مقالة منهجية

قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

DOI:

10.3791/61024

⸱

أبريل 30, 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المنتجات المترجمة غير المعتمدة على ATG المتكررة هي ميزات مسببة للأمراض الناشئة للعديد من الأمراض المتكررة القائمة على التوسع. الهدف من البروتوكول الموصوف هو تقييم السمية الناجمة عن هذه الببتيدات باستخدام المقالات السلوكية والخلوية في النظام النموذجي C. elegans.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans يستخدم عادة لنموذج الأمراض العصبية المرتبطة بالعمر الناجمة عن الطفرات التوسع ية المتكررة, مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض هنتنغتون. في الآونة الأخيرة ، تبين أن تكرار التوسع الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي هو الركيزة لنوع جديد من ترجمة البروتين يسمى تكرار المرتبطة AUG تعتمد (RAN) الترجمة. على عكس الترجمة الكنسية، لا تتطلب ترجمة RAN بدء codon ويحدث فقط عندما يتجاوز التكرار طول عتبة. نظرًا لعدم وجود codon بدء لتحديد إطار القراءة ، تحدث ترجمة RAN في جميع إطارات القراءة من كل من قوالب الحمض النووي الريبي المنطقية وantisense التي تحتوي على تسلسل توسيع متكرر. لذلك ، توسع ترجمة RAN عدد الببتيدات السامة المحتملة المرتبطة بالأمراض من واحد إلى ستة. حتى الآن، تم توثيق ترجمة RAN في ثمانية مختلفة تكرار التوسع القائم على الأمراض العصبية والعصبية العضلية. في كل حالة ، فك رموز المنتجات التي RAN سامة ، فضلا عن آليات ها من السمية ، هو خطوة حاسمة نحو فهم كيفية هذه الببتيدات تسهم في علم الفيزيولوجيا المرض. في هذه الورقة، ونحن نقدم استراتيجيات لقياس سمية الببتيدات RAN في النظام النموذجي C. elegans. أولا، نحن نصف إجراءات لقياس سمية الببتيد RAN على نمو وحركية تطوير C. elegans. ثانياً، نحن نفصّل فحصاً لقياس الآثار المعتمدة على العمر بعد النمو من الببتيدات RAN على الحركة. وأخيرا، نحن نصف السمية العصبية المقاهل لتقييم آثار الببتيدات RAN على مورفولوجيا الخلايا العصبية. توفر هذه المقالات تقييمًا واسعًا لسمية الببتيد RAN وقد تكون مفيدة في إجراء شاشات جزيئات وراثية أو صغيرة واسعة النطاق لتحديد آليات المرض أو العلاجات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوسع غير المناسب لتسلسل تكرار الحمض النووي هو الأساس الوراثي للعديد من الأمراض العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، ومرض هنتنغتون (HD)1. وفي حين أن هناك نماذج خلوية والحيوانات راسخة لهذه الأمراض، فإن الآليات التي تقوم عليها هذه الظروف ليست محددة بشكل جيد. على سبيل المثال، يحدث HD بسبب التوسعات في تسلسل تكرار CAG في تسلسل الترميز لبروتين هنتنغتين Htt2. لأن CAG ترميز الجلوتامين الأحماض الأمينية، والنتائج توسيع CAG تكرار في إدراج polyGlutamine، أو polyQ، تسلسل داخل Htt. البروتينات متعددة الجوانب الموسعة تشكل مجاميع البروتين تعتمد على الطول والعمر التي ترتبط مع سمية3،,4. ومن المدهش أن دراستين حديثتين تشيران إلى أن طول تسلسل البولي كيو ليس المحرك الرئيسي لظهور مرض HD ، مما يشير إلى أن العوامل المستقلة عن تعدد الحلقات قد تساهم أيضًا في المرض5،6.

تتضمن إحدى الآليات المستقلة الممكنة متعددة الحلقات نوعًا مكتشفًا حديثًا من ترجمة البروتين يسمى Repeat Associated Non-AUG-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on-AUG-on.R- الترجمة7. كما يوحي اسمها، تحدث ترجمة RAN فقط عندما يكون تسلسل تكرار الموسعة موجودة ولا تتطلب codon بدء الكنسي. لذلك ، تحدث ترجمة RAN في جميع إطارات القراءة الثلاثة للتكرار لإنتاج ثلاثة polypeptides متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، لأن العديد من الجينات تنتج أيضًا نسخة مضادة للمعنى تحتوي على تكملة عكسية لتسلسل التكرار الموسع ، تحدث ترجمة RAN أيضًا في جميع إطارات القراءة الثلاثة لنسخة antisense. معا، RAN الترجمة يوسع عدد البروتينات المنتجة من تسلسل الحمض النووي الموسعة التي تحتوي على تكرار من ببتيد واحد إلى ستة ببتيدات. حتى الآن، وقد لوحظ ترجمة RAN في ما لا يقل عن ثمانية اضطرابات مختلفة التوسع تكرار8. ويلاحظ الببتيدات RAN في عينات المريض بعد الوفاة وفقط في الحالات التي يحمل فيها المريض تكرار الموسعة9,10. في حين أن هذه الببتيدات موجودة بوضوح في خلايا المريض ، فإن مساهمتها في الفيزيولوجيا المرضية غير واضحة.

لتحديد أفضل سمية المحتملة المرتبطة الببتيدات RAN، وقد أعربت عدة مجموعات كل الببتيد في أنظمة نموذج مختلف، مثل الخميرة والذباب والفئران، وخلايا زراعة الأنسجة11،12،13،14،15،16. بدلا من استخدام تكرار تسلسل للتعبير، وتستخدم هذه النماذج نهج codon الاختلاف الذي يتم القضاء على تسلسل تكرار ولكن يتم الحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية. بدء الترجمة يحدث من خلال ATG الكنسي وعادة ما تنصهر الببتيد إلى بروتين الفلورسنت في إما N- أو C-terminus، لا يبدو أن أي منهما يتداخل مع سمية الببتيد RAN. لذلك ، كل بناء يبالغ في التعبير عن ببتيد RAN واحد. نمذجة منتجات RAN المختلفة في كائن متعدد الخلايا مع المقاييس البسيطة لقياس سمية الببتيد RAN أمر بالغ الأهمية لفهم كيف تساهم منتجات RAN المختلفة من كل توسع متكرر يسبب المرض في الخلل الوظيفي الخلوي وتوليد الأعصاب.

مثل الأنظمة النموذجية الأخرى، يوفر C. elegans منصة تجريبية مرنة وفعالة تمكن من إجراء دراسات لآليات المرض الجديدة، مثل سمية الببتيد RAN. الديدان تقدم العديد من السمات التجريبية الفريدة التي لا تتوفر حاليا في نماذج أخرى من سمية الببتيد RAN. أولاً، C. elegans شفافة بصرياً منذ الولادة حتى الموت. وهذا يسمح للتصور بسيطة من التعبير الببتيد RAN والتعريب، وكذلك في تحليل الحي من التنكس العصبي في الحيوانات الحية. ثانيا، الأساليب المعدلة وراثيا لتوليد نماذج التعبير الببتيد RAN غير مكلفة وسريعة. ونظرا لدورة حياة قصيرة لمدة ثلاثة أيام من C. elegans,خطوط المعدلة وراثيا مستقرة تعبر عن أي ببتيد ران معين بطريقة محددة من نوع الخلية يمكن إنتاجها في أقل من أسبوع. ثالثاً، يمكن الجمع بين النواتج البسيطة الفينوتيبية مع طرق الفحص الجيني، مثل الطفرات الكيميائية أو فحص الحمض النووي الريبي، لتحديد الجينات الضرورية بسرعة لسمية الببتيد RAN. وأخيرا، فإن عمر قصيرة من C. elegans (~ 20 يوما) يسمح للمحققين لتحديد كيفية الشيخوخة، والتي هي أكبر عامل خطر لمعظم أمراض التوسع المتكررة، ويؤثر على سمية الببتيد RAN. معا، هذا المزيج من الصفات التجريبية لا مثيل لها في أي نظام نموذج آخر، ويقدم منصة قوية لدراسة سمية الببتيد RAN.

هنا نصف العديد من المقالات التي تستفيد من المزايا التجريبية لC. elegans لقياس سمية الببتيدات RAN وتحديد المعدلات الوراثية لهذه السمية. يتم وضع علامة على الببتيدات RAN التي بدأتها ATG codon المتنوعة مع GFP ويتم التعبير عنها بشكل فردي في أي من خلايا العضلات تحت مروج myo-3 أو في الخلايا العصبية الحركية GABAergic تحت مروج UNC-47. للتعبير في خلايا العضلات، من المهم أن يتم وضع علامات على الببتيدات RAN السامة مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، أو غيرها من البروتين الفلوري (FP) العلامة التي يمكن استهدافها مع ناقل تغذية RNAi. وذلك لأن التعبير الببتيد RAN السامة عادة ما يمنع النمو، مما يجعل مثل هذه السلالات غير قابلة للحياة. استخدام gfp (RNAi) يعطل بشكل مشروط التعبير الببتيد RAN ويسمح صيانة سلالة، والصلبان الوراثية، الخ. للمقالات ، تتم إزالة هذه الحيوانات من gfp (RNAi)، مما يسمح بالتعبير عن الببتيد RAN والأنماط الظاهرية الناتجة. بالإضافة إلى الاستراتيجية الجزيئية لتصميم الببتيد المتنوعة codon بنيات التعبير، ونحن وصف المقالات لقياس سمية النمو (حركية اليرقات والقدرة على النمو)، والسمية المرتبطة بالعمر بعد النمو (قياس الشلل)، والعيوب المورفولوجية العصبية (فحص commissure).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد codon المتنوعة RAN الببتيد التعبير يبني

  1. تصميم تسلسل الترميز الببتيد RAN الفردية باستخدام codons مرادف للقضاء على بنية الحمض النووي المتكررة الأساسية / الحمض النووي الريبي ولكن الحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية المبالغ فيها.
  2. ترتيب تسلسل codon المخصصة تجاريا في أطوال تكرار اللازمة للدراسات (عادة 5-100 يكرر). قم بتضمين موقع تقييد HindIII في نهاية 5 وموقع تقييد BamHI في نهاية 3 لتسهيل الاستنساخ إلى ناقلات التعبير C. elegans ، مثل pPD95.79.
    ملاحظة: إذا كان توليف أكبر يبني يثبت من الصعب، أصغر تسلسل كتلة البناء يمكن توليفها ومن ثم دمجها في يكرر أكبر باستخدام استراتيجية ربط الاتجاه17.
  3. subclone تسلسل الببتيد في ناقل التعبير C. elegans باستخدام أساليب ربط T4 القياسية.
  4. subclone تسلسل المروج نوع الخلية الخاصة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR أمام تسلسل الببتيد RAN لدفع الأنسجة الخاصة RAN الببتيد-GFP التعبير.
  5. حقن دقيق بناء الببتيد RAN في الغدد التناسلية من نوع البرية C. elegans لتوليد سلالات المعدلة وراثيا تحتوي على صفائف خارج الكروموسومات باستخدام الطرق القياسية18. لعلامة الحقن المشترك، تم استخدام مراسل RFP العضلات محددة(myo-3p::RFP (pCFJ104))، على الرغم من أنه يمكن استخدام علامات أخرى كذلك.
  6. دمج transgene مستقرة في الجينوم باستخدام معيار جيم elegans أساليب فحص التكامل19.
  7. إذا كان الببتيد RAN هو الحيوانات السامة والمعدلة وراثيا لا البقاء على قيد الحياة، تغذية الحيوانات gfp (RNAI) التعبير عن البكتيريا قبل وبعد الحقن لإسكات التعبير عن البروتين السام.
    ملاحظة: إزالة الحيوانات من gfp (RNAi) تمكن التعبير الببتيد RAN للتحليلات الفينوتيبيك باستخدام المقالات الموضحة أدناه.

2. قياس السمية التنموية للببتيدات RAN بعد الضربة القاضية الجينية المستندة إلى RNAi: بروتوكول تحليل سرعة الفيديو

  1. صب معيار النيماتودا نمو المتوسطة (NGM) RNAI 24 لوحات جيدا مع 1 mM isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) و 25 ميكروغرام / مل carbenicillin.
  2. سلسلة من الحيوانات المستنسخة تغذية RNAI في البكتيريا HT115 ليتم اختبارها على مرق لوريا (LB) + carbenicillin (25 ميكروغرام / مل) لوحات أجار وتنمو البكتيريا في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وتشمل ناقلات فارغة (RNAI) كسيطرة إيجابية للسمية وgfp (RNAI) كسيطرة سلبية.
  3. لكل استنساخ، واختيار مستعمرة واحدة في 1 مل من LB + carbenicillin وسائل الإعلام السائلة وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 250 تناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة).
  4. بقعة أربعة آبار فردية من NGM RNAI 24 آبار مع 20 ميكرولتر من الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها التالية: العمود 1 آبار = gfp (RNAI)؛ العمود 2 آبار = (EV) RNAi؛ الأعمدة 3-6 آبار = RNAI ضد الجينات التي سيتم اختبارها. السماح للبكتيريا RNAI للحث على إنتاج dsRNA بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. عزل البيض من يوم واحد الكبار C. elegans التعبير عن TRANSGENE الببتيد RAN المتكاملة باستخدام طريقة هيبوكلوريت القياسية والبذور ~ 30 C. elegans البيض في كل بئر من NGM RNAi 24 لوحة البئر.
  6. احتضان الآبار 24 في 20 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: هذا الوقت الحضانة هو للسلالات التي تعبر عن dipeptides C9orf72 RAN السامة، مثل PR50 أو GR50. قد تتطلب سلالات أخرى أوقات حضانة أقصر لمنع استنفاد مصدر الغذاء البكتيري والمجاعة اللاحقة.
  7. الحصول على أشرطة الفيديو الخفيفة المرسلة باستخدام لايكا MZ16FA ستيريو تشريح المجهر مزودة كاميرا أحادية اللون DFC345FX متصلة جهاز كمبيوتر متوافق مع ويندوز تشغيل لايكا AF برنامج اقتناء الفيديو (الإصدار 2.6.0.7266).
    1. احصل على مقطعي فيديو من بئرين منفصلين لكل حالة من شروط RNAi باستخدام إعدادات اقتناء فيديو متسقة بين الآبار. لكل فيديو، احصل على 10 ثوان بدقة 800 × 600 بكسل و13.16 إطارًا في الثانية (بُعد voxel الزمني = 0.076 ثانية) باستخدام التكبير 18.6X (1.49 إعداد التكبير في برنامج AF). تعيين وقت التعرض للصورة إلى 4 مللي ثانية. تسمية كل فيديو على الفور مع سلالة، وحالة RNAI، وعدد جيد.
  8. أعمى المجرب إلى النمط الجيني المرتبطة بكل ملف فيديو عن طريق عشوائية ترتيب أشرطة الفيديو وتغيير اسم أشرطة الفيديو إلى أرقام. حفظ هذه المجموعة من أشرطة الفيديو كملف جديد. غير أعمى المجرب بعد اكتمال التحليل.
  9. قياس "المسافة سافر" وطول كل الحيوان ل20 الحيوانات المختلفة من كل شريط فيديو، وفحص ما مجموعه ما مجموعه ~ 40 الديدان لكل حالة RNAI.
    1. في البرنامج، حدد زر أدوات التعليق التوضيحي، ثم أداة رسم النص. انقر على نقطة في وسط الدودة التي يتم قياسها في الإطار الأول من الفيديو ووضع علامة عليه كرقم. تقدم الفيديو إلى النهاية أثناء تتبع مسار حركة الدودة بصريًا. في الإطار الأخير، انقر على نقطة في وسط الدودة التي يتم قياسها ووضع علامة على الرقم المقابل التالي. ثم، باستخدام أداة شريط مقياس الرسم، ارسم خطًا من الرقم الأول إلى الرقم الثاني لتسجيل "المسافة المقطوعة".
    2. "المسافة المقطوعة" هي المسافة بين نقطتي السنتين. تظهر هذه المسافة بجوار خط القياس. سجل هذا القياس في جدول بيانات. كرر هذا القياس لـ 19 ديدان أخرى في الفيديو مع الحفاظ على كل قياس فردي في إطار التحليل.
  10. إجراء قياسات من الحيوانات التي تظهر أقوى حركة لتجنب اختيار الحيوانات التي لا تظهر أي حركة وتحيز البيانات نحو الشلل. بمجرد اكتمال القياسات، خذ لقطة من إطار الفيديو النهائي توضح جميع خطوط القياس بحيث يمكن إرجاع البيانات إلى الحيوان الذي نشأت منه.
  11. تحليل البيانات باستخدام جدول بيانات أربعة أعمدة. العمود الأول هو دودة "معرف"، العمود الثاني هو المسافة سافر / الوقت (السرعة).
    1. يمكن العثور على وقت كل فيديو عن طريق النقر على الفيديو تحت التجربة والذهاب إلى خصائص الفيديو.
  12. تطبيع قياس السرعة عن طريق العثور على طول كل الحيوان عن طريق تحديد كمية، ثم إحصاءات عن البرنامج. يجب أن يسمح النقر على أيقونة أداة التعليق التوضيحي على شاشة الفيديو باستخدام أداة "رسم Polyline". ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الأداة لتتبع بحرية C. elegans من الفيديو من غيض من الرأس إلى طرف الذيل. وسيتم تسجيل طول الخط في إطار الإحصاءات.
    1. التقاط لقطة من إطار الفيديو النهائي يوضح كل من متعدد الأسطر المستخدمة لتحجيم C. elegans بحيث يمكن إرجاع البيانات إلى الحيوان الذي نشأت منه.
  13. تحليل البيانات من خلال إضافة عمودين إضافيين إلى جدول البيانات. العمود الثالث هو "طول الحيوان"، والعمود الرابع هو "السرعة العادية" (السرعة / طول الحيوان). تحليل بيانات السرعة العادية باستخدام ANOVA أحادية الاتجاه مع اختبار ما بعد مخصص مقابل متجه فارغ (RNAi).

3. قياس سمية النمو من الببتيد RAN: قياس النمو

  1. اختيار ~ 30 الحيوانات gravid في بقعة 50 ميكرولتر من محلول هيبوكلوريت (10 مل من التبييض، 2.5 مل من 10 N NaOH، 37.5 مل من dH2O) على إما gfp (RNAI)، (EV) RNAI، أو (الجينات محددة) 6 سم لوحة RNAi.
  2. بعد 24 ساعة، نقل ستة ذرية المعدلة وراثيا التي زحفت من بقعة محلول هيبوكلوريت إلى لوحة RNAi 6 سم جديدة مطابقة لشروط RNAi على لوحة التي تعرضت لعلاج محلول هيبوكلوريت. وضع هذه ذرية (F1) في 20 درجة مئوية للنمو والتكاثر.
  3. بعد 24-48 ساعة، اختر 10 الحيوانات L4 المعدلة وراثيا على 6 سم RNAI مطابقة شروط RNAI التي كانت الحيوانات تنمو على. السماح للحيوانات للنبض وضع البيض لمدة 24 ساعة في حاضنة 20 درجة مئوية.
  4. بعد 24 ساعة، قم بإزالة الحيوانات البالغة والتخلص منها. عد عدد البيض ويرقات L1 الموضوعة خلال فترة 24 ساعة باستخدام عداد ميكانيكي محمول باليد. هذا هو الحجم الإجمالي للحضنة.
  5. على مدى 72 ساعة القادمة، عد عدد الحيوانات التي تصل إلى المرحلة L4 أو أقدم. كما يتم حساب كل الحيوانات، إزالته من لوحة.
  6. قياس "نمو النسبة المئوية" كنسبة مئوية من الحيوانات التي تصل إلى المرحلة L4 أو أقدم من إجمالي حجم الحضنة.
  7. إجراء اختبار دقيق 2 × 2 فيشر مقابل متجه فارغ (RNAI) لتحديد ما إذا كان النمو في المئة ذات دلالة إحصائية. وفئات المقارنة هي "النمو" (# للحيوانات التي وصلت إلى المرحلة L4 أو الأكبر في 72 ساعة) و "لا نمو" (إجمالي حجم الحضنة ناقص عدد الحيوانات التي تصل إلى L4 أو المرحلة الأكبر في 72 ساعة).

4. بعد النمو RAN الببتيد الشلل say

  1. الحفاظ على السلالات المتحولة C. elegans التعبير عن الببتيد ران-GFP في العضلات على gfp(RNAI) عن طريق وضع 4-6 L4 المعدلة وراثيا على لوحة gfp6 سم (RNAi) وتنمو الديدان في 20 درجة مئوية.
  2. إذا كانت التجربة تستخدم RNAI لاختبار الآثار الوراثية على سمية الببتيد RAN ، قم بنقل 10 بالغين من gravid المعدلة وراثيا من لوحة غير جائعة إلى كل متجه فارغيبلغ من 6 سم (RNAi) (التحكم الإيجابي في الشلل ، والتحكم السلبي في الآثار الوراثية) ، gfp (التحكم السلبي في الشلل ، التحكم الإيجابي للتأثيرات الوراثية) ، محدد للجينات(RNAi) (أي 10 بالغين من gravid لكل 6 سم).
  3. إذا تم استخدام المسوخ لتحليل الآثار الوراثية على سمية الببتيد RAN ، ضع 10 WT gravid أو الحيوانات المتحولة التي تعبر عن نفس TRANSgene RAN على كل من اثنين من متجه فارغ ينساب(RNAi) أو gfp (RNAi) لوحات. تنمو الديدان في 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  4. اختيار 10 مجموعات من 10 L4 المعدلة وراثيا من لوحات RNAI 6 سم ووضع كل مجموعة على لوحة RNAI 3 سم (أي ن = 100 الحيوانات لكل النمط الجيني). تأكد من أن L4 المحددة للكشف عن كل من حركية طبيعية ظاهريا. ضع اللوحات داخل كيس تخزين سستة للاحتفاظ بالرطوبة.
  5. ضع الأطباق المعبأة مع L4 في حاضنة 25 درجة مئوية.
  6. إزالة الحيوانات 24 ساعة في وقت لاحق من حاضنة 25 درجة مئوية سلالة واحدة في وقت واحد لتقليل مقدار الوقت الذي هم خارج في RT.
  7. اضغط على لوحات على المجهر تشريح للتحقق من الحركة. إذا كانت الحيوانات تتحرك أكثر من طول الجسم، عد الحيوان على أنها متنقلة ونقلها إلى لوحة RNAI 3 سم جديدة. استخدم يقطف البلاتين للاستفادة من الديدان المتبقية على الرأس أو الذيل. إذا كان الحيوان يتحرك أكثر من طول الجسم، عد الحيوان على أنها متنقلة ونقلها إلى لوحة RNAI 3 سم جديدة.
    ملاحظة: لا تتجاوز 10 ديدان لكل لوحة عند النقل. كن حذرا لتجنب نقل ذرية إلى لوحة RNAI الجديدة لأن ازه يعتمد على اتباع الحيوانات العمر فقط.
  8. تجميع جميع الديدان غير المتحركة معا بحيث يمكن بسهولة الكشف عن حركة أكثر من طول الجسم. إعطاء الحيوان دقيقة واحدة على الأقل لتحريك أكثر من طول الجسم واحد. إذا كان لا يزال لا يتحرك ، فإنه مشلول ، معبأ (أي اليرقات فقست داخل الأم) ، أو ميتة.
  9. فرض رقابة على الحيوانات التي تعرض التعبئة، والتحلل على جانبي اللوحة، أو تعرض الأمعاء المقذوفة، أو الجحر، أو تصبح ضائعة، أو تموت من المقادير وقت الكشف. يتم حساب الديدان المشلولة ، وتترك على لوحة RNAi القديمة ، والتخلص منها.
  10. يسجل الحيوانات للشلل كل يوم لمدة 5-7 أيام كما هو موضح في الخطوات 4.6-4.9.
  11. تحليل بيانات الشلل باستخدام اختبار ترتيب السجل المطابق للاختبار المستخدم لتحليل العمر. في هذا التحليل الإحصائي ، يتم تسجيل الديدان المتحركة على أنها "على قيد الحياة" ، ويتم تسجيل الديدان المشلولة على أنها "ميتة" ، ويتم تسجيل الميت ، المعبأ ، الأمعاء المقذوفة ، المجففة ، المحفورة ، أو الديدان المفقودة باسم "الرقابة".
    ملاحظة: في هذا التحليل، يشير رقم "النسبة المئوية على قيد الحياة" إلى الحيوانات "النسبة المئوية المتحركة". المعكوس يمثل "في المئة مشلول". استخدم أداة التحليل عبر الإنترنت OASIS(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)لإجراء التحليلات الإحصائية ذات الترتيب.

5. قياس أمراض الخلايا العصبية: شهادة Commissure

  1. توليد المتحولين جنسيا C. elegans التعبير عن الببتيد RAN من الاهتمام في الخلايا العصبية GABAergic باستخدام المروج UNC-47. كما أعرب عن UNC-47p::GFP أو UNC-47p::RFP للكشف عن مورفولوجيا الخلوية للخلايا العصبية GABA.
  2. اختيار 50 الحيوانات L4 المعدلة وراثيا ووضعها على لوحة OP50 6 سم في 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. نقل الحيوانات 50 المعدلة وراثيا على لوحة جديدة 6 سم OP50 في 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. جعل منصات agarose لتصوير الحيوانات تحت المجهر واسعة.
    1. ضع قطعتين من الشريط فوق مزلقان مجهري. ضع شريحة نظيفة بدون شريط في منتصف الشرائح المسجلة.
    2. الاستغناء ~ 100 μL (1 قطرة من ماصة باستور البلاستيك المتاح) من agarose المنصهر 3٪ على الشريحة الوسطى مع ماصة نقل معقمة المتاح.
    3. وضع على الفور شريحة نظيفة ثانية عبر قطرة من agarose المنصهرة بحيث تقع على الشرائح المسجلة ويخلق طبقة رقيقة وحتى من agarose بين الشرائح.
    4. بعد أن يبرد الاغاروز وينتق، قم بإزالة المزلقان بعناية مع طبقة الأغروز بينهما، دون فصلهما، ووضعهما في كيس بلاستيكي مع قطعة ورق مبللة تحتهما. جعل شريحة واحدة لكل 10 الديدان لفحصها جنبا إلى جنب مع ثلاث شرائح إضافية.
  5. إزالة المتحولين جنسيا C. elegans من حاضنة 25 درجة مئوية واختيار 10 المتحولين جنسيا C. elegans في قطرة 100 ميكرولتر من 10 mM levamisole في شريحة الاكتئاب الزجاج. الاحتضان لمدة 10 دقيقة أو حتى تصاب الحيوانات بالشلل.
  6. إزالة زوج الشريحة من كيس من البلاستيك وفصلها بعناية. تسمية الشريحة مع agarose مع النمط الجيني وإضافة 2 μL من 10 mM levamisole إلى منتصف agarose. نقل الحيوانات 10 في ليفاصومل على وسادة agarose. تغطية الحيوانات مع #1 غطاء سمك.
  7. صورة الحيوانات التي يتم توجيه الفرج بحيث يكون على الجانب الأيمن من الحيوان. إذا كان الفرج على الجانب الأيسر من الرأس ، فإن مفوضيات الخلايا العصبية الحركية ستكون تحت الحيوانات وليست مرئية بوضوح ، مما يجعل التحديد الكمي الدقيق صعبًا. حذف التحديد الكمي من هذه الحيوانات. في هذا التوجه، وcommissures من الخلايا العصبية الحركية هي الأقرب إلى coverslip ومرئية بوضوح على المجهر الفلوري واسعة الحقل مقلوب. تصور commissures الخلايا العصبية التعبير عن GFP مع لايكا DMI4000B مقلوب واسع field الفلورية المجهر مع 63X 1.4X NA عدسة الغمر النفط ومجموعة مرشح L5 لايكا (Ex480/40nm; Em527/30nm). إذا كانت مفوضيات الخلايا العصبية التعبير RFP بدلا من GFP, الاستفادة من مجموعة تصفية LEICA TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. تصور commissures الخلايا العصبية التعبير عن GFP مع المجهر الفلوري واسعة الحقل مقلوب مع عدسة غمر زيت 63x 1.4x NA ومجموعة مرشح GFP (Ex480/40 نانومتر; Em527/30 نانومتر). إذا كانت مفوضيات الخلايا العصبية تعبر عن RFP بدلاً من GFP ، فاستخدم مجموعة فلتر البروتين الفلوري الأحمر (RFP) (Ex560/40 نانومتر. Em 645/75 نانومتر).
  8. صورة الديدان في غضون 45 دقيقة من وضع غطاء على الديدان للحد من السمية من شل الحركة.
  9. لكل دودة، عد عدد المفوضات المرئية. هناك 16 commissures مرئية في الحيوانات البرية نوع. عد أيضا عدد من المفوضات التي لديها حبات كبيرة (أي blebs) في commissures فضلا عن عدد من commissures التي يتم كسرها. للتأكد من كسر commissure، اتبع commissure من الحبل الظهري إلى الحبل البطني عن طريق ضبط المستوى البؤري.
    ملاحظة: تعتبر المفوضات التي يظهر فيها unc-47p::GFP fluorescence فجوة مكسورة. عادة ً ما يحتوي commissure المكسور على جزء من جانبي الاستراحة ، مما يساعد على إظهار أن المفوضات مكسورة. عد كمية من البليب وفواصل ل20 الديدان.
  10. حساب جزء من commissures مع blebs أو فواصل على العدد الإجمالي للcommissures لوحظ لكل الحيوان. يمكن أيضًا قياس العدد المطلق للمفوضيات التي يتم حسابها لكل الحيوان (بما في ذلك النوع البري والأنواع المنكسرة والأحداث المكسورة).
  11. لكل فئة، قم بحساب متوسط ± SD وتحليل إحصائياً إما مع اختبار t للطالب للمقارنة بين مجموعتين من السكان، أو ANOVA أحاديالاتجاه للمقارنات بين 3 مجموعات سكانية أو أكثر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمنا المقالات الموصوفة هنا لتقييم تأثير موانع الجينات المختلفة على سمية الـ RAN dipeptides الموجودة في مرضى ALS الذين يعانون من توسع تكرار G4C2. باستخدام قياس النمو لقياس سمية النمو، قمنا بتحليل آثار العديد من المسوخ الجينية بالضربة القاضية التي تم تحديدها في مثبطات شاشة RNAi على نطاق الجينوم من سمية PR50-GFP التي تعبر عنها العضلات. في حين أن التعبير عن PR50-GFP وحدها أدت إلى اعتقال النمو المزعجة تماما, فقدان الطفرات وظيفة في العديد من الجينات قمعت سمية نمو العلاقات العامة من 12-94%

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نبلغ عن الطرق التي يمكن استخدامها لاساي RAN الببتيد سمية على غرار في العضلات أو في الخلايا العصبية من C. elegans. في حين أن البروتينات العصبية التنكسية لها نمط ظاهري في بداية العمر في المرضى البشريين ، فإنها يمكن أن تظهر أيضًا سمية تنموية عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الأنظمة النموذجية. التعبير المفرط له قيود تفسيرية كبيرة ، ولكنه يوفر أيضًا نقطة انطلاق قوية للشاشات الوراثية أو الدوائية التي تهدف إلى تحديد الجينات أو الأدوية التي يمكن أن تعكس الأنماط الظاهرية السامة. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى أن النم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعاهد القومية للصحة R21NS107797

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري 35 مم × 10 مم ،منتجاتCELLTREAT 50-202-036ألواح نمو الديدان الخيطية وأنظمة تشخيص RNAi
AGAR المحببة 2 كيلوغراممن الدينار الدينيةألواح نمو الديدان الخيطية وتقنيات RNAi
AGAROROSE ULTRAPURE LIFEالحقن المجهري لتوليد سلالات معدلة وراثيا من ببتيد RAN
كاربينيسيلين 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485ألواح نمو الديدان الخيطية ونظارات غطاء RNAi
رقم 1 22 مم 1 أونصة / PKTHERMO SCIERIE 12542Bالتصوير لفحص المحاسبة
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSالحقن المجهري لتوليد سلالات RAN الببتيد المعدلة وراثيا
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCIERIE 125485Cالحقن المجهري لتوليد سلالات ببتيد RAN المعدلة وراثيا
Fisherbrand  Superfrost Plus مجهر الشرائحTHERMO SCI ERIE12-550-15التصوير لفحص commissure
Gibco & nbsp ؛ باكتو بيبتون Gibco DF0118-17-0ألواح نمو الديدان الخيطية وزيت الهيلوكربون RNAi
700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLالحقن المجهري لتوليد سلالات RAN الببتيد المعدلة وراثيا
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSلوحات نمو الديدان الخيطية وبرنامج التصوير الفلوري المتقدم RNAi
LeicaLeica MicrosystemsLAS-AFبرنامج الحصول على الصور لتحليل سرعة الفيديو ومقايسة التقييم
لايكا الغمر نوع N (زيت)W NUHSBAUM INCNC9547002 التصوير لمقايسة المحاسبة
ليفاميزول هيدروكلوريد 10 غرامحراري SCI ACROS العضويةالتصوير لفحص
المحاسبة نصائح اللودر الدقيق 2 × 96 قطعةEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003الحقن المجهري لتوليد سلالات RAN الببتيد المعدلة وراثيا

طبق PETRI ، 60X15MM ، 500 / CS		البلاستيكيةCORNING LIFE Sciences ولوحة
عبادة أنسجة RNAi 24WEL 50 / CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721لوحات نمو الديدان الخيطية و RNAi
علمية معقمة DF0145070 16500500 E5242952008 BP162010 AC187870100 لوحات نمو الديدان الخيطية FB0875713A

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877(2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87(2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494(2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C elegans RNAi RPN7 DAF 2

مقالات ذات صلة