتلقية متميزة متمايزة بواسطة CD45.1 وCD45.2 allotype ووجود مراسل GFP داخل البلازميد الرجعي يمكن أن يمكّن أيضًا من الكشف عن الخلايا المانحة في نماذج فأرة أخرى كافية للمناعة تحتوي على مجموعات خلايا B داخلية.

المقدمة

وقد أظهرت الدراسات الحديثة خلايا مناعية كبيرة، وتحديدا خلية B، التغايرية الفينوتيرية والوظيفية اعتمادا على توطين الخلايا1،,2،,3،,4،,5. الخلايا B-1a هي واحدة من هذه السكان مع القدرة غير المتجانسة لإنتاج الأجسام المضادة IgM واقية; نخاع العظم B-1a الخلايا إفراز IgM التأسيسية والمساهمة بشكل كبير في البلازما IgM titers6, في حين أن خلايا ب-1a بب ذات مستوى منخفض إفراز IgM في التوازن بدلا من ذلك يمكن تفعيلها من خلال مستقبلات مثل حصيلة فطرية (TLR) أو السيتوكين بوساطة إشارة إلى الانتشار السريع, الهجرة, وإفراز IgM7,,8,,9,,10. B-1a الخلية IgM الأجسام المضادة التعرف على epitopes الأكسدة محددة (OSE) التي هي موجودة على مسببات الأمراض, الخلايا المبرمجة, وLDL مؤكسد, وIgM ملزمة لOSE يمكن منع إشارات المصب الالتهابي في أمراض مثل تصلب الشرايين11. لذلك ، قد تكون استراتيجيات زيادة إنتاج IgM عن طريق زيادة هجرة الخلايا B-1a الجبقية إلى مواقع مثل نخاع العظم مفيدة علاجيًا. ومع ذلك، من المهم أن تكون هذه الاستراتيجيات مستهدفة ومحددة من نوع الخلية، حيث أن الآثار غير المستهدفة قد تؤثر سلبًا على وظيفة المناعة أو الصحة.

هنا نحن وصف طريقة لموجه وطويلة الأجل overexpression CXCR4 في الخلايا الأولية B-1a murine ونقل بالتبني اللاحقة لتصور هجرة الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة IgM وظيفية(الشكل 1). ويكون التلاعب الجيني بالخلايا B الأولية محدودًا بسبب انخفاض كفاءة التَلَقمقارنة بمعالجة خطوط الخلايا المتحولة. ومع ذلك ، كما خطوط الخلايا المحولة يمكن أن تحيد بشكل كبير عن الخلايا الأولية12،13، واستخدام الخلايا الأولية من المرجح أن توفر النتائج التي تتماشى بشكل وثيق مع علم وظائف الأعضاء العادية. وقد وصفت عدة تقنيات لنقل الجينات في الخلايا الأولية المورين باء, بما في ذلك نقل الفيروس الرجعي, نقل الغدي الفيروسي, lipofection, أو التسفير القائم على الكهربية, التي لديها مستويات متفاوتة من الكفاءة, انتقال, وتأثير على صحة الخلايا13,,14,,15. استخدمت الطريقة التالية نقل الفيروس الرجعي لأنها أسفرت عن كفاءة كافية لنقل الجينات بنسبة > 30٪ في حين تؤثر على الحد الأدنى من صلاحية الخلية. تم إنشاء الفيروس الرجعي CXCR4 المعبر عنه باستخدام الفيروس الرجعي الموصوف سابقًا بناء فيروس الخلايا الجذعية المورينداخلي -بروتين الفلورسنت الأخضر (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, التي كان الماوس CXCR4 الجين الفرعي المستنسخة4. تم إنشاء MigR1 (التحكم (Ctl)-GFP) وجزيئات الرجعية CXCR4-GFP باستخدام التفسفات فوسفات الكالسيوم كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا4,14.

تم نقل الخلايا B-1a التي تم نقلها بنجاح عن طريق الوريد إلى Rag1-/- الفئران التي تعاني من نقص الخلايا الليمفاوية. بالإضافة إلى ذلك، احتوت الفئران المانحة والمتلقية بالضربة القاضية لمورثة apolipoprotein E (ApoE) ، مما يؤدي إلى زيادة تراكم OSE وتصلب الشرايين ، مما يوفر نموذجًا لتنشيط الخلية B-1 في الجسم الحي وإنتاج IgM. وعلاوة على ذلك، اختلفت الفئران المانحة والمتلقية في النمط الكلووي CD45؛ جاءت الخلايا B-1 المانحة من CD45.1+ ApoE-/- الفئران وتم نقلها إلى Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-المستلمين. سمح هذا التمايز من المانح CD45.1 من المتلقي CD45.2 B الخلايا بعد النقل دون الحاجة إلى وصمة عار بالإضافة إلى علامات الخلية B أثناء تحليل قياس الخلايا التدفق. النتائج المقدمة هنا تثبت أن الهدف CXCR4 الإفراط في التعبير على الخلايا B-1a المنتسبين مع زيادة قدرة الخلايا B-1a على الهجرة إلى نخاع العظام، الذي يرتبط مع زيادة البلازما المضادة OSE IgM. نحن نقدم بالإضافة إلى ذلك طريقة لتخصيب خلايا ب-1 ب الجهوية من خلال الاختيار السلبي وإظهار متطلبات تنشيط الخلية B-1 من أجل نقل فعال. يمكن تكييف هذه الطريقة لبنيات أخرى رجعية لدراسة تأثير الإفراط في التعبير البروتيني على هجرة الخلايا B-1a أو النمط الظاهري أو الوظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام CD45.1 مقابل CD45.2 التمييز allotype يمكن أن تسمح نظريا ً بالانتقال إلى نماذج أخرى كافية من التورين المناعي تحتوي على خلايا B ذاتية المنشأ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فرجينيا.

1. الفصل المغناطيسي وإثراء الخلايا ب-1 الجبقية

  1. القتل الرحيم 12-14 أسبوعا من العمر، ذكر، CD45.1+ApoE-/- الماوس باستخدام CO2.
  2. جعل قطع سطحية في البطن باستخدام مقص الجراحية على التوالي وقشر الجلد مرة أخرى باستخدام مقص منحني لفضح الجدار الجبقية. تجويف بافيق بزاوية 10 مل من 37 درجة مئوية دورة في الدقيقة 1640 المتوسطة باستخدام حقنة 10 مل و25 G إبرة. هز الماوس لفك الارتباط الخلايا عن طريق فهم الذيل وتحريك الجانب الماوس إلى جانب بدقة ل15-20 s.
    ملاحظة: تدليك بافيتونوم اللافج يمكن أيضا تحقيق أقصى قدر من استعادة الخلية.
  3. جمع السائل الجفيتوني باستخدام حقنة 10 مل و 25 G إبرة عن طريق رسم السوائل في الجانب الأيمن السفلي من الجيوم فقط فوق مستوى الورك، بالقرب من الأمعاء. تجنب تعطيل مستودعات الدهون epidydimal والأعضاء الكامنة. تجنب سحب السوائل من الجانب الأيسر للفأرة حيث يمكن بسهولة سحب الدهون omental إلى الحقنة.
  4. بمجرد جمع ~ 6−7 مل من السوائل، الاستغناء في أنبوب مخروطي 50 مل وضعت على الجليد. بعد ذلك ، ارفع الماوس عموديًا عن طريق الإمساك بالجدار الصفاق فوق الحجاب الحاجز باستخدام الملقط بحيث يبقى أي سائل متبقي في الجزء السفلي من تجويف الصفاق. جعل قطع صغيرة في الجدار الجبقية باستخدام مقص الجراحية فوق الكبد (تأكد من عدم قطع الكبد) وجمع أي السائل الجبقية المتبقية باستخدام أنبوب زجاجي ولمبة.
  5. تجمع خلايا الغسل الجيومية من جميع CD45.1+ApoE-/- الفئران (ن = 15-20) إلى أنابيب مخروطية 50 مل، وتخزينها على الجليد.
    ملاحظة: لحساب عدد الفئران اللازمة: تشكل خلايا B-1a 5-10٪ من إجمالي عدد الخلايا الجبقية وينتج ما يقرب من 2.5-5 × 105 خلايا B-1a لكل فأر في أيدي المؤلفين. كفاءة التحويل هي ~ 30-40 ٪، كما هو مبين أدناه.
  6. عد الخلايا الحية باستخدام صبغة الجدوى مثل الأزرق trypan ومقياس الهيموكيتومتر (تمييع العينات 1:5 في blue trypan وتحميل 10 ميكرولتر في غرفة قياس الهيموكيتومتر). تجمع الخلايا في ما يصل إلى 1 × 108 خلايا لكل أنبوب. خلايا الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية، ثم تستنشق supernatant.
  7. إعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 108 خلايا في 1 مل من الأجسام المضادة لمكافحة CD16/CD32(جدول المواد)المخفف 1:50 في عازلة فحص (1x الفوسفات عازلة المحلول [PBS], 0.5% البودرة الألبوم المصل [BSA], 2 mM EDTA) من أجل منع مستقبلات Fc. مقياس حسب الضرورة استناداً إلى عدد الخلايا. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة في 4 °C.
  8. إعداد مزيج رئيسي 2x من الأجسام المضادة الحيوية الصغيرة(الجدول 1)في عازلة القول للنضوب. يفسر المزيج الرئيسي 2x حجم السائل الذي توجد فيه الخلايا بالفعل عند احتضانه بمضاد CD16/CD32. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا تحتضن 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة CD16/CD32، فأضف 500 ميكرولتر من المزيج الرئيسي 2x الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من Ter119 وGr-1 و CD23 وNK1.1 الأجسام المضادة و25 ميكرولتر من الأجسام المضادة الحيوية الصغيرة جداً F4/80 لتحقيق التركيزات النهائية الواردة في الجدول 1. إضافة مزيج رئيسي 2x إلى الخلايا ووصمة عار لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  9. غسل الخلايا مع 5 مل من عازلة وأجهزة الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant.
  10. إعادة تعليق واحتضان الخلايا مع الميكروبات المضادة للالبيوتين(جدول المواد)المخفف في عازلة فحص وفقا للتركيز والبروتوكول الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
  11. اغسل بسعة 5 مل من عازل الزى والطرد المركزى عند 400 × جرام لمدة 5 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. استنس supernatant وإعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 108 خلايا في 500 ميكرولتر من عازلة ازى.
  12. أعمدة الاختيار المغناطيسي رئيس(جدول المواد)مع 3 مل من عازلة ازى. نقل الخلايا على أعمدة الاختيار المغناطيسي تستعد وجمع eluent التي تحتوي على الخلايا المخصب B-1 في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد. اغسل عمود التحديد المغناطيسي بعازل فحص إضافي حتى يكون الحجم الإجمالي الذي تم جمعه 10 مل.
    ملاحظة: يجب تحليل أتريدوت من كسور الخلايا المنقاة مسبقًا وما بعد التنقية بشكل منفصل عن طريق قياس خلايا التدفق لكفاءة التنقية عن طريق تلطيخ خلايا CD19 + B ، والفحاق F480 + ، وخلايا CD5 + T كما هو موضح في الشكل 2.
  13. عد كسر الخلية بعد تنقية (الإلونت الذي يحتوي على خلايا B-1 المخصب) عن طريق حساب الخلايا الحية كما هو الحال في الخطوة 1.6، وإعادة تعليق في 1 × 106 خلايا / مل في خلية B المتوسطة الثقافة (RPMI-1640, 10% الحرارة المعطلة مصل البقر الجنين [FBS], 10 mM HEPES, 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية, 1 mM بيروفات الصوديوم, 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين, 55 ميكرون α-mercaptoethanol).

2. تحفيز الخلية B-1 ب بيريتونال

  1. انقسام الخلايا المجمعة للشرطين المستحثين (Ctl-GFP و CXCR4-GFP)، مع وضع جانبا وطلاء ما لا يقل عن 10 × 106 خلايا للتحكم غير المستحث.
  2. لوحة تصل إلى 150 ميكرولتر (150،000 خلية) لكل بئر في لوحات مستديرة القاع 96 بئر.
  3. إضافة 100 nM TLR9 agonist ODN1668 إلى جميع الآبار لتحفيز انتشار الخلايا.
  4. احتضان 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.

3- نقل الفيروس الرجعي للخلايا الجهوية باء

  1. إنشاء Ctl-GFP (MigR1) وCXCR4-GFP الجسيمات الرجعية باستخدام التقافي فوسفات الكالسيوم كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا14.
    ملاحظة: سيستغرق هذا عدة أيام، لذلك قم بإعداد وtiter مخزونات الفيروسات الرجعية وتخزين aliquots في -80 درجة مئوية قبل بدء هذا البروتوكول.
  2. ذوبان أرصدة الفيروسات الرجعية على الجليد. استخدام على الفور وعدم إعادة تجميد كما titer الفيروس يقلل بشكل كبير خلال دورات تجميد ذوبان الجليد. إضافة Ctl-GFP أو CXCR4-GFP المواد الخارقة للفيروسات الرجعية في 20:1 تعدد العدوى (وزارة الداخلية) إلى الخلايا، في وجود 8 ميكروغرام / مل polybrene وجديدة β-mercaptoethanol في تركيز نهائي 55 ميكرومتر. لا تضيف مخزونات فيروسية إلى الخلايا المخصصة للتحكم غير المستحث.
  3. تنفيذ spinfection بواسطة لوحات الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. ألواح الحاضنة مع الفيروس الرجعي عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 3 ساعة إضافية.
  5. حصاد وإعادة صف الخلايا في خلية جديدة متوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.

4. فرز الخلية من الخلايا الجبريتوب المستحثة B-1a

  1. حصاد الخلايا المستزرعة وتجمع في ثلاثة أنابيب مخروطية منفصلة 50 مل لكل حالة: غير مستحثة، Ctl-GFP المستحثة، وCXCR4-GFP المستحثة.
  2. عد الخلايا الحية كما هو الحال في الخطوة 1.6، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant.
  3. إعادة تعليق الخلايا في 100،000 الخلايا / μL في عازلة الفرز (PBS + 1٪ BSA) التي تحتوي على 1:50 المضادة CD16/CD32 الأجسام المضادة(جدول المواد) منأجل منع مستقبلات Fc. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة في 4 °C.
  4. Aliquot الخلايا لضوابط التعويض (~ 30،000 الخلايا لكل مراقبة التعويض): لغير الملطخة وواحد عناصر التحكم وصمة عار aliquot من عينة غير مرسلة وللGFP واحد للسيطرة على وصمة عار aliquot من عينات المستحثة.
    ملاحظة: يمكن استخدام حبات التعويض المتاحة تجاريًا بدلاً من ذلك لضوابط وصمة عار واحدة إذا كان رقم الخلية غير المستحث منخفضًا.
  5. إعداد مزيج الأجسام المضادة 2x الرئيسية التي تحتوي على الأجسام المضادة المفلورة الزوجية في نوع عازلة(الجدول 1). أضف مزيجًا رئيسيًا 2x إلى عينات مرسلة غير مرسلة من CTL-GFP وCXCR4-GFP. إضافة الأجسام المضادة الفردية إلى عناصر التحكم وصمة عار واحدة. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 °C في الظلام.
    ملاحظة: حسابات المزيج الرئيسي 2x لحجم السائل الخلايا موجودة بالفعل عند احتضان مع مكافحة CD16/CD32، كما هو الحال في الخطوة 1.8. يمكن أن تكون ملطخة aliquot من الخلايا من كل حالة بشكل منفصل لCXCR4 لتأكيد التعبير المفرط CXCR4.
  6. غسل العينات مع 1 مل من نوع عازلة وسلالة من خلال مرشحات 70 ميكرون في أنابيب البولي بروبلين.
  7. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant. إعادة تعليق العينات في 50,000 خلية/ميكرولتر في المخزن المؤقت الفرز.
  8. قبل فرز الخلايا إعداد المسمى الفلورسينس تنشيط أنابيب جمع الخلايا (FACS) التي تحتوي على 1 مل من وسط جمع (RPMI-1640، 20٪ من الـ FBS المنشط للحرارة، 10 mM HEPES، 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1 mm الصوديوم بيروفات، 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين، 55 ميكرومتر- ميركابتوإيثانول) لكل مجموعة من السكان ليتم فرزها.
  9. قبل تشغيل العينات على الفرز الخلية إضافة 2x DAPI (أعدت على النحو 1:5000 تخفيف في عازلة الفرز) للتمييز الخلية الميتة.
  10. فرز GFP + B-1a الخلايا في أنابيب FACS التي تحتوي على المتوسطة جمع DAPI- CD19+ GFP+ B220منتصف لو CD23- IgM+ CD5+ الخلايا من عينات CTL-GFP و CXCR4-GFP. استخدم العينة غير المستحثة لتعيين بوابة GFP+ وفرز DAPI- CD19+ GFP- B220منتصف قرص CD23- IgM+ CD5+ الخلايا B-1a غير المستحثة.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن أيضاً فرز الخلايا غير المستحثة من عينات CTL-GFP و CXCR4-GFP عن طريق الخلايا B-1a التي تقُطّر بشكل منفصل داخل الكسر GFP. يمكن أيضًا فرز الخلايا B-1b المستحثة أو غير المستحثة باستخدام استراتيجية الفرز هذه كـ DAPI- CD19+ GFP+/- B220منتصف قرص CD23- IgM+ CD5- الخلايا.

5- النقل بالتبني

  1. بعد فرز الخلايا، خلايا الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant بعناية.
  2. إعادة تعليق الخلايا في الباردة المعقمة 1x PBS في 1000 خلية / ميكرولتر.
  3. التخدير الذكور Rag1-/- ApoE-/- الفئران باستخدام الايزوفلوران وحقن 100 ميكرولتر (100،000 خلية) لكل فأر عن طريق الوريد الرجعية المدارية أو حقن الوريد الذيل باستخدام حقنة الأنسولين فائقة الغرامة. حقن عدد قليل من الفئران مع 1x PBS كعنصر تحكم.

6- القياس الكمي للخلايا المانحة والبلازما IgM

  1. في الوقت المطلوب بعد نقل بالتبني، وتحليل الخلايا المنقولة في الفئران المتلقية عن طريق نخاع العظام والطحال الأنسجة الحصاد4 وتدفق القياس الخلوي. تحديد تعريب الخلايا المانحة والتعبير المفرط CXCR4 عن طريق تلطيخ CD45.1 و CD45.2 و CXCR4 وتحليل نتائج قياس الخلايا التدفق باستخدام برنامج مثل Flowjo.
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للأجسام المضادة المستخدمة في هذه الخطوة. تأكد من عدم استخدام اقتران الأجسام المضادة التي الفلورسيس في قناة FITC كما GFP سوف تكون موجودة على الخلايا المانحة المستحثة.
  2. عزل البلازما عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى الدم كله التي تم جمعها عن طريق ثقب القلب في وقت التضحية بالحيوان. الطرد المركزي كامل الدم في 7000 × ز والبلازما aliquot في أنابيب منفصلة 1.5 مل الطرد المركزي. تخزين في -80 درجة مئوية حتى إجراء تحليل للعوامل المفرزة مثل IgM بواسطة ELISA4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد لمحة عامة عن البروتوكول في الشكل 1. يعرض الشكل 2 إثراء الخلايا الجبيرية B-1a بعد الاستنفاد المغناطيسي لأنواع الخلايا الجبقية الأخرى. يعيش خلايا مفردة في كسر ما بعد الاستنفاد لديها نسبة أكبر من خلايا CD19 + B مقارنة مع F4/80+ الضامة، وعدم وجود CD5مرحبا CD19- الخلايا التائية، وتحتوي على زيادة وتيرة CD19+ CD5منتصف B-1a الخلايا مقارنة مع كسر ما قبل الاستنفاد. يعرض الشكل 3 متطلب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطريقة المقدمة هنا تمكن مستقرة وفعالة نسبيا الأولية B-1a تسليم الجينات الخلية، في نقل العضوية على جهاز الحي، وتحديد وتوطين الخلايا المحقونة. وتمكنت الخلايا من الكشف عن 17 أسبوعا ً من نقل هاون الخلية واحتفظت بزيادة تعبير CXCR4. أدى التسليم بوساطة الفيروسات الرجعية 30-40٪ كفاءة نقل الخلايا الأولية B-1a مع الحد الأدنى من التأثير على قدرة الخلية على البقاء في أيدينا(الشكل 4e). وهذا يتماشى مع نتائج دراسة سابقة أجراها موهيمى وزملاؤه وقارنت تقنيات نقل الجينات إلى خلايا المورين الأولية ب بما في ذلك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل 1R01 HL107490 ، 1R01 HL136098 ، المشروع 3 من P01 HL055798 ، P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) ، وR01GM100776 (T.P. Bender). أ. بدعم من جمعية القلب الأمريكية قبل الدكتوراه زمالة 16PRE30300002 و 5T32AI007496-20. نشكر جوان لاننيغان، مايك سولغا، وكلود تشو من جامعة فرجينيا تدفق القلب للخلايا على مساعدتهم التقنية الممتازة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغطية مرشح 70 ميكرونفالكون352235
ميكروبيدات مضادة للبيوتينMiltenyi Biotec130-090-485
anti-CD16 / CD32 ، أو Fc blockLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83استنساخ: RA3-6B2
بيتا ميركابتو إيثانولجيبكو21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82استنساخ: eBio1D3
CD23 البيوتينeBioscience13-0232-81استنساخ: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82استنساخ: B3B4
CD3e البيوتينeBioscience13-0033-85استنساخ: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- الفئرانN / ANتم تربيتها في المنزل
CD45.1 PerCP-Cy5.5استنساخ BD Biosciences560580: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895استنساخ: 104
CD45.2 Rag1 - / - ApoE - /- الفئرانN / AN / Aتم تربيتها في المنزل
CD5 PEeBioscience12-0051-83استنساخ: 53-7.3
Ctl-GFP الفيروس القهقريN / AN / Aتم إنشاؤه في المنزل باستخدام بلازميد الفيروسات القهقرية الذي يعبر عن GFP MigR1 المقدم من الدكتور TP. بندر
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82استنساخ: 2B11
CXCR4-GFP الفيروس القهقريN / AN / Aتم إنشاؤه في المنزل عن طريق استنساخ الماوس CXCR4 في بلازميد الفيروس القهقري MigR1
F4 / 80 biotinLife TechnologiesMF48015استنساخ: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.الترخيص المطلوب
GentamicinGibco15710-064
Gr-1 البيوتينeBioscience13-5931-82استنساخ: RB6-8C5
مصل بقري الجنين المعطل بالحرارةGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565استنساخ: R6-60.2
محاقن الأنسولينBD Biosciences329461
IsofluraneHenry Schein Animal Health029405
Live / Dead YellowLife TechnologiesL34968
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 البيوتينBD Biosciences553163استنساخ: PK136
الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
بيروفات الصوديومGibco11360-070
Ter119 البيوتينeBioscience13-5921-82استنساخ: Ter119
/ A

المراجع

  1. Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).
  2. Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
  3. Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
  4. Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083(2015).
  6. Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
  7. Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
  8. Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
  9. Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
  10. Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
  11. Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
  14. Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
  15. Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).
  16. DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
  17. Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
  18. Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
  19. Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
  20. Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
  21. Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
  22. Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تعبير CXCR4نقل الخلايا التبنيالتوطين في نخاع العظمجمع السائل البريتونيالفرز المغناطيسي للخلاياالتحفيز بمحفز TLR9الكشف عن النمط المظهري لـ CD45
الرجعية Overexpression من CXCR4 على الخلايا B-1a مورين والنقل بالتبني للهجرة الخلايا B-1a المستهدفة إلى نخاع العظام وإنتاج IgM
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.