مقالة منهجية

عكس النسخ حلقة بوساطة Isothermal التضخيم (RT-LAMP) القول للكشف المحدد والسريع لفيروس بحيرة البلطي

DOI:

10.3791/61025

⸱

مايو 18, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science, King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS), King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم قياس RT-LAMP للكشف عن TiLV في أسماك البلطي باستخدام أدوات بسيطة على مدى فترة قصيرة نسبيًا من الزمن مقارنة بتقنيات RT-PCR التقليدية. وقد يساعد هذا البروتوكول في مكافحة انتشار وباء الـ TiLVD، ولا سيما في البلدان النامية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل مرض فيروس بحيرة البلطي (TiLVD)، وهو مرض فيروسي ناشئ في البلطي بسبب فيروس بحيرة البلطي (TiLV)، تحدياً مستمراً في صناعة تربية الأحياء المائية أدى إلى الاعتلال والوفيات الجماعية للبلطي في أجزاء كثيرة من العالم. ولذلك فإن الفحص التشخيصي الفعال والسريع والدقيق لعدوى التيلفي ضروري للكشف عن العدوى الأولية ومنع انتشار المرض في تربية الأحياء المائية. في هذه الدراسة، يتم تقديم طريقة التضخيم اللابدي (RT-LAMP) الحساسة للغاية والعملية للنسخ العكسي (RT-LAMP) للكشف عن فيروس بحيرة البلطي في أنسجة الأسماك. وكشفت مقارنة بين العينات المصابة بـ RT-qPCR وRT-LAMP عن نتائج إيجابية في 63 (100%) و51 (80.95%) عينات، على التوالي. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل للعينات غير المصابة أن جميع الأنسجة غير المصابة البالغ عددها 63 أنسجة أسفرت عن نتائج سلبية لكل من المقالات RT-qPCR و RT-LAMP. تم تقييم التفاعل المتبادل مع خمسة مسببات الأمراض في البلطي باستخدام RT-LAMP ، وأظهرت جميع الاختبارات نتائج سلبية. وأظهرت كل من عينات الكبد والمخاط التي تم الحصول عليها من الأسماك المصابة نتائج مماثلة باستخدام طريقة RT-LAMP، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام المخاط في RT-LAMP كفحص غير قاتل لتجنب قتل الأسماك. وفي الختام، أظهرت النتائج أن فحص RT-LAMP المقدم يوفر طريقة فعالة للكشف عن TiLV في أنسجة البلطي في غضون ساعة واحدة. ولذلك يوصى بهذه الطريقة كأداة فحص في المزارع للتشخيص السريع لـ TiLV.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض فيروس بحيرة البلطي (TiLVD) هو مرض فيروسي في البلطي(Oreochromis spp.) الذي يتسبب في وفيات البلطي في العديد من مناطق العالم، بما في ذلك آسيا1،,2،أفريقيا، وأمريكا. وقد تم التعرف على المرض لأول مرة خلال الوفيات الجماعية للبلطي في عام 2009 في إسرائيل، حيث انخفض عدد البلطي البري في بحيرة كنريت بشكل كبير من 257 إلى 8 أطنان في السنة2. ويتسبب هذا المرض من فيروس بحيرة البلطي (TiLV), التي تم تعيينها للأسرة Amnoonviridae كجنس جديد فيروس البلطي والأنواع الجديدة البلطي فيروس3. التوصيف الجيني لTiLV أظهرت أن الفيروس هو رواية مغلفة، المعنى ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة كاسيسارت، بانكوك، تايلند على هذه التجربة، التي شملت استخدام الأنسجة الحيوانية(

1. جمع الأنسجة

  1. القتل الرحيم سمك البلطي باستخدام جرعة زائدة من زيت القرنفل (أي أكثر من 3 مل / لتر). يمكن استخدام الميثانسولفونات التريكين كبديل لزيت القرنفل.
  2. استخدام مقص مايو المعقم والملقط لقطع فتح البطن من البلطي بعد الوفاة والمكوس ما يقرب من 30-50 ملغ من أنسجة الكبد، أو باستخدام المجهر غطاء الزجاج، وجمع 100 ميكرولتر من المخاط عن طريق كشط طبقة جلد السمك طولي (من الأمامي إلى الخلفي) إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيقة.
  3. انتقل إلى خطوة استخراج الحمض النووي الريبي ع....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In this study, an RT-LAMP assay was developed to detect TiLV infection in tilapia. تم جمع العينات المختبرة من 14 مزرعة تقع في أجزاء مختلفة من تايلاند بين عامي 2015 و 2016. تم تجميع الأسماك المصابة وغير المصابة في المقام الأول على أساس التشخيص البدني وظهور أعراض TiLVD. وقد تأكدت عدوى TiLV في وقت لاحق باستخدام RT-PCR بعد عملية الجمع. تم اختيار الجيل الكهربي Agarose والكشف عن اللون الأخضر الإنارة كطرق التقييم من amplicons مصباح(الشكل 2). يتميز الكبد والمخاط من الأسماك البلطي المصابة وغير المصاب.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض صناعة الاستزراع المائي باستمرار للتهديد من قبل العدوى الفيروسية التي تسبب خسائر اقتصادية كبيرة9,23,28. على سبيل المثال ، يمثل TiLV الناشئ تهديدًا كبيرًا للبلدان المنتجة للبلطي في أجزاء كثيرة من العالم1،6،9. حتى الآن، لم تكن هناك علاجات محددة متاحة لمنع TiLVD. وفي حين أن تطوير اللقاح مستمر، فإن اللقاح الفعال سيتطلب وقتاً كبيراً قبل.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل المشروع ماليا من قبل صندوق البحوث التايلاندية (TRF) رقم منحة RDG6050078 ومركز الدراسات المتقدمة للزراعة والأغذية، معهد الدراسات المتقدمة، جامعة كاسيسارت، بانكوك، تايلاند في إطار مشروع تعزيز بحوث التعليم العالي وجامعة البحوث الوطنية في تايلاند، مكتب لجنة التعليم العالي، وزارة التعليم، تايلاند. يتم دعم البحث جزئيًا من خلال منحة برنامج الدراسات العليا من كلية الدراسات العليا، جامعة كاسيسارت. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور كوانراوي سيريكانشانا على السرد الذي تحدث عن الفيديو وبياوسارا سيكارين لتحرير الفيديو.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > جمع الأنسجة: < / قوي >
زيت القرنفلBetter PharmaN / A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521خيار بديل لاستخراج
الحمض النووي الريبي لزيت القرنفل:
كاشف حمض جوانيدينيوم - فينول (كاشف TRIzol) ThermoFisherScientific Corp.15596026
كاشف حمض جوانيدينيوم الفينول (كاشف GENEzol) مجموعةGeneaidGZR100
Direct-zol RNA:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash
Buffer- ماء
- أعمدةZymo-spin IIICG
- أنابيب
التجميع<قوية>RT-LAMP: < / قوي>
1x SD II تفاعل عازلةBiotechrabbitBR1101301
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP مجموعةBiolineBIO-39053
خليط البيتينسيجما ألدريتشB2629
الكالسيينميرك1461-15-0
Bst DNA polymeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV النسخ العكسيPromegaM510A
المياه الخالية من NucleaseInvitrogen10320995
حاضنة الحمام الجاف Elite ، وحدة واحدةرئيسيةالعلومEL-01-220<
strong> Gel electrophores: < / strong>
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) العازلةSigma-AldrichSRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE):
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- حمض الخليك (جليدي) ، EMSUREMerck Millipore1000632500
- ثنائي الصوديوم إيثيلين ديامين تترا أسيتات ثنائي هيدرات (EDTA) ، VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co.، Ltd.GR107
تحميل هلام الحمض النووي (6X)شركة ThermoFisher Scientific Corp.الحمض النووي R0611
Vivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (نظام الرحلان الكهربائي الأفقي)Bio-Rad1704487
PowerPac HC مزود الطاقةBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
صينية عينة الأشعة فوق البنفسجيةBio-Rad1708271
Nα تصوير BINeogene Science
< قوي > توليف cDNA: < / قوي>
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA SynthesisKit Vivantis TechnologiescDSK01خيار بديل لتخليق (كدنا
NanoDrop2000 (مقياس الطيف الضوئي للحجم الصغير)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR: < / strong>
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
مياه خالية من النوكلياز ، ماء معقمMultiCell809-115-CL
8-Tube شرائط PCR ، أبيضBio-RadTLS0851
أنبوب PCR مسطح 8 أغطية شرائط ،بصري Bio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
<قوي > المعدات والمواد العامة: < / قوي>
مقصN / A
ملقطVortex
Genie 2 (خلاط دوامة)علمي الصناعات أجهزة
الطرد المركزي الدقيقة LM-60LioFugeCM610
Corning LSE أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المصغرةCorning6765
PipettesRaininPipete-Lite-Lite XLS
QSP أطراف ماصة مصفاةالجودة البلاستيك العلمي TFسلسلة
Corning Isotip نصائح مصفاةسلسلة MerckCLS
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل خالية من النوكلياز ، NESTWuxi NEST التكنولوجيا الحيوية615601
خال من DNase / RNase صبغة سلم وعلامات ) Mayo

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinic....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة