يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

6.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61018

⸱

مارس 29, 2020

 , 
1Department of Pharmacology, UC Davis School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

البالميتويلية ينطوي على دمج البالميتات 16 الكربون moiety لمخلفات السيستين من البروتينات المستهدفة بطريقة قابلة للعكس. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين من الفائدة في تحلل الدماغ الماوس.

الملخص

ويعتقد أن التعديلات التي تعتمد على النشاط في مستويات مستقبلات AMPA متشابك (AMPARs) داخل كثافة postynaptic (PSD) تمثل آلية خلوية للتعلم والذاكرة. البمنية ينظم توطين وظيفة العديد من البروتينات متشابك بما في ذلك AMPA-Rs, العوامل المساعدة وسقالات متشابك بطريقة تعتمد على النشاط. حددنا التمايز المتسبب في المشبك (SynDIG) الأسرة من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغ محددة التي ترتبط مع AMPARs وتنظيم قوة المشبك. SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا السيستين تقع في موقفين 191 و 192 في منطقة التجاور عبر الغشاء المهم لتطوير المشبك مثير يعتمد على النشاط. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين الفائدة وإظهار فائدتها مع عائلة SynDIG من البروتينات في تحلل الدماغ الماوس.

المقدمة

S-palmitoylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة من البروتينات المستهدفة التي تنظم الارتباط غشاء مستقر، والاتجار البروتين، والتفاعلات البروتين والبروتين1. وهو ينطوي على إضافة البالميتات 16 الكربون moiety إلى بقايا السيستين عبر ربط ثيويستر حفز هاميسمنس البالميتوسيل acyltransferase (بات) الإنزيمات. العديد من البروتينات متشابك في الدماغ هي palmitoylated، بما في ذلك AMPA-Rs و PSD-95، بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، والتعريب، وظيفة2،3،4. التعديلات في مستويات AMPARs متشابك في PSD عن طريق التفاعل بين العوامل المساعدة مع السقالات متشابك مثل PSD-95 يكمن اللدونة متشابك; وبالتالي ، فإن طرق تحديد حالة palmitoylation من البروتينات متشابك يوفر نظرة ثاقبة هامة في آليات اللدونة متشابك.

في السابق ، حددنا عائلة SynDIG من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغي المحددة التي ترتبط مع AMPARs5. الإفراط في التعبير أو ضرب أسفل SynDIG1 في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران المنفصلة يزيد أو يقلل، على التوالي، AMPA-R حجم الاشتباك العصبي وعدد من قبل ~ 50٪ كما تم الكشف عنها باستخدام الكيمياء المناعية والفيزيولوجيا الكهربائية5. لقد استعينا في تبادل acyl-biotin (ABE) للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا Cys التجاور يُحفظ (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار والتوطين والوظيفة6. يعتمد ازى ABE على تبادل البيوتين على السيستين اتى محمية بالتعديل وتنقية التقارب اللاحقة7. هنا، ونحن نصف نهج البيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويلهلام تبادل (APEGS) كمية88،9،,10،,11،,12،والتي لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في التنقل هلام لتحديد عدد من التعديلات لبروتين الفائدة. يوصف البروتوكول للتحقيق في بروتينات الأغشية الذاتية من دماغ الماوس التي تتوفر لها أجسام مضادة مناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا، ديفيس.

1. إعداد أغشية الدماغ الماوس

  1. قطع رأس الماوس باستخدام جهاز المقصلة وتشريح الدماغ بسرعة (في < 1 دقيقة، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من التغيرات palmitoylation التي قد تحدث أثناء إجراء تشريح). التجانس على الفور في 10 مل من التجانس عازلة(الجدول 1)في التجانس الزجاج (~ 12 السكتات الدماغية) على الجليد.
  2. جهاز الطرد المركزي يصل إلى 15 دقيقة عند 1400 × غرام عند 4 درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد على الجليد. إعادة تعليق بيليه (~ 6 السكتات الدماغية) في حجم متساو من العازلة التجانس والطرد المركزي في 710 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  3. الجمع بين المواد الخارقة من الخطوة 1.2 والطرد المركزي في 40،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant (الكسر الخلوي) وإعادة تعليق غشاء بيليه (P2) كسر في التجانس المخزن المؤقت.
    ملاحظة: يمكن تجميد العينات وتخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا.
  5. إجراء حمض بيينكدونينيك (BCA) فحص لكميات مستويات البروتين. بالنسبة للفحص APEGS، ابدأ ببروتين 100-200 ملغ (بحد أقصى 250 ملغ) في حجم 470 ميكرولتر من المخزن المؤقت A(الجدول 1)في أنبوب 1.5 مل. سونيكات والطرد المركزي في > 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 25 درجة مئوية لإزالة البروتين غير قابل للذوبان. نقل البروتين السفولوبيلية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.

2. Acyl-PEGyl تبادل هلام التحول (APEGS) saysay

  1. تعطيل سندات الكبريتيد ومنع السيستينات الحرة.
    1. تعطيل سندات الكبريتيد عن طريق احتضان في 25 mm tris (2-carboxyethyl) فوسفين (TCEP; 25 ميكرولتر, وأضاف من محلول الأسهم; الجدول 1) لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    2. كتلة السيستينات الحرة مع 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12.5 ميكرولتر, وأضاف من محلول الأسهم; الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
      ملاحظة: يمكن تمديد رد الفعل بين عشية وضحاها.
  2. إجراء هطول الأمطار الميثانول الكلوروفورم (CM).
    1. نقل محلول البروتين من أنبوب 1.5 مل إلى أنبوب البولي بروبلين أو الزجاج التي يمكن طردها المركزي في دوار دلو يتأرجح بسرعة متواضعة. أنبوب 5 مل مثالية. إضافة أربعة مجلدات (2 مل) من الميثانول (MeOH) والدوامة لفترة وجيزة.
    2. إضافة مجلدين (1 مل) من الكلوروفورم والدوامة لفترة وجيزة.
    3. إضافة ثلاثة مجلدات (1.5 مل) من dH2O والدوامة لفترة وجيزة.
    4. طرد العينات في 3000 × ز لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح.
    5. إزالة بعناية وتجاهل المرحلة العليا.
    6. أضف 3 مجلدات (1.5 مل) من MeOH واخلط بلطف ولكن بدقة ، مع الحرص على عدم تجزئة فطيرة البروتين المبهمة.
    7. الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 10 دقيقة في 25 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح.
    8. باستخدام أنبوب مصلي زجاجي، وإزالة أكبر قدر من المرحلة العليا ممكن دون إزعاج فطيرة البروتين.
    9. شطف بعناية بيليه مع 1 مل من MeOH.
    10. يجفف الهواء البيليه لمدة 10 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه المجفف ة عند -20 درجة مئوية.
  3. تنفيذ انشقاق من وصلات palmitoyl-thioester مع هيدروكسيلامين (NH2OH, HAM).
    1. إعادة تعليق البروتين عجل في 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت A وسونيكات لفترة وجيزة. الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. نقل البروتين السفولوبيلية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    2. إضافة 375 ميكرولتر من المخزن المؤقت H (HAM+; الجدول 1) أو T المخزن المؤقت (HAM-; الجدول 1) وعينات الاحتضان لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  4. كرر هطول الأمطار CM الموصوفة في الخطوة 2.2.
    ملاحظة: يمكن تخزين بيليه المجفف ة عند -20 درجة مئوية.
  5. إضافة mPEG إلى السيستينات غير المحمية.
    1. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت A التي تحتوي على 10 mM TCEP. نقل إلى أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: من الطبيعي أن يحدث فقدان كبير للبروتين خلال خطوات هطول الأمطار CM. سيتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في أنبوب 1.5 مل، مما يحد من حجم البروتين إلى حد أقصى 120-130 ميكرولتر. وهذا سوف يقلل من فقدان البروتين خلال هطول الأمطار CM النهائي.
    2. إضافة 20 mM mPEG-5k (25 ميكرولتر، وأضاف من محلول الأسهم؛ الجدول 1) لعينة البروتين وتخلط عن طريق الأنابيب. احتضان لمدة 60 دقيقة في 25 درجة مئوية مع نهاية على نهاية التناوب.
    3. لإزالة mPEG-5k غير المدمجة، قم بإجراء هطول الأمطار CM كما هو موضح في الخطوة 2.2 باستخدام هذه الأحجام المعدلة: 4 مجلدات من MeOH (500 ميكرولتر)، ومجلدين من الكلوروفورم (250 ميكرولتر)، و3 مجلدات من dH2O (375 ميكرولتر). الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    4. إزالة بعناية المرحلة العليا كما كان من قبل، وتجنب سميكة، فطيرة flocculent. إضافة 1 مل من MeOH وتخلط بلطف ولكن بدقة. الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    5. إزالة بعناية supernatant وشطف بيليه مع 1 مل من MeOH. الطرد المركزي في > 13,000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية. الهواء بيليه الجافة.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه المجفف ة عند -20 درجة مئوية.
    6. إعادة تعليق بيليه المجففة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (دون TCEP أو أي عامل الحد). احجز 5 ميكرولتر لكمية بروتين BCA. بعد الكمية، أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت عينة 4x Laemmli، واعتمادا على البروتين ذات الأهمية، يحتمل تسخين العينة إلى 70-100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: قد يسبب الغليان تجميع بعض بروتينات الغشاء.

3. تحليل لطخة الغربية من البروتينات PEGylated

  1. تحميل العينة على كبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE) هلام13.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول تم استخدام 10٪ polyacrylamide.
  2. استخدام بروتوكولات الفصل والنقل والكشف القياسية للنشاف الغربي14.
  3. استخدام قياس الكثافة14 لتحديد الكميات النسبية من البروتينات PEGylated مقابل البروتينات غير PEPEGylated.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

Immunoblotting مع الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة يكشف عن حالة palmitoylated (غير ، singly ، doublly ، الخ) في تحليل الدماغ الماوس كما يحددها تحول التنقل مقارنة مع العينات التي لم يتم تضمين HAM. سابقا، كنا قد أظهرت أن SynDIG1 كان palmitoylated في موقعين باستخدام ABE اساي6. ومع ذلك، لم نتمكن من تحديد ما إذا كان كلا الموقعين قد تم تعديلهما في أنسجة الدماغ. هنا نظهر أن SynDIG1 ، SynDIG4/Prrt1 ، وPrrt2 هي palmitoylated في دماغ الماوس وأن لديهم اثنين من مواقع الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في عملنا السابق، استعملنا في ABE للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من المخلفات السّيّز ة التجاور المُحافظ عليها (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، التوطين، والوظيفة6. وهناك قيد هو أن مقافي ABE يتطلب تنقية تقارب مع راتنجات agarose مترافقة مع مويزات avidin كخطوة نهائية في الإجراء ، مما أدى إلى فقدان كبير للإشارة التي تعقد التحليل الكمي. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن يميز saysay ABE ما إذا كان البروتين هو palmitoylated مرة واحدة أو في مواقع متعددة.<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

المؤلفين أشكر ك. Woolfrey للحصول على المشورة والمدخلات على APEGS اقولها. تم تمويل هذه الدراسات من خلال منح بحثية لـ E.D. من مؤسسة وايتهول وNIH-NIMH (1R01MH119347).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيدروكسيلامين (HAM) ThermoFisher26103
Methoxy-PEG- (CH2< / sub>) 3< / sub>NHCO (CH2< / sub>) 2< / sub>-MAL (mPEG) NOFME-050MAMW ~ 5000 kDa
MicrofugeEppendorf5415Rأو ما يعادلها من المعدات
N-ethylmalemide (NEM)Calbiochem34115شديد السمية.
جهاز تصوير بصري لقياس الكثافةAzure Biosystemsأو الياقوت المصور الجزيئي الحيويأو المعدات المكافئة
أنابيب البولي بروبلين مع غطاءفيشر Scientific14-956-1D
الماصات المصلية (الزجاج)فيشر ساينتفيك13-678-27D
جهاز طرد مركزي أعلى الطاولةBeckmanAllegra X-15Rأو ما يعادله من المعدات
تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد (TCEP) EMDميليبور580560

المراجع

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  14. Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SynDIG TCEP NEM
Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.