يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات الببتيد التركيب الحيوي

7.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61053

⸱

مايو 4, 2020

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

Lanthipeptide synthetases يحفز ردود الفعل متعددة الخطوات خلال التمثيل الحيوي للمنتجات الطبيعية الببتيد. هنا، ونحن نصف مستمر، من أسفل إلى أعلى، الهيدروجين الديوتريوم تبادل الطيف الكتل (HDX-MS) سير العمل التي يمكن استخدامها لدراسة الديناميات التركيبية من synthetases lanthipeptide، فضلا عن الإنزيمات المماثلة الأخرى المشاركة في التمثيل الحيوي للمنتج الطبيعي الببتيد.

الملخص

قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) هو طريقة قوية لتوصيف البيوفيزيائي للتغيرات في تشكيل الإنزيم والتفاعلات بين الإنزيم والركيزة. من بين فوائده العديدة ، يستهلك HDX-MS كميات صغيرة فقط من المواد ، ويمكن إجراؤه في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع علامات الإنزيم / الركيزة ، ويمكن أن يوفر معلومات محلولة مكانيا عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم - حتى بالنسبة للإنزيمات الكبيرة ومجمعات متعددة البروتين. يتم البدء في هذه الطريقة عن طريق تخفيف إنزيم الفائدة في المخزن المؤقت المعد في D2O. وهذا يؤدي إلى تبادل البروتيوم في السندات الببتيد amides (N-H) مع الديوتريوم (N-D). في نقاط وقت التبادل المطلوبة ، يتم إخماد تفاعل aliquots ، ويتم إعادة دمج الإنزيم في الببتيدات ، ويتم فصل الببتيدات عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) ، ويتم تسجيل التغير في كتلة كل ببتيد (بسبب تبادل الهيدروجين للديوتريوم) من قبل MS. تعتمد كمية امتصاص الديوتريوم من قبل كل ببتيد بشكل كبير على بيئة الترابط الهيدروجيني المحلية لذلك الببتيد. الببتيدات الموجودة في مناطق ديناميكية جدا من الديوتريوم تبادل الانزيم بسرعة كبيرة، في حين الببتيدات المستمدة من المناطق مرتبة جيدا تخضع لتبادل ببطء أكثر من ذلك بكثير. وبهذه الطريقة، يبلغ معدل HDX عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم المحلية. يمكن بعد ذلك استخدام الاضطرابات إلى مستويات امتصاص الديوتريوم في وجود ليغاندس مختلفة لرسم خريطة لمواقع الربط ليغاند، وتحديد شبكات allosteric، وفهم دور ديناميات تشكيلية في وظيفة الانزيم. هنا، نوضح كيف استخدمنا HDX-MS لفهم التمثيل الحيوي لنوع من المنتجات الطبيعية الببتيد يسمى lanthipeptides بشكل أفضل. اللانثيبتيدات هي الببتيدات المشفرة وراثيا التي يتم تعديلها بعد الترجمة من قبل إنزيمات كبيرة متعددة الوظائف وديناميكية تشكيلية يصعب دراستها مع نهج البيولوجيا الهيكلية التقليدية. يوفر HDX-MS منصة مثالية وقابلة للتكيف للتحقيق في الخصائص الميكانيكية لهذه الأنواع من الإنزيمات.

المقدمة

البروتينات هي جزيئات ديناميكية هيكليا التي عينة تشكيلات مختلفة على نطاقات زمنية تتراوح بين اهتزاز السندات على نطاق femtosecond لإعادة ترتيب مجالات البروتين بأكملها التي يمكن أن تحدث على مدى ثوان عديدة1. هذه التقلبات تشكيلية غالبا ما تكون الجوانب الحاسمة للانزيم / وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون التغييرات التشكيلية الناجمة عن الربط الرابط ذات أهمية حاسمة لتعديل وظيفة الإنزيم ، إما عن طريق تنظيم بقايا الموقع النشطة اللازمة للحفز ، أو تحديد مواقع ربط الركيزة في آليات حركية متسلسلة ، أو حماية الوسيطات التفاعلية من البيئة ، أو عن طريق تعديل وظيفة الإنزيم عبر شبكات allosteric. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن ديناميات تشكيلية يمكن الحفاظ عليها في جميع أنحاء التطور، وأنه يمكن ربط الاضطرابات إلى الحركات الجزيئية المحفوظة مع التغيرات في خصوصية الركيزة وظهور وظائف إنزيم جديدة2،3.

في السنوات الأخيرة ، ظهر قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) بسرعة كتقنية قوية للتحقيق في كيفية استجابة المناظر الطبيعية المطابقة للبروتين للاضطرابات مثل الربط ليغاند أو موتاجينيسيس4،5،6،7. في تجربة HDX-MS النموذجية (الشكل 1)، يتم وضع بروتين مثير للاهتمام في المخزن المؤقت المعد في D2O ، مما يؤدي إلى استبدال البروتونات القابلة للتبادل مع الديوتيريا. سعر الصرف من moiety أميدي من السندات الببتيد يعتمد بقوة على درجة الحموضة، وتسلسل الأحماض الأمينية المحلية، وعلى البيئة الهيكلية المحلية من أميدي8. Amides التي تشارك في التفاعلات الترابط الهيدروجين (مثل تلك الموجودة في α helices وأوراق β) تبادل أبطأ من وسط في المناطق غير المنظمة من البروتين التي تتعرض للمذيبات السائبة. وبالتالي ، فإن مدى امتصاص الديوتريوم هو انعكاس لهيكل الإنزيم. ومن المتوقع أن الإنزيمات التي هي ديناميكية تشكيليا، أو التي تخضع لتحولات هيكلية على الربط ليغاند، أن تسفر عن استجابة HDX قابلة للقياس.

يظهر الأساس الميكانيكي لسعر الصرف البطيء للamide منظم في الشكل 2 5،8،9. من أجل الخضوع ل HDX ، يجب على المنطقة المنظمة أولا أن تقوم أولا بأخذ عينات عابرة من تشكيل تم الكشف عنه ، بحيث يمكن للجزيئات المذيبة التي تحفز تبادل HDX عبر آلية كيميائية حمضية / أساسية محددة ، الوصول إلى أميد القابلة للتبادل. في نهاية المطاف ، فإن المقادير النسبية لسعر الصرف الكيميائي(ككيم)ومعدلات الطي وإعادة طي (كمفتوحة وك إغلاق) تحديد معدل HDX تقاس في التجربة5،8. من هذا النموذج الحركي البسيط ، من الواضح أن مدى امتصاص الديوتريوم سيعكس الديناميكيات التوافقية الأساسية (كما يحددها kopen و kclose). يتم تنفيذ معظم التجارب HDX-MS في سير العمل من أسفل إلى أعلى حيث، بعد رد فعل تبادل، يتم هضم البروتين من الفائدة في الببتيدات ويتم قياس امتصاص الديوتريوم من قبل كل الببتيد كزيادة في كتلة7. وبهذه الطريقة ، يسمح HDX-MS بالاضطرابات لديناميكيات تشكيل الإنزيم ليتم تعيينها على النطاق المكاني المحلي للببتيدات ، مما يسمح للباحث بتقييم كيفية تغيير الاضطراب للديناميكيات في مناطق مختلفة من إنزيم الاهتمام.

مزايا نهج HDX-MS لتوضيح الديناميات الهيكلية البروتين عديدة. أولا ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بكميات صغيرة من البروتين الأصلي أو على مجمعات البروتين في أنظمة ذات بنية رباعية10. ليس من الضروري حتى لإعداد الانزيم المستخدمة في المقايسة أن يكون تنقية عالية11،12، طالما أن من أسفل إلى أعلى HDX - MS سير العمل يوفر عددا كافيا من الببتيدات التي تم تحديدها بثقة التي تغطي تسلسل البروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، HDX-MS يمكن أن توفر معلومات عن ديناميات تشكيلية في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع العلامات البروتين موقع محدد كما يمكن استخدامها في دراسات مضان جزيء واحد13،وليس هناك حد لحجم البروتين أو البروتين المعقدة التي يمكن التحقيق فيها (مما يجعل النهج مثل الرنين المغناطيسي النووي [NMR] الطيف تحديا)7،14. وأخيرا، يمكن استخدام طرق HDX-MS التي تم حلها زمنيا لدراسة البروتينات المضطربة في جوهرها، والتي يصعب دراستها مع التصوير البلوري بالأشعة السينية15و16و17و18. القيد الرئيسي ل HDX-MS هو أن البيانات ذات دقة هيكلية منخفضة. إن بيانات HDX-MS مفيدة للإشارة إلى الأماكن التي تتغير فيها الديناميكيات التوافقية وللكشف عن التغيرات التوافقية المقترنة ، ولكنها لا توفر في كثير من الأحيان الكثير من البصيرة في الآلية الجزيئية الدقيقة التي تقود التغيير الملحوظ. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في الجمع بين أساليب التفكك التقاط الإلكترون مع البروتين HDX-MS البيانات واعدة لرسم خرائط مواقع تبادل لبقايا الأحماض الأمينية واحد19،ولكن لا تزال هناك حاجة في كثير من الأحيان متابعة الدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية لتوفير الوضوح للنماذج الهيكلية التي أحالها HDX-MS البيانات.

أدناه، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتطوير فحص HDX-MS20. يجب أن تنطبق بروتوكولات إعداد العينة المعروضة أدناه بشكل عام على أي بروتين يظهر قابلية جيدة للذوبان في المخازن المؤقتة المائية. تتوفر طرق إعداد عينات أكثر تخصصا وسير عمل HDX-MS للبروتينات من الحاجة إلى الفحص في وجود المنظفات أو الفوسفوليبيدات21و22و23و24. يتم وصف الإعدادات الفعالة لجمع بيانات HDX-MS لمطياف كتلة رباعي القطب عالي الدقة مقرون بنظام الكروماتوغرافيا السائلة. ويمكن جمع بيانات مماثلة التعقيد والدقة على أي واحد من عدد من نظم قياس الطيف الكروماتوغرافيا الكتلية السائلة المتاحة تجاريا. كما يتم توفير الجوانب الرئيسية لمعالجة البيانات باستخدام حزمة برامج متاحة تجاريا. كما نقدم إرشادات لجمع البيانات وتحليلها تتسق مع التوصيات التي قدمها مجتمع HDX-MSالأوسع 12. يستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة الخصائص الهيكلية الديناميكية ل HalM2 ، وهو موالفة lanthipeptide التي تحفز نضوج متعدد الخطوات لمنتج الببتيد الطبيعي المضاد للميكروبات20. نحن نوضح كيف يمكن استخدام HDX-MS للكشف عن مواقع الربط الركيزة والخصائص التستوستيرون التي استعصت على التوصيف السابق. وقد نشرت العديد من البروتوكولات الأخرى على البروتين HDX-MS في السنوات الأخيرة25,26. وإلى جانب العمل الحالي، ينبغي أن توفر هذه المساهمات السابقة للقارئ بعض المرونة في التصميم التجريبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف deuterated وحلول مخزون الانزيم

  1. إعداد الكواشف اللازمة لتفاعلات HDX (بما في ذلك أي مخازن مؤقتة أو أملاح أو ركائز أو ليغاند، وما إلى ذلك) كحلول مخزون مركزة 100−200x في D2O (99.9٪ جزء الذرة D). قم بإعداد ما لا يقل عن 50 مل من حلول المخزون المؤقت.
    ملاحظة: لتوصيف HalM2، تم إعداد الحلول التالية: 500 mM MgCl2، 100 mM tris (2-carboxyethyl) فوسفين (TCEP)، 750 مللي متر ATP (في المخزن المؤقت HEPES)، 800 mM HEPES pD 7.1، 500 μM HalA2، و 500 mM AMPPNP.
  2. تجميد وlyophilize الأسهم حلول لجفاف.
  3. إعادة حل في D2O، وتكرار دورة الليتوفيلية مرة إضافية واحدة على الأقل لاستبدال أكبر عدد ممكن من البروتونات القابلة للاستبدال مع الديوترونات ممكن.
  4. ضبط PD من مخزون المخزن المؤقت HEPES deuterated إلى القيمة المطلوبة مع مركزة NaOD / DCl، مع الأخذ في الاعتبار العلاقة التالية27:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: يعتمد معدل AMIDE HDX بشدة على pL للحل (pL = pH أو pD)5. يجب إعداد مجموعات مختلفة من حلول المخزون المؤقت وتخزينها واستخدامها بطريقة متطابقة لتجنب انحراف pL طفيف بين التجارب.
  5. حساب كمية كل كاشف اللازمة ل300 ميكرولتر HDX المقايسة وتخزينها على أنها aliquots استخدام واحد في -80 درجة مئوية.
  6. قم بإعداد محلول مخزون إنزيم مركز (~100−200 ميكرومتر) في مخزن تخزين الإنزيم المحمي باستخدام فلتر طرد مركزي(جدول المواد)أو جهاز مكافئ.
    ملاحظة: سوف العازلة الدقيقة والطرد المركزي تصفية قطع الوزن الجزيئي تعتمد على البروتين / إنزيم الفائدة. يتم تخزين HalM2 في 50 MM HEPES، pH 7.5، 100 MM KCl، و 10٪ الجلسرين. استخدمت فلاتر 10 kDa لإعداد الإنزيم المركز.
  7. Aliquot الإنزيم في أجزاء استخدام واحد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون هذا نقطة توقف. يمكن إعداد جميع حلول المخزون الموضحة في القسم 1 قبل ردود فعل HDX. إذا تم تخزينها عند -80 درجة مئوية ، فإن معظم الإنزيمات / حلول المخزون deuterated ستكون مستقرة لعدة أشهر.

2. معايرة حجم إخماد HDX

  1. إعداد رد فعل HDX 300 ميكرولتر في D2O باستخدام الكواشف deuterated ومخزونات الانزيم المركزة المعدة في القسم 1.
    1. استخدم تركيز إنزيم نهائي من 1−5 ميكرومتر.
    2. استخدم تركيز احتياطي HEPES النهائي من 50−100 متر على الأقل.
    3. تأكد من تركيزات المكونات الأخرى كافية للحفاظ على نشاط الانزيم المطلوب / وظيفة.
  2. إعداد 1 لتر من محلول إخماد HDX (فوسفات 100 mM، 0.8 M guanidine-HCl، pH 1.9). تجميد وتخزينها في كل من أجزاء 50 مل (للمخزون على المدى الطويل) وأجزاء 1 مل (لاستخدام واحد aliquots).
    ملاحظة: يعتمد التركيب الدقيق لحاجز التبريد على الإنزيم المستخدم في خطوة التحلل البروتيني لسير عمل HDX-MS من أسفل إلى أعلى (الخطوة 3.3.3). المخزن المؤقت للإرواء المعطى هنا متوافق مع البيبسين ، وهو البروتيز الأكثر استخداما ل HDX-MS. إذا تم استخدام بروتياز مختلفة، تحقق مع المورد بروتياز لضمان التوافق العازلة.
  3. قم بمعايرة حجم المخزن المؤقت ل quench اللازم لضبط pL النهائي لخليط تفاعل HDX المروي إلى قيمة قراءة مقياس درجة الحموضة 2.3.
    ملاحظة: سعر الصرف H/D المذيب للببتيد amide N-H السندات هي عملية تعتمد على درجة الحموضة التي تخضع لكل من حمض وقاعدة الحفز. يحدث سعر الصرف الأدنى بقيمة 2.5 درجة الحموضة (قراءة مقياس الحموضة = 2.3 لخليط 50:50 H2O:D2O). وبالتالي، فإن قيمة pL النهائية بالقرب من 2.5 ستقلل من تبادل الهيدروجين مرة أخرى الذي يحدث أثناء تحليل LC-MS من أسفل إلى أعلى، وبالتالي الحفاظ على تسمية الديوتريوم في الببتيدات.
    1. مزيج 50 ميكرولتر من خليط رد فعل HDX من الخطوة 2.1 مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإرواء وقياس pL من الخليط المروي مع قطب microtip.
    2. زيادة حجم محلول التبريد حسب الحاجة لضبط قراءة عداد درجة الحموضة النهائية إلى قيمة 2.3.
    3. بمجرد تحديد حجم التبريد المناسب، كرر عملية التبريد عدة مرات باستخدام 50 ميكرولتر من تفاعل HDX (الخطوة 2.1) لضمان تحقيق pL نهائي ثابت عند إضافة كمية ثابتة من المخزن المؤقت للرواية.

3. إعداد عينات مرجعية وتحسين سير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى

  1. إعداد عينات مرجعية غير مقلية للبروتين من الفائدة في ثلاثية في أنابيب 0.5 مل. تأكد من أن ظروف خليط التفاعل النهائي مطابقة لتلك المستخدمة في ردود فعل HDX الأصلية (الخطوة 2.1) ، باستثناء أن ردود الفعل يتم إعدادها في H2O باستخدام حلول مخزون الكاشف المعدة أيضا في H2O.
  2. إخماد العينات كما في الخطوة 2.3 بإضافة الحجم المناسب من المخزن المؤقت quench لضبط درجة الحموضة النهائي إلى 2.5. فلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل.
  3. تحليل عينات مرجع الإنزيم protiated باستخدام سير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى.
    ملاحظة: قبل تنفيذ هذه الخطوات، يجب معايرة نظام LC-MS الذي سيتم استخدامه للحصول على البيانات بشكل صحيح وجاهز للاستخدام. توقيت ودرجة حرارة جميع الخطوات في سير العمل LC-MS من أسفل إلى أعلى يجب أن تكون مراقبة صارمة من أجل تقليل الاختلافات في تبادل الظهر بين العينات. باستخدام أجهزة التصلب المتعدد المستخدمة في هذا البروتوكول (جدول المواد و معلومات داعمة) ، يمكن التحكم في معظم الخطوات من خلال برنامج الأدوات. لضمان تجميع النسخ المتماثلة الدقيقة، يوصى بأتمتة أكبر عدد ممكن من الخطوات في سير العمل.
    1. إزالة عينة مرجعية إنزيم الفردية (أعدت كما هو الحال في الخطوة 3.2) من الثلاجة وتذوب في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في حمام مائي.
    2. في الدقيقة 2 بالضبط بعد إزالة العينة من الثلاجة والذوبان، وحقن جزء 40 ميكرولتر من العينة المرجعية المروية في عمود كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UPLC) (2.1 × 30 ملم، 300 Å، 5 ميكرومتر) تحتوي على مرحلة ثابتة تعمل مع بيبسين (بروتياز حمض مستقر).
    3. هضم العينة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر /دقيقة لمدة 3 دقائق عند 15 درجة مئوية باستخدام حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في H2O (درجة الحموضة = 2.5) كمذيب.
    4. جمع الببتيدات الببتيدية لأنها elute من العمود pepsin على عمود فخ C18 عقد في 0.4 درجة مئوية للحد من تبادل الظهر.
    5. مرر الببتيدات الببتيدية المجففة من عمود الفخ إلى عمود تحليلي C18 (1 مم × 100 مم ، 1.7 ميكرومتر ، 130 Å) تم الاحتفاظ به وتشغيله عند 0.4 درجة مئوية لفصل الببتيدات الببتيدية.
      ملاحظة: يمكن أتمتة الخطوات 3.3.3-3.3.5 بواسطة بعض أنظمة LC-MS المستخدمة للحصول على بيانات HDX-MS. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ هذه الخطوات بشكل مستقل، مع الأخذ في الاعتبار أن توقيت ودرجة حرارة كل خطوة تحتاج إلى التحكم بعناية لتحقيق تبادل الظهر منخفضة باستمرار.
    6. Elute العمود C18 مع acetonitrile / الماء / 0.1 ٪ نظام المذيبات حمض الفورميك. تحسين التدرج LC للبروتين من الفائدة من أجل تحقيق أقصى قدر من الفصل والحفاظ على تسمية الديوتريوم في الببتيدات الببتيدية.
      ملاحظة: يتم توفير تفاصيل التدرج elution في المعلومات الداعمة.
    7. تخضع الهضم الهضمي لتأين الكهروسبراي (ESI) قياس الطيف الكتلي.
      ملاحظة: توفر شروط المصدر المتوفرة في المعلومات الداعمة تأينا كافيا لمعظم الببتيدات الببتيدية.
      1. بمجرد تأينها في أداة التصلب المتعدد، قم بفصل حركة أيونات مرحلة الغاز باستخدام النيتروجين كغاز عازل لتعزيز قدرة الذروة للطريقة.
      2. بعد فصل حركة الأيونات، أخضع أيونات سلائف الببتيد الببتيدية لسير عمل MSE يتضمن دورات متناوبة من طاقة الاصطدام المنخفضة (4 فولت) وطاقة الاصطدام العالية (21−40 فولت).
        ملاحظة: تسمح أنظمة طاقة التصادم المنخفضة والعالية المتناوبة بجمع بيانات MS (طاقة تصادم منخفضة) في وقت واحد مع بيانات MSMS (طاقة تصادم عالية). وهذا بدوره يسمح بالارتباط الزمني بين أيونات السلائف والأيونات المجزأة لكل منها. هذا الارتباط ضروري لتحديد الببتيد الواثق الموصوف في القسم 4.
      3. الكشف عن السلائف الببتيد والأيونات جزء باستخدام محلل الشامل مع قوة حل ما لا يقل عن 20،000.
      4. بالتزامن مع الحصول على البيانات، احصل على بيانات MS لمعيار خارجي [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
        ملاحظة: سير العمل MS الموضحة في الخطوة 3.3.7 يشار إلى بروتوكولMS E. يتم توفير الإعدادات الفعالة الكاملة لبروتوكول MSE المناسب ل HDX-MS من أسفل إلى أعلى في المعلومات الداعمة.
    8. تقييم جودة بيانات LC-MS.
      ملاحظة: باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه والإعدادات الفعالة المتوفرة في المعلومات الداعمة، يجب أن تنتج العينات المرجعية رسما لونيا أيونا إجماليا بحد أقصى لشدة الإشارة تبلغ حوالي 1 × 108. يجب أن يكون هناك العديد من الببتيدات الببتيدية التي تتراوح بين 3-9 دقائق(الشكل 3A−C).
    9. حقن 40 ميكرولتر من عينات فارغة (0.1٪ حمض الفورميك في الماء) لتنظيف أعمدة بيبسين والتحليل C18.
      ملاحظة: بشكل عام، يجب أن تكون الفراغات 2-3 كافية.
    10. كرر الخطوات 3.3.1−3.3.9 لكل عينة من عينات البروتين المرجعية الثلاثية.

4. معالجة البيانات المرجعية وتحديد قائمة الببتيد

  1. تحليل البيانات الخامMS E (الخطوة 3.3.7) باستخدام برنامج بروتيوميكس(جدول المواد). باستخدام برنامج بروتيوميكس، انتقل إلى المكتبات | بروتين تسلسل Databanks لتحديد قاعدة بيانات البروتين عن طريق استيراد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من الفائدة.
    ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو البحث في بيانات MS المرجعية عن الببتيدات الببتيدية المشتقة من البروتين المهم، واستخدام بيانات MSMS (التي تم الحصول عليها في وقت واحد مع بيانات MS) للتحقق من صحة أي تحديدات الببتيد المفترضة.
  2. إعطاء اسم لتسلسل البروتين من الفائدة. استيراد تسلسل البروتين (في شكل FASTA). سيقوم البرنامج بإجراء عملية هضم في سيليكو لبروتين قاعدة البيانات لتوليد قائمة بالببتيدات التي سيتم استخدامها للبحث في بيانات LC-MS.
  3. تعريف معلمات المعالجة (الموجودة ضمن القائمة مكتبة). حدد Electrospray MSE كنوع الحصول على البيانات. في حقل Lock Mass for Charge 2، أدخل 785.8426 ل m/z ل 2+ أيون [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) وانقر فوق إنهاء.
  4. حدد معلمات سير العمل (الموجودة ضمن قائمة المكتبة).
    1. حدد الرذاذ الكهربائي MSE لنوع البحث. ضمن | سير العمل عنوان استعلام البحث في قاعدة البيانات، حدد بروتين قاعدة البيانات الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.2 في حقل Databank.
    2. تغيير المضموم الأساسي إلى غير محدد، ومسح حقل كاشف المعدل الثابت عن طريق الضغط على زر Ctrl أثناء النقر على Carbamidomethyl C.
  5. حدد دليل الإخراج بالانتقال إلى الخيارات | | إعداد التشغيل التلقائي الهوية E. حدد المربعات الخاصة ب Apex 3D و الببتيد 3D الإخراج و الإخراج المحاسبي أيون وحدد الدليل المطلوب.
  6. معالجة بيانات عينة المرجع.
    1. على شريط الأدوات الأيسر من مساحة العمل منصة بروتيوميكس، إنشاء لوحة جديدة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على لوحة Microtiter. تسليط الضوء على ثلاثة آبار في لوحة microtiter (واحد لكل عينة مرجعية تم جمعها في القسم 3). انقر على اليسار في بئر واحد، اضغط واسحب إلى ثلاثة آبار.
    2. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد إضافة بيانات أولية. في الإطار الذي يظهر، انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على الملفات المرجعية الثلاثة من القسم 3 وحددها في نفس الوقت.
    3. انقر على التالي واختر معلمات المعالجة المحددة في الخطوة 4.3. انقر على التالي وحدد معلمات سير العمل المحددة في الخطوة 4.4. ثم انقر على النهاية.
  7. بمجرد تعيين البيانات الخام ومعلمات المعالجة ومعلمات سير العمل لكل بئر على اللوحة ، ستظهر الآبار باللون الأزرق. حدد الآبار، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عملية أحدث البيانات الأولية. انقر على الزاوية السفلية اليمنى من النافذة لتتبع معالجة البيانات. بمجرد ظهور الرسالة لا توجد مهمة لتشغيلها، تتم المعالجة بشكل كامل.
  8. بعد اكتمال معالجة البيانات ، ستتحول الآبار في اللوحة إلى اللون الأخضر. انقر بزر الماوس الأيمن على الآبار وحدد عرض نتائج سير العمل. سيتم فتح إطار منفصل لكل ملف بيانات مرجع.
  9. فحص البيانات للتأكد من أن غالبية إشارات التصلب المتعدد في بيانات العينة المرجعية تم تعيينها بنجاح إلى الببتيدات المتوقعة من عملية الهضم داخل السيليكو للبروتين المثير للاهتمام. سيتم تلوين الببتيدات المتطابقة باللون الأزرق في طيف الإخراج (الشكل 4). انقر نقرا مزدوجا فوق عامل التصفية موافق وتحقق من أن تغطية النسبة المئوية أكبر من 99٪.
    ملاحظة: عند المعالجة، سيتم حفظ إخراج البيانات تلقائيا مع ملحق الملف(raw_data_file_name_IA_final_peptide) في الدليل المحدد في الخطوة 4.5.
  10. استيراد إنتاج البرمجيات بروتيوميكس في برنامج HDX المعالجة(جدول المواد)للحصول على عتبات إضافية.
    1. انقر على البيانات في الزاوية اليسرى من نافذة برنامج معالجة HDX. انقر على نتائج PLGS الاستيراد وانقر على أيقونة إضافة. اختر ملفات البيانات المعالجة من الخطوة 4.9 بواسطة التنقل إلى الدليل المناسب.
    2. انقر على التالي وحدد المعلمات التالية: الحد الأدنى من الأيونات المتتالية ≥ 2، خطأ جماعي = 5 ppm، و عتبة الملف = 3. انقر على النهاية.
  11. مرة واحدة راض عن المعلمات عتبة، حفظ مشروع HDX. سيتم استيراد جميع بيانات HDX إلى هذا المشروع لتحليلها وعرضها.
    ملاحظة: يجب معالجة عينات تبادل الديوتريوم الموضحة في المقطع التالي مع سير عمل LC-MS متطابقة. ولذلك، قبل الشروع في اختبارات HDX (القسم 5)، تأكد من أن إعداد العينة (القسم 2)، وسير عمل LC-MS من أسفل إلى أعلى (القسم 3) وسير عمل معالجة البيانات (القسم 4) توفر قابلية النسخ المطلوبة وتغطية التسلسل للبروتين المستهدف. إذا كان هناك حاجة إلى تغيير أي من هذه العمليات لتحسين التغطية، ينصح بالعودة إلى الخطوة 2.1، وإعداد عينات مرجعية جديدة في ثلاثية الخطوط، وتكرار الأقسام 2-4 (مع إجراء التعديلات اللازمة على البروتوكول) لضمان إمكانية توليد كل ببتيد واكتشافه بشكل مستنسخ.

5. إجراء ردود فعل HDX

  1. قم بإعداد مساحة العمل لتفاعلات HDX.
    1. قبل aliquot إخماد العازلة في أنابيب 0.5 مل المسمى بشكل صحيح. إعداد أنبوب مختلف لكل نقطة زمنية، كل تكرار، وكل حالة البيوكيميائية ليتم تحليلها. استخدم الحجم المناسب من المخزن المؤقت ل quench من الخطوة 2.2 المطلوبة لضبط القراءة النهائية لمقياس درجة الحموضة لجزء 50 ميكرولتر من رد فعل HDX إلى قيمة 2.3.
    2. طرد مركزي لفترة وجيزة أحواض 0.5 مل لنقل كل من العازلة إرواء إلى الجزء السفلي من الأنبوب. ضع الأنابيب على الجليد.
    3. ملء ديوار صغيرة مع النيتروجين السائل والحفاظ على المتاخمة لمساحة العمل.
  2. إعداد ردود فعل HDX. تأكد من وجود حجم رد فعل كاف لجمع العدد المطلوب من نقاط وقت الصرف (واحد 50 ميكرولتر aliquot لكل نقطة زمنية مرغوب فيها). جمع ما لا يقل عن 4-5 نقاط زمنية أكثر من 3−4 أوامر من حجم في مقياس الوقت (على سبيل المثال، أوقات إخماد من 15 s، 60 s، 300 s [5 دقيقة]، 1800 s [30 دقيقة]، و 14400 s [4 h] توفير تغطية كافية لديناميات الصرف لمعظم الإنزيمات).
    1. قبل خلط جميع المكونات deuterated (ناقص انزيم) من الخطوة 1.1 في D2O.
    2. لكل حالة بيوكيميائية ليتم فحصها (إنزيم حر ، إنزيم + ليغند ، إنزيم + مثبط ، وما إلى ذلك) ، قم بإعداد تفاعلات HDX في ثلاث نسخ على الأقل.
    3. احتضان خليط التفاعل في حمام مائي يتم التحكم فيه بدرجة حرارة عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل إضافة الإنزيم.
      ملاحظة: يجب إعداد الإنزيم كمحلول مخزون مركز (~100−200 ميكرومتر، الخطوة 1.6) لتقليل إضافة البروتيوم إلى المقايسة HDX.
    4. عند إضافة الإنزيم إلى تركيز نهائي من 1−5 ميكرومتر، ابدأ المؤقت. امزج المحلول بعناية وبسرعة باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر لضمان توزيع الإنزيم بالتساوي في العينة.
    5. في نقاط وقت التبادل المطلوبة، قم بإزالة 50 ميكرولتر من تفاعل HDX واخلط بسرعة وبالتساوي مع المخزن المؤقت لإرواء الجليد البارد قبل المزج في أنبوب 0.5 مل.
      ملاحظة: يجب أن تكون أحجام الخلط وإجراءات الخلط دقيقة وقابلة للاستنساخ قدر الإمكان لضمان تحقيق pL quench النهائي المطلوب من 2.3 بسرعة في جميع العينات. الحفاظ على التبريد الجليد العازلة إخماد سوف تساعد على تقليل تبادل الظهر على التشبع من الانزيم.
    6. مباشرة بعد إخماد عينة HDX، سقف الأنبوب وتجميد فلاش في النيتروجين السائل.
    7. استمر في جمع النقاط الزمنية حتى تكتمل جميع عمليات الفحص، ثم قم بنقل العينات إلى ثلاجة -80 درجة مئوية للتخزين.
      ملاحظة: يمكن أن يكون هذا نقطة توقف. بعد جمع جميع النقاط الزمنية HDX، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة لتحليل LC-MS. من الناحية المثالية ، يجب إجراء ردود فعل HDX ثلاثية الليكات لجميع الحالات الكيميائية الحيوية ذات الأهمية في نفس اليوم. كحد أدنى ، يجب تشغيل جميع ردود فعل HDX المتماثلة لحالة كيميائية حيوية معينة بالتوازي في نفس اليوم.
  3. بعد جمع كافة النقاط الزمنية HDX مروي، تخضع العينات إلى سير العمل LC-MS محسنة من أسفل إلى أعلى المتقدمة كما هو موضح في الخطوة 3.3. حقن عينات HDX في ترتيب عشوائي مع عدد مناسب من الفراغات بين العينات لضمان أن أي الببتيد ترحيل الحد الأدنى.
    ملاحظة: لا تحتاج إلى تجميع بيانات HDX في وضع MSE. وبالتالي، ينبغي إزالة قطاع طاقة الاصطدام العالي (الخطوة 3-3-7-2) من دورة واجب التصلب المتعدد. يجب أن يكون هذا التغيير الوحيد الذي تم إجراؤه على سير العمل الموضح في الخطوة 3.3.
  4. تقييم جودة بيانات HDX أثناء جمعها.
    1. تأكد من ظهور القمم الكروماتوغرافية الموجودة في الشكل اللوني الأيوني الإجمالي للعينات المرجعية غير المذابة في نفس وقت الاحتفاظ في العينات المذابة (كما هو الحال في الشكل 3D−F).
    2. تأكد من أن الأطياف الكتلية التي تم تلخيصها على فترات زمنية محددة من العينات المرجعية والعينات التي تم خلعها تظهر أدلة على الديوتر (أي التحول في المغلف النظيري للببتيدات الفردية إلى قيم أعلى m/z في العينات المذابة [الشكل 6]).

6. معالجة بيانات HDX

  1. قم باستيراد بيانات HDX إلى مشروع HDX الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.11 بالنقر على البيانات | MS Files في شريط الأدوات العلوي.
    1. انقر على حالة جديدة والتعرض الجديد حسب الحاجة لتحديد الدول الكيميائية الحيوية (على سبيل المثال، إنزيم الحرة، إنزيم + ليغاند، الخ) وأوقات التعرض الديوتريوم، على التوالي، التي هي ذات الصلة للتحليل.
    2. انقر على جديد الخام لتحديد ملفات البيانات HDX ليتم تحليلها. تعيين أوقات التبادل المناسبة وحالة البيوكيميائية لكل ملف بيانات خام يتم استيراده.
      ملاحظة: يمكن استيراد البيانات ومعالجتها على دفعات، أو دفعة واحدة. لن تؤدي إضافة بيانات إلى المشروع إلى التراجع عن أي تحليل تم تنفيذه مسبقا ضمن هذا المشروع.
  2. بمجرد إضافة ملفات البيانات، انقر فوق إنهاء لبدء معالجة البيانات. بعد تأخير قصير، سيسأل البرنامج عما إذا كان المستخدم يريد حفظ البيانات قبل المتابعة. انقر فوق نعم.
    ملاحظة: قد تستغرق المعالجة الأولية عدة ساعات اعتمادا على عدد العينات التي يتم تحليلها وعدد الببتيدات الموجودة في قائمة الببتيد النهائية (الخطوة 4.10) وحجم النافذة الكروماتوغرافية وتواتر الاستحواذ الطيفي.
  3. إذا رغبت في ذلك، قم بتغيير معلمات المعالجة في قائمة التكوين لتغيير معلمات البحث الأيونية. تأكد من استخدام معلمات البحث الأيونية نفسها لكافة البيانات في مشروع معين.

7. تحليل وتصور بيانات HDX

ملاحظة: بمجرد الانتهاء من المعالجة الأولية للبيانات الأولية (الخطوة 6.2) ، سيكون برنامج معالجة HDX قد حدد موقع الببتيدات من قائمة الببتيد (التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.10) في كل ملف من ملفات البيانات الأولية التي تم تحليلها. بمجرد أن يتم تحديد موقع توزيع النظائر للببتيد في القائمة في ملف بيانات خام ، يمثل برنامج معالجة HDX كل نظير ب "عصا" (كما هو الحال في الشكل 6C−E). ثم يتم استخدام الكثافة النسبية من العصي للببتيد معين لحساب امتصاص الديوتريوم بالنسبة إلى الأطياف المرجعية. في حين أن برنامج معالجة HDX يقوم بعمل مثير للإعجاب من تعيين "العصي" بشكل صحيح لمعظم الببتيدات ، فإن المعالجة اليدوية الهامة لقيم امتصاص الديوتريوم ستظل مطلوبة.

  1. تحليل قيم امتصاص الديوتريوم الببتيد
    1. حدد الببتيد الأول في قائمة الببتيد وافتح المؤامرة الطيفية المكدسة من قائمة Views. انتقل صعودا وهبوطا في إطار مؤامرة الأطياف مكدسة لرؤية أطياف الكتلة للببتيد المحدد كدالة لوقت تبادل الديوتريوم(الشكل 7D, E).
    2. تعيين العصي وفكها حسب الضرورة باستخدام نقرات الماوس لضمان وجود توزيع النظائر المناسب في البيانات وتعيين كل قمم النظائر (ستظهر العصي المخصصة باللون الأزرق). النقر على أي من الأطياف في مؤامرة الطيفية مكدسة (الشكل 7D، E) سوف تسمح للمستخدم لتعيين / unassign العصي في إطار عارض البيانات النشطة ( الشكل7C).
    3. تحقق من تعيينات العصا لكل حالة شحنة عن طريق قلب حالة الشحن في الجزء العلوي من نافذة الرسم الطيفي المكدسة.
    4. كرر الخطوات 7.1.1−7.1.3 لكل حالة حيوية كيميائية ذات أهمية. يمكن أيضا تبديل الحالة الكيميائية الحيوية في الجزء العلوي من نافذة المؤامرة الطيفية المكدسة. للحصول على قياسات الفرق امتصاص الديوتريوم الأكثر دقة، تأكد من أن يتم تعيين العصي لنفس المجموعة من الدول تهمة لكل دولة البيوكيميائية.
    5. كرر الخطوات 7.1.1−7.1.4 لكل ببتيد في قائمة الببتيد.
    6. تحقق من الانحراف المعياري لقيم امتصاص الديوتريوم الببتيد باستخدام خريطة التغطية.
      1. الوصول إلى خريطة التغطية من القائمة وجهات النظر، والذي يعرض كل الببتيد في قائمة الببتيد المعينة على طول تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من الفائدة (الشكل 8C). لون الببتيدات وفقا للانحراف المعياري النسبي (وحدات دا).
      2. البحث بصريا الخريطة عن الببتيدات المتطرفة مع الانحراف المعياري النسبي عالية. انقر على الببتيدات المتطرفة في خريطة التغطية لملء المؤامرات الطيفية المكدسة(الشكل 8B)ونافذة عارض البيانات (الشكل 8A) مع الببتيد المستهدف.
      3. باستخدام مؤامرة الطيفية مكدسة، تحقق بعناية من أن جميع الدول تهمة وجميع النقاط الزمنية للببتيد المتطرفة قد خصصت بشكل مناسب العصي.
        ملاحظة: في معظم الأحيان، الببتيدات مع الانحرافات المعيارية الكبيرة (>0.3 دا) لديها قمم النظائر التي لم يتم تعيينها بشكل مناسب العصي من قبل البرنامج (كما هو مبين في الشكل 8B). تعيين أي عصي مفقودة سيمكن بشكل عام من تقليل الانحراف المعياري النسبي للببتيد إلى < 0.3 Da.
      4. إخفاء الببتيد من القائمة إذا كان لا يمكن تخفيض الانحراف المعياري النسبي إلى أقل من 0.3 دا.
  2. تصدير بيانات الفرق HDX بين اثنين من الدول الكيميائية الحيوية لرسم الخرائط على نموذج هيكلي للبروتين من الفائدة.
    1. عرض اختلاف الاهتمام في خريطة التغطية. انقر بزر الماوس الأيمن على خريطة التغطية لتصدير بيانات الفرق إلى ملف .csv. تصدير بيانات الحالة (بتنسيق .csv) عن طريق التنقل إلى البيانات | تصدير بيانات الحالة في شريط الأدوات الرئيسي.
      ملاحظة: يتم توفير التنسيق المناسب من البيانات الفرق وملفات بيانات الحالة في معلومات الدعم.
    2. استيراد بيانات الفرق، وبيانات الدولة، وملف pdb من البروتين من الفائدة في Deuteros28. اختر الفاصل الزمني للثقة بنسبة 99٪، وحدد تمكين المجموع،وعالج البيانات.
      ملاحظة: يجب تثبيت MATLAB على جهاز الكمبيوتر لتشغيل Deuteros. سيستخدم Deuteros القياسات المتماثلة في مجموعة البيانات لحساب الانحراف المعياري لبيانات الامتصاص لكل ببتيد. سيتم استخدام هذا الانحراف المعياري لتحديد فاصل الثقة للتبادل الهام، والذي سيتم عرضه على المؤامرات.
    3. ضمن خيارات PyMOL، حدد امتصاص التصدير | تصدير لتوليد سيناريو بيمول لرسم خريطة المناطق من فرق كبير في الصرف على هيكل pdb من البروتين من الفائدة باستخدام برنامج PyMOL.
      ملاحظة: باستخدام سير العمل الموضح في هذا البروتوكول، يكون الفاصل الزمني للثقة بنسبة 99٪ لفارق امتصاص الديوتريوم الكبير للببتيد المعطى عند نقطة زمنية واحدة عادة 0.3−0.5 Da. عادة ما تكون فترة الثقة 99٪ للفرق الذي تم جمعه على جميع نقاط وقت الصرف هي 0.7−1.0 Da.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من الضروري تقييم نوعية الهضم البروتيوليكي وقابلية تكرار سير العمل لكل مجموعة من حقن العينة. وبالتالي ، قبل إجراء فحوصات HDX-MS ، من الضروري وضع ظروف فعالة للتحلل البروتيني للبروتين المهم ، لفصل الببتيدات باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة للمرحلة العكسية وحركة أيونات مرحلة الغاز ، والكشف عن الببتيدات باستخدام التصلب المتعدد. ولهذا الغرض، ينبغي أولا دراسة العينات المرجعية للبروتين ذي الأهمية (التي تجمع في حالة عدم وجود الديوتريوم) (الفرع 3). تظهر البيانات الكروماتوغرافية في الشكل 3A−C

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر سير عمل HDX-MS المعروض في هذا البروتوكول منصة قوية بشكل ملحوظ لرسم خرائط التوزيع المكاني للعناصر الديناميكية هيكليا في البروتينات والتحقيق في كيفية تغير هذه الديناميكيات استجابة للاضطرابات (الربط الرابط ، وتولد الانزيم ، وما إلى ذلك). يحمل HDX-MS العديد من المزايا المتميزة على نهج البيولوجيا الهيكلية الأخرى التي تستخدم عادة للتحقيق في الديناميكيات التركيبية. وعلى الأخص، هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من البروتين. باستخدام سير العمل الموصوف هنا ، توفر عينة 1 مل من بروتين 1 ميكرومتر ما يكفي من المواد لتفاعلات HDX ثلاثي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشفه

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا، ومؤسسة كيبيك للطبيعة والتكنولوجيات، والمؤسسة الكندية للابتكار، وصناديق بدء جامعة ماكغيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كواشف < / قوي >
[glu-1] -fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasicNA
0.5 مل Amicon Ultracel 10k جهاز ترشيح الطرد المركزي (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
أسيتونيتريلفيشرA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
حمض الفورميكثيرمو فيشر28905
جوانيدين-حمض الهيدروكلوريكVWR97063-764
هيبسفيشرBP310-1
كلوريد المغنيسيومSiGMA-Aldrich63068-250G
كلوريدالبوتاسيومBioBasicPB0440
فوسفات البوتاسيومBioBasicPB0445
TCEP هيدروكلوريدTRC كنداT012500تم تصنيع الببتيد عند الطلب
<قوي>اسم المادة / المعدات< / قوي ><قوي>شركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / strong > تعليقات / وصف < قوي>
software
DeuterosAndy M C Lau, et alversion 1.08
DynamXWatersالإصدار 3.0
MassLynxWatersالإصدار 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersالإصدار 3.0.3
PyMOLSchrö إصدار dinger 2.2.2
اسم المواد / المعداتالشركة Catalog NumberComments / Description
Instrument and Equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 العمود التحليليWaters186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-columnWaters186003978
ACQUITY UPLC M-CLASS HDX SystemWaters
HDX ManagerWaters
microtip الأس الهيدروجيني الكهربائيThermo Fisher13-620-291
Waters Enzymate BEH العمود أو Pepsin solumnWaters186007233
Waters Synapt G2-Siووتر

المراجع

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات الببتيد التركيب الحيوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.