مقالة منهجية

في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي

DOI:

10.3791/61037

⸱

مايو 1, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخدام الزحام الجزيئي الكلي لإنشاء نموذج ندبة تضخمية في المختبر يشبه في ظروف الجسم الحي. عندما تزرع في بيئة جزيئات ية كبيرة مزدحمة، الخلايا الليفية الجلد الإنسان عرض الأنماط الظاهرية، والكيمياء الحيوية، وعلم وظائف الأعضاء، وخصائص وظيفية تشبه ندبا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ثبت أن في أنسجة الجسم الحي مزدحمة للغاية من البروتينات والأحماض النووية، والبروتينات الريبونوكليو، السكريات، الخ. البروتوكول التالي يطبق تقنية الزحام الجزيئي الكلي (MMC) لمحاكاة هذا الازدحام الفسيولوجي من خلال إضافة البوليمرات المحايدة (الزاحمة) إلى ثقافات الخلايا في المختبر. الدراسات السابقة باستخدام Ficoll أو dextran كما crowders تثبت أن التعبير عن الكولاجين الأول وfibronectin في خطوط الخلايا WI38 و WS-1 يتم تعزيزها بشكل كبير باستخدام تقنية MMC. ومع ذلك، لم يتم التحقق من صحة هذه التقنية في الخلايا الليفية البشرية المشتقة من الندبة الأولية المشتقة من الندبة (hHSFs). كما تندب تضخم ينشأ من الترسب المفرط للكولاجين, يهدف هذا البروتوكول إلى بناء الكولاجين الغنية في نموذج ندبة فرط الترو عن طريق تطبيق تقنية MMC مع hHSFs. وقد ثبت هذا النموذج الأمثل MMC لامتلاك المزيد من أوجه التشابه مع في ندبا في الجسم الحي مقارنة مع التقليدية 2 الأبعاد (2-D) أنظمة زراعة الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه فعال من حيث التكلفة، وموفر للوقت، ومرغوب فيه أخلاقيا ً مقارنة بالنماذج الحيوانية. ولذلك, النموذج الأمثل ذكرت هنا يقدم متقدمة "في الجسم الحي مثل" نموذج للدراسات ذات الصلة ندبة تضخم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة ندبة يمثل نقطة النهاية لإصلاح الأنسجة. ومع ذلك ، في العديد من الأفراد ، وخاصة أولئك الذين يعانون من حروق أو صدمة1، يمكن أن تكون الندوب مفرطة وتفرض آثارًا غير مرغوب فيها على مورفولوجيا وعمل الجلد الشفاء. على الرغم من أن الآليات الدقيقة للإصابة المرضية (الندوب الضخامية والقناق) هي تشكيل ندبة غير مفهومة تماما، وقد ثبت ترسب مفرط من الكولاجين أثناء التئام الجروح لتكون مساهمة أساسية2.

ومن الثابت أن تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-α1) وألفا العضلات الملساء actin (αSMA) تلعب أدوارا رئيسية في تشكيل ندوب تضخمي. تشير الأدلة إلى أن ارتفاع TGF-α1 يحفز مباشرة الترسب المفرط للكولاجين عن طريق تنظيم مسار إشارة SMAD3. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على αSMA للمساهمة في تكوين ندبة تضخمية من خلال تنظيم تقلص الخلايا وreepithelialization في عملية التئام الجروح4. عدم وجود مناسبة في المختبر وفي نماذج على الجسم الحي هو عائق رئيسي أمام تطوير وتقييم التدخلات والعلاجات لمعالجة ندبة. والهدف من هذه الدراسة هو استخدام تقنية MMC القائمة لبناء نموذج ندبة تضخمية "تشبه الجسم الحي" مناسبة لتقييم التدخلات الجديدة والناشئة المتعلقة بالندبة.

كان استنساخ الأنسجة الحية خارج الجسم هدفًا لسنوات في المجتمع العلمي. وقد حقق تطوير التقنيات المختبرية في أوائل القرن العشرين هذا الهدف جزئياً. وقد تطورت حاليا في تقنيات المختبر قليلا من عرض رو الأصلي أن الخلايا الجنينية يمكن البقاء على قيد الحياة على قيد الحياة على سبيل الكيفو لعدة أيام في الملاخطالدافئ5. ومع ذلك ، تقتصر في المنهجيات المختبرية في الغالب على أنواع الخلايا المفردة المزروعة في 2-D ولا تُلخص الأنسجة بدقة في الجسم الحي. في حين مفيدة لفحص الكيمياء الحيوية للخلايا، وعلم وظائف الأعضاء، وعلم الوراثة، والأنسجة الأصلية هي 3-D ودمج أنواع متعددة من الخلايا. بسيطة 2-D في أنظمة المختبر تخضع خلايا الثدييات لبيئات اصطناعية للغاية حيث يتم فقدان العمارة الخاصة بالأنسجة الأصلية6. بدوره، وهذا يؤثر على الأحداث داخل الخلايا وخارج الخلية، مما أدى إلى مورفولوجيا الخلايا غير طبيعية، علم وظائف الأعضاء، والسلوك7.

يكمن الاهتمام وراء هذا البروتوكول في تطوير وإدارة السريرية للندوب الضخامية والنُكُر. في حين أنه من الثابت أن الخلايا الليفية الجلدية هي المسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج وفيرة من الكولاجين الموجودة في الأنسجة ندبا، وزراعة الخلايا الليفية الجلدية باستخدام 2-D في النظم المختبرية فشل في استنساخ دوران الكولاجين لوحظ في الجسم الحي8. المعاصرة في أساليب المختبر لا تزال تستخدم أساسا "المالحة الدافئة"، بيئة مختلفة تماما عن تلك الموجودة في الأنسجة الحية. الأنسجة في الجسم الحي مزدحمة للغاية، مع البروتينات والأحماض النووية، والبروتينات الريبونوكليو، والسكريات، وتحتل 5٪-40٪ من الحجم الإجمالي. كما لا يوجد جزيئين يمكن أن تشغل نفس المساحة في نفس الوقت، وهناك مساحة حرة قليلة المتاحة وغياب كامل تقريبا من الماء الحر9.

تفرض تقنية MMC قيودًا تؤثر على الخصائص الحرارية للسيتوسول والسوائل الخلالية. التفاعلات الجزيئية، مستقبلات ligand إشارات المجمعات، والإنزيمات، والعضيات تقتصر على التفاعل بحرية9. كما أن التفاعلات داخل البيئة المحيطة بالخلية (أي الإنترستيوم) مقيدة أيضاً. تؤكد الأدلة الحديثة أن التركيزات العالية من الجزيئات الكلية الخاملة في حلول مزدحمة تعكر الانتشار، والارتباط المادي، واللزوجة والخصائص الهيدروديناميكية10.

ومن المثير للاهتمام، العديد من وكلاء الحشد شعبية (أي فيكول، dextran، polyvinylpyrrolidone [PVP]، والصوديوم 4-styrenesulfonate [PSS]) ليست متساوية عند تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا وفي إعدادات مختلفة. في دراسة سابقة واحدة، أفيد فيكول أن تكون أقل سمية للخلايا الخلايا الجذعية mesenchymal بالمقارنة مع PVP. وقد فسرت هذه النتائج على أنها نتيجة لشحنتها المحايدة ونصف قطرها الهيدروديناميكي الصغيرنسبياً 11. في المقابل، وجدت دراسة ثانية أن dextran هو أكثر فعالية في تحفيز الكولاجين الأول ترسب من الخلايا الليفية الرئة البشرية مقارنة مع فيكول12. تشير البيانات الواردة من دراستنا الخاصة إلى أن فيكول يعزز ترسب الكولاجين بواسطة الخلايا الليفية المشتقة من الندبة الضخامية ، في حين أن PVP سام لهذه الخلايا13.

وقد ثبت أن تحويل procollagen إلى الكولاجين هو أسرع في بيئة مزدحمة للغاية في الجسم الحي14، في حين يتم تأخير معدل التفاعلات البيولوجية في نظام الثقافة المخفف 2 -D15. لقد قمنا بتحسين بروتوكول المختبر هنا ، ودمج MMC لإظهار زراعة الخلايا الليفية الجلدية بمثابة نموذج أكثر "في الجسم الحي" للتليف الجلدي وتشكيل الندبة. على النقيض من نظام الثقافة المشتركة 2-D، زراعة hHSFs مع MMC يحفز التمثيل الحيوي وترسب الكولاجين بشكل ملحوظ13. وتجدر الإشارة إلى أن الخصائص الأخرى للتليف (أي زيادة التعبير عن مصفوفة المعادن [MMPs] والسيتوكينات البرولية) واضحة أيضاً في إطار هذا البروتوكول الأمثل MMC13. عند زراعتها باستخدام هذه الطريقة ، يظهر أن الخلايا الجلدية تُلخص المعلمات الفسيولوجية والبيوكيميائية والوظيفية التي تقاس في الجسم الحي.

وقد استخدمت MMC الأمثل في بروتوكول المختبر لتقييم التعبير عن الكولاجين والبروتينات ECM الأخرى بواسطة الخلايا الليفية الجلدية معزولة عن الأدمة ندبة تضخم يفرط في التأثر والأدمة المجاورة غير المعنية. عندما تزرع في بيئات MMC في المختبر، وقد لوحظ أن hHSFs التعبير عن خصائص معينة (مثل، مرنا، الكيمياء الحيوية، علم وظائف الأعضاء، والنمط الظاهري) مماثلة لأنسجة ندبة فرط التغذية الجلدية في الجسم الحي. وتشير الأدلة إلى أن الخصائص الفيزيائية والكيميائية هي اعتبارات هامة عند اختيار الزحام وتحسين ظروف MMC للزراعة في المختبر.

لإثبات المبدأ ، يتم تطبيق بروتوكول MMC هنا لتقييم نوعي وكمي لقدرة شيكونين ونظائرها على الحث على الخلايا المبرمجة. وهذا يسمح بتقييم التطبيقات المحتملة لهذه المركبات الطبية الصينية التقليدية المشتقة بشكل طبيعي (TCM) لإدارة ندبات الجلد13. وعلى الرغم من ذلك، فإن بساطة هذا البروتوكول في المختبر وفعاليته من حيث التكلفة وحسن توقيته يفي أيضاً باللوائح الحديثة للقضاء على التجارب في الثدييات بموجب توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU ووكالة حماية البيئة الأمريكية( EPA).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الخلية

  1. الحفاظ على hHSFs والخلايا الليفية الجلدية العادية المستمدة من الأنسجة غير المرضية (hNSFs) في المتوسط جلبكو تعديل (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 1٪ v / v البنسلين / محلول العقديات (P / S) في 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2/ 95٪ الهواء.
  2. شراء فيكول 70، فيكول 400، وحمض الأسكوربيك من الشركات المناسبة.

2. بناء نموذج ندبة الضخامة MMC

  1. البذور hHSFs أو hNSFs (50،000/well) في لوحة بئر 24 تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام في كل بئر.
  2. مكان في حاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 وترك بين عشية وضحاها.
  3. إعداد وسائل الإعلام MMC. استناداً إلى الحجم الإجمالي المطلوب للتجربة، وإنتاج 10٪ FCS/DMEM وسائل الإعلام عن طريق خلط فيكول 70 (18.75 ملغ / مل)، فيكول 400 (12.5 ملغ / مل)، وحمض الأسكوربيك (100 ميكرومتر).
  4. ضع الخليط في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتفريق الحشود في المحلول ، ثم قم بتعقيم وسائط MMC باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر.
  5. يُستنسخ الوسائط المستهلكة واستبدلها بوسائط MMC المصنوعة حديثًا.
  6. احتضان الخلايا لمدة 6 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،وتغيير وسائل الإعلام كل 3 أيام.

3. التعبير عن الكمية الإجمالية للكولاجين

  1. إعداد حل سيريوس الأحمر (0.1٪ ث / في). حل 0.2 غرام من مسحوق الأحمر المباشر 80 في 200 مل من الماء المقطر اللاين (ddH2O) مع 1 مل من حمض الخليك.
  2. يُستعُر الوسائط MMC وأضف 300 ميكرولتر من محلول Sirius Red إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  3. شطف بلطف الحل الأحمر سيريوس مع مياه الصنبور والسماح للصفيحة لتجف الهواء بين عشية وضحاها.
  4. استخراج وصمة عار سيريوس الأحمر عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم (0.1 M) في كل بئر. ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 5-10 دقيقة لاستخراج وصمة عار سيريوس الحمراء بالكامل.
  5. نقل 100 ميكرولتر من البقعة الحمراء سيريوس المستخرجة إلى لوحة 96 شفافة جيدا وقياس امتصاص في 620 نانومتر باستخدام قارئ microplate.

4. التعبير عن الكولاجين الأول (مناعة)

  1. غسل الآبار باستخدام 200 ميكرولتر من المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS، درجة الحموضة = 7.35).
  2. إصلاح الخلايا باستخدام الميثانول (500 ميكرولتر / بئر) في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. منع التفاعلات غير المحددة مع 3٪ من الزلّف الأبقاري للحصول على 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. يستنشق محلول الحجب ويحتضن بـ 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكولاجين I (10 ميكروغرام/مل) لمدة 90 دقيقة في RT.
  5. يستنشق الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3x مع PBS لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
  6. احتضان مع 200 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب-FITC الأجسام المضادة الثانوية (1:400 تخفيف) و 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 تخفيف) لمدة 30 دقيقة في RT. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم.
  7. تجاهل كل من الأجسام المضادة الثانوية وDAPI وغسل 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
  8. تصور تلطيخ الفلورسينس مباشرة تحت المجهر.

5- النشاف الغربي

  1. غسل الخلايا 2x مع برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 40 ميكرولتر من العازلة اللايس في كل بئر وكشط طبقة الخلية مع تلميح ماصة. المخزن المؤقت المحلول يحتوي على العازلة RIPA، كوكتيل مثبطات البروتياز (الموافقة المسبقة عن علم)، 2 mM فانات الصوديوم، و10 mM فلوريد الصوديوم.
  3. نقل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقياس تركيز البروتين باستخدام قياس البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة16.
  4. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين من كل مجموعة في الآبار من 4٪-12٪ بيس تريس بروتين المواد الهلامية. تنفيذ كبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE) في 200 V لمدة 30 دقيقة.
  5. نقل البروتين إلى غشاء النيتروسيللوز عن طريق تشغيل لطخة غربية في 90 V لمدة 90 دقيقة. تجنب تشكيل فقاعات الهواء بين هلام وغشاء النيتروسيلولوز.
  6. منع الغشاء مع 10 مل من حظر المخزن المؤقت.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في 4°C بين عشية وضحاها. الأجسام المضادة الأولية هي: المضادة للكولاجين الأول، المضادة للكولاجين الثالث، المضادة للكولاجين الرابع، المضادة αSMA، المضادة MMP-1، المضادة MMP-2، المضادة MMP-9، المضادة MMP-13، ومكافحة الجلسر الديكونيد 3-الفوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH).
  8. غسل الغشاء مع 0.1٪ TBS-Tween 20 (5x لمدة 5 دقيقة لكل منهما). TBS/Tween 20 (1 L) يحتوي على ما يلي: 50 مل من 1 M Tris (درجة الحموضة = 7.4) ، 30 مل من كلوريد الصوديوم 5 M ، 1 مل من Tween 20 ، و 920 مل من ddH2O.
  9. احتضان مع الأنواع المناسبة الأجسام المضادة الثانوية في RT لمدة 1 ساعة.
  10. كرر الخطوة 5.8 وتصور الفلورسينس باستخدام نظام التصوير.

6- RT-PCR

  1. جمع إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام المخزن المؤقت lysis مختلطة مع 2-mercaptoethanol المدرجة في طقم فحص استخراج الحمض النووي الريبي.
  2. تنقية الجيش الملكي النيبالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة17.
  3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الحجم الصغير.
  4. تنفيذ أول حبلا cDNA توليف باستخدام طقم توليف cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  5. يتم توفير أجهزة العرض الأولية RT-PCR oligonucleotide (مسبقة) في لوحات بئر مخصصة 96. مزيج 100 نانوغرام من عينات cDNA مع 10 ميكرولتر من سوبرميكس الأخضر SYBR في لوحة مخصصة.
  6. زيادة الحجم الإجمالي إلى 20 ميكرولتر/بئر باستخدام ddH2O.
  7. تشغيل RT-PCR باستخدام الدراجات الحرارية بعد تعليمات الشركة المصنعة: 40 دورات من denaturing في 98 درجة مئوية لمدة 15 s وannealing / التمديد في 60 درجة مئوية لمدة 60 s. الجينات التي تم اختبارها في RT-PCR تشمل: COL1A1، COL3A1، ACTA2، SMAD2، SMAD3، SMAD4، SMAD7، IL1A، IL1B، IL6، IL8، MMP1، MMP2، MMP3، TGFB1، وVEGF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء عينات ثلاثية في كل تجربة ، وتكررت كل تجربة 3x باستخدام خلايا من ثلاثة مرضى فرديين. يتم التعبير عن البيانات كنسب مئوية من مجموعة التحكم. تم تطبيق اختبار ANOVA وTukey في اتجاه واحد لتحليل الاختلافات الإحصائية (*p - 0.05).

MMC باستخدام Ficoll في 9٪ FVO (إشغال حجم كسور) يعزز الكمية الإجمالية من الكولاجين والكولاجين الأول ترسب في hHSF13. كما هو موضح في الشكل 1A، زادت كثافة الخلايا من hHSFs بشكل كبير بعد التبذير مع Ficoll بنسبة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين وتوثيق الندبة في جرة محسنة" في نموذج المختبر للأنسجة الندبة الجلدية البشرية. وقد ذكرت الدراسات السابقة تطبيق تقنية MMC على الخلايا الليفية الرئة البشرية12,الخلايا الجذعية نخاع العظم البشري mesenchymal23,والخلايا الليفية الجلد الإنسان23 باستخدام dextran12,فيكول12,وPVP23 كما crowders. في الدراسة التي ذكرت هنا ، تم تحسين البروتوكول المنشور سابقًا للخلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بتمويل من وكالة سنغافورة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث "SPF 2013/004: بحوث بيولوجيا الجلد الأساسية" و "ابتكار رعاية الجروح للمناطق المدارية" IAF-PP/2017 H17/01/a0/009. ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للمشورة والمساعدة المقدمة من الدكتورة بولا بيني والدكتور مايكل راغوناث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 & مرشح mSartorius16534
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
ألفا العضلات الملساء أكتين (ألفا ؛ SMA) الجسم المضاد الأساسيAbcamab5694
Applied Biosystems 7500 نظام PCR سريع في الوقت الحقيقي (cycler حراري)Thermo Fisher Scientific4351106
حمض الأسكوربيكواكو# 013-12061
ألبومين مصل البقرSigma-Aldrich#A2153
بروتين برادفوردBio-Rad500-0006
الجسم المضاد الأساسي للكولاجين الأول (للتلوين المناعي)Abcam6308
الجسم المضاد الأساسي للكولاجين الأول (للبقعة الغربية)Abcamab21286
الجسم المضاد الأساسي للكولاجين الثالثAbcamab7778
الكولاجين الرابع الجسم المضاد الأساسيAbcamab6586
Direct Red 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11996-065
مصل عجل الجنين (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare# 17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare# 17-0310-10
GAPDH الجسم المضاد الأساسيSigma-AldrichG8795
الماعز المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانويAbcamab97050
ندبة الضخامية البشرية / الخلايا الليفية الطبيعية (hHSF / hNSF)شركة أبحاث الخلايا106 ، 107 ، 108
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad# 1708890
MMP-1 الجسم المضاد الأساسيAbcamab38929
MMP-13 الجسم المضاد الأساسيAbcamab39012
MMP-2 الجسم المضاد الأساسيAbcamab37150
MMP-9 الجسم المضاد الأساسيAbcamab38898
NanoDrop مقاييس الطيف الضوئي MicrovolumeThermo Fisher ScientificN / A
غشاء النيتروسليلوزBio-Rad10484060
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris ProteinGels Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
Odyssey blocking bufferLI-COR Biosciences927 & ndash ؛ 40000
نظام تصوير Odyssey FcLI-COR BiosciencesN / A
Olympus IX-81 HCS مجهر (للتلوين المناعي) محلولأوليمبوسN / A
البنسلين / الستربتومايسين (P / S)Life Technologies15140-122
PrimePCR AssaysBio-Radبادئات مخصصة مطلية مسبقا في ألواح 96 بئرا بناء على المتطلبات
كوكتيل مثبط البروتياز (PIC)سيجما ألدريتش11697498001
PVP 360سيجما#PVP360
PVP 40سيجما#PVP40
RIPA عازلةMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN# 74134
فانادات الصوديومسيجما ألدريتش450022
الصوديوم vanadateSigma-Aldrich450243
SpectraMax M5 قارئ صفيحة دقيقة متعدد الأوضاعالأجهزة الجزيئيةN / A
SsoAdvanced عالمي SYBR الأخضر سوبرميكسBio-Rad# 172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416
فحص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904(2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165(2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746(2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

70 400

مقالات ذات صلة