يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأمثل لتسلسل وتحليل العينات FFPE-RNA المتدهورة

11.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61060

⸱

يونيو 8, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1NCI CCR Sequencing Facility, Frederick National Laboratory for Cancer Research, 2Advanced Biomedical and Computational Sciences, Frederick National Laboratory for Cancer Research

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الطريقة الخطوات لتحسين جودة وكمية بيانات التسلسل التي يمكن الحصول عليها من عينات الحمض النووي الريبي (FFPE) المدمجة (FFPE) ذات البارافين. نحن نصف المنهجية لتقييم جودة عينات FFPE-RNA بدقة أكبر ، وإعداد مكتبات التسلسل ، وتحليل البيانات من عينات FFPE-RNA.

الملخص

يتيح تحليل التعبير الجيني من قبل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) رؤى فريدة في العينات السريرية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم ميكانيكي لأساس الأمراض المختلفة وكذلك آليات المقاومة و / أو قابلية التأثر. ومع ذلك ، فإن أنسجة FFPE ، التي تمثل الطريقة الأكثر شيوعًا للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة في العينات السريرية ، ليست أفضل المصادر لتحليل تنميط التعبير الجيني. غالبًا ما يكون الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من هذه العينات متدهورًا ومجزأً ومعدلًا كيميائيًا ، مما يؤدي إلى مكتبات تسلسل دون المستوى الأمثل. وفي المقابل، تولد هذه البيانات بيانات تسلسل رديئة الجودة قد لا تكون موثوقة لتحليل التعبير الجيني واكتشاف الطفرات. من أجل الاستفادة القصوى من عينات FFPE والحصول على أفضل البيانات الممكنة من عينات ذات جودة منخفضة ، من المهم اتخاذ بعض الاحتياطات أثناء التخطيط للتصميم التجريبي ، وإعداد مكتبات التسلسل ، وأثناء تحليل البيانات. وهذا يشمل استخدام المقاييس المناسبة لمراقبة جودة العينة الدقيقة (QC)، وتحديد أفضل الطرق لمختلف الخطوات أثناء إنشاء مكتبة التسلسل، ومراقبة الجودة مكتبة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطبيق أدوات برمجية ومعلمات صحيحة لتحليل بيانات التسلسل أمرًا بالغ الأهمية من أجل تحديد القطع الأثرية في بيانات RNA-seq ، وتصفية التلوث والقراءات منخفضة الجودة ، وتقييم توحيد التغطية الجينية ، وقياس قابلية استنساخ ملامح التعبير الجيني بين النسخ البيولوجية. يمكن أن تضمن هذه الخطوات دقة عالية وقابلية استنساخ لتنميط عينات الحمض النووي الريبي غير متجانسة للغاية. هنا نحن وصف الخطوات المختلفة لعينة مراقبة الجودة، وإعداد المكتبة ومراقبة الجودة، والتسلسل، وتحليل البيانات التي يمكن أن تساعد على زيادة كمية البيانات المفيدة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي منخفضة الجودة، مثل تلك التي تم الحصول عليها من أنسجة FFPE-RNA.

المقدمة

وقد مكننا استخدام الجيل التالي من نهج التسلسل من جمع ثروة من المعلومات من أنواع مختلفة من العينات. غير أن العينات القديمة والمحفوظة بشكل سيئ لا تزال غير قابلة للتطبيق بالنسبة للأساليب الشائعة الاستخدام لتوليد بيانات التسلسل وكثيرا ً ما تتطلب تعديلات على البروتوكولات الراسخة. الأنسجة FFPE تمثل مثل هذا النوع عينة التي تم استخدامها على نطاق واسع للعينات السريرية1،,2،,3. في حين يحافظ الحفاظ على الأنسجة في الحفاظ على الأنسجة، فإن الأحماض النووية في أنسجة FFPE عادة ما تظهر مجموعة واسعة من الضرر والتدهور، مما يجعل من الصعب استرداد المعلومات الجينومية التي قد تؤدي إلى رؤى مهمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاضطرابات المختلفة.

غالبًا ما تكون بيانات التعبير الجيني الناتجة عن تسلسل الحمض النووي الريبي مفيدة في دراسة آليات المرض والمقاومة وتكمل تحليل طفرة الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي أكثر عرضة للتدهور ، مما يجعل من الصعب توليد بيانات دقيقة للتعبير الجيني من أنسجة FFPE. وعلاوة على ذلك، ونظراً لأن توافر التسلسل والقدرة على تحمل تكلفته على نطاق واسع حديثان نسبياً، فإن العينات القديمة كثيراً ما لا تخزن في ظروف لازمة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بعض القضايا لعينات FFPE تشمل تدهور الحمض النووي الريبي بسبب التضمين في البارافين، والتعديل الكيميائي من الحمض النووي الريبي مما يؤدي إلى تجزئة أو الانكسار إلى العمليات الأنزيمية المطلوبة لتسلسل، وفقدان ذيول بولي ألف، والحد من انطباق oligo-dT كدليل لtranscriptase العكسي4. وثمة تحد آخر هو مناولة/ تخزين عينات FFPE في ظل ظروف دون المستوى الأمثل، مما قد يؤدي إلى مزيد من التدهور من جزيئات اللابيل مثل الحمض النووي الريبي في الأنسجة5. وينطبق ذلك بصفة خاصة على العينات القديمة التي ربما تكون قد جُمعت في وقت لم يكن من المتوقع إجراء تحليل للبيانات الجينية من جانب تسلسل الحمض النووي الريبي للعينات. كل هذه تؤدي إلى انخفاض نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج ة المتاحة لتوليد بيانات تسلسل مفيدة. وقد ثنى انخفاض احتمال النجاح، إلى جانب ارتفاع تكلفة التسلسل، العديد من الباحثين عن محاولة توليد وتحليل بيانات التعبير الجيني من عينات FFPE مفيدة محتملة. وقد أظهرت بعض الدراسات في السنوات الأخيرة قابلية استخدام أنسجة FFPE لتحليل التعبير الجيني22،6،,7،,8،,9،وإن كان لعدد أقل و / أو عينات أكثر حداثة.

كدراسة جدوى، استخدمنا الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات أنسجة ورم FFPE من ثلاثة مستودعات الأنسجة المتبقية من المراقبة، وعلم الأوبئة، ونتائج النهاية (SEER) سجلات السرطان لتسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني10. تم تخزين أنسجة FFPE من الأورام الغدية السُحّمة عالية الجودة من الأورام الرضّية السُمية الرضّحة من 7-32 سنة في ظروف مختلفة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. لأنه في معظم الحالات تم تخزين هذه الكتل في مواقع مختلفة لسنوات دون توقع أي تحليل وراثي حساس في المستقبل ، لم يتم توخي الكثير من الحذر للحفاظ على الأحماض النووية. وهكذا، أظهرت معظم العينات الحمض النووي الريبي سيئة الجودة، مع نسبة كبيرة من العينات الملوثة بالبكتيريا. ومع ذلك، تمكنا من إجراء قياس كمي للجينات، وقياس اتساق واستمرارية التغطية الجينية، وإجراء تحليل ارتباط بيرسون بين النسخ البيولوجية لقياس قابلية التكاثر. استنادا إلى مجموعة من لوحة الجينات التوقيع الرئيسي، قارنا العينات في دراستنا مع بيانات أطلس الجينوم السرطان (TCGA) وأكد أن ما يقرب من 60٪ من العينات لديها ملامح التعبير الجيني مماثلة11. استناداً إلى العلاقة بين مختلف نتائج مراقبة الجودة وبيانات التعريف عينة، حددنا مقاييس مراقبة الجودة الرئيسية التي لها قيمة تنبؤية جيدة لتحديد العينات التي من المرجح أن تولد بيانات تسلسل قابلة للاستخدام11.

هنا نحن وصف المنهجية المستخدمة لتقييم جودة FFPE-RNA، وتوليد المكتبات تسلسل بدءا من عينات الحمض النووي الريبي المستخرج، وتحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات التسلسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي

  1. حدد عينات FFPE وفقًا لمعايير محددة مسبقًا واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة مناسبة (على سبيل المثال ، مجموعة استخراج الحمض النووي FFPE ، جدول المواد).
    ملاحظة: هناك العديد من الطرق المختلفة المتاحة لاستخراج FFPE-RNA، بما في ذلك أحدث أساليب الميكروديسب التي يمكن أن تعمل مع الأنسجة قليلة جدا واستخراج نوعية جيدة الحمض النووي الريبي12،,13،,14.
  2. وينبغي توخي أقصى قدر من الحذر للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في جميع المراحل. وهذا يشمل العمل مع RNase المياه deionised مجانا، وذلك باستخدام الأدوات البلاستيكية RNase مجانا، وتنظيف جميع الصكوك التي تأتي في اتصال مع كتل FFPE مع كواشف إزالة التلوث RNase.
  3. يجب دائما ً التعامل مع الحمض النووي الريبي بعناية والاحتفاظ به في الجليد ما لم يتم تحديد خلاف ذلك لتقليل التدهور أثناء المناولة.
  4. إذا توافرت مواد كافية، استخرج الحمض النووي الريبي من أكثر من منطقة واحدة في كتلة FFPE لتوليد النسخ البيولوجي من أكبر عدد ممكن من العينات. بالنسبة لبعض العينات مع غلة الحمض النووي الريبي وافرة، وتقسيم الحمض النووي الريبي المستخرج إلى اثنين لمعالجة كما يكرر التقنية.
  5. إذا كان ذلك ممكنا، وجمع كمية صغيرة من العينة بشكل منفصل بعد استخراج لمراقبة الجودة (أي aliquot QC) لتجنب المناولة المتكررة والتجميد وذوبان دورات العينة التي من المرجح أن تؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي.
  6. تحقق من جودة الحمض النووي الريبي (ويفضل من aliquot QC) عن طريق تشغيله على نظام مراقبة الجودة RNA (على سبيل المثال، نظام محلل حيوي Agilent باستخدام رقاقة ناون ناون ناون، جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. تحليل توزيع شظايا الحمض النووي الريبي في العينات (على سبيل المثال، باستخدام برنامج الخبراء Bioanalyzer 2100) عن طريق حساب قيم DV200 و DV100 كنسبة من شظايا أكبر من 200 nt (DV200)أو 100 nt (DV100)في الحجم.
  8. بين DV200 وDV100، حدد المقياس الذي يحتوي على انتشار أكبر للقيم لمجموعة العينة المعطاة ، واختر ذلك لتجميع العينات وفقًا لدرجة سليمة.
    ملاحظة: بالنسبة لمجموعات العينات التي بها جزيئات الحمض النووي الريبي أكثر سلامة (أي قيم DV200 عالية، كل أو أكثر مع DV200 > 40٪)، من المرجح أن يكون DV200 مقياسًا مفيدًا لمراقبة الجودة. ومع ذلك ، لمجموعات عينة مع أكثر النصوص المتدهورة (أي انخفاض قيم DV200 ، كل أو أكثر مع DV200 < 40٪، DV100 من المرجح أن تكون مفيدة.
  9. استنادا إلى مقاييس مراقبة الجودة، حدد العينات التي تحتوي على DV100 < 40٪. لأن هذه الدرجة من التدهور من المرجح جداً أن لا تولد بيانات تسلسل مفيدة11،فمن المستحسن تجنب معالجة مثل هذه العينات. إذا كانت بدائل لمثل هذه العينات متوفرة، يجب التحقق من جودتها لتشمل بشكل مثالي فقط عينات مع DV100 > 50٪.

2- تسلسل إعداد المكتبة

  1. واستنادا ً إلى نوعية العينات كما تم تقييمها في الفرع 1، حدد طريقة مناسبة لتوليد مكتبات التسلسل.
    1. لمجموعات عينة مع تدهور منخفض جدا وارتفاع قيم DV200، استخدام تسلسل مرنا (أي التقاط نصوص polyadenylated) ، وتسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف (أي استخدام تحقيقات التقاط لجينات محددة ذات أهمية) ، RNA exome التسلسل (أي استخدام التقاط المسابير لإثراء لالنسخ الترميز) ، أو مجموع تسلسل الحمض النووي الريبي (أي استخدام التمهيديات عشوائية لالنسخ العكسي لتسلسل السكان الحمض النووي الريبي بأكمله بعد إزالة الحمض النووي الريبي من ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن عملية التثبيت قد تدخل التحيز في الحمض النووي الريبي المستخرج. وبالتالي، قد لا تعمل أساليب الالتقاط بشكل جيد في جميع الحالات، حتى مع قيم DV200 عالية.
    2. إذا كانت مجموعة العينة تتضمن عينات ذات تدهور عالٍ (DV200 < 30٪)، فاستخدم طريقة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الإجمالية وليس طريقة تعتمد على التقاط مناطق محددة من النصوص، لأن تلك المناطق المحددة قد تكون مفقودة في العينات المتدهورة. استخدام التمهيديات عشوائية لتوليد cDNA يؤدي إلى تمثيل أعلى من الحمض النووي الريبي صالحة للاستخدام في المكتبة النهائية، وبالتالي، هو أكثر ملاءمة لعينات FFPE-RNA.
    3. لاستنفاد الحمض النووي الريبي لمجموعات العينة مع ارتفاع التدهور، استخدم أساليب RNaseH القائمة. هذه هي الطرق التي ترتبط فيها تحقيقات الحمض النووي الخاصة بالحمض النووي rRNA بـ rRNA ، ويتم هضم الجزيئات المزدوجة التي تقطعت بها السبل بواسطة RNaseH ، ويتم تنظيف المسابير المتبقية بواسطة DNase (على سبيل المثال ، مجموعة استنفاد NEBNext rRNA ، جدول المواد). تعمل هذه الأساليب بشكل أفضل للعينات المتدهورة من بعض الطرق الأخرى8.
  2. لإنشاء مكتبات التسلسل، استخدم كميات إدخال أعلى (إن أمكن) للعينات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الأكثر تدهورًا (DV100 < 60٪). في حين عينات مع الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة معقولة (DV100 > 60٪) قد تسفر عن بيانات تسلسل جيدة حتى في كميات مدخلات أقل (أدنى اختبار لهذا البروتوكول مع FFPE-RNA كان ~ 20 نانوغرام)، لمزيد من الجيش الملكي النيبالي المتدهورة (DV100 < 60٪)، فمن الأفضل أن تبدأ مع كميات مدخلات أعلى (على سبيل المثال، > 100 نانوغرام).
    ملاحظة: إذا كان هناك ما يكفي (على سبيل المثال، > 500 نانوغرام) عينة متوفرة، فمن المستحسن حفظ ما لا يقل عن نصف العينة لتكرار إعداد المكتبة، إذا لزم الأمر. بالنسبة لعينات الإدخال المنخفضة (على سبيل المثال، 100 نانوغرام)، عادة ما يكون من الأفضل استخدام الكمية بأكملها وإنشاء مكتبة ذات تنوع كافٍ.
  3. بعد اختيار مجموعة إعداد المكتبة المناسبة لتوليد مكتبات RNA eq الإجمالية من عينات ذات تدهور عال (على سبيل المثال ، NEBNext Ultra II مكتبة RNA الإعدادية Kit لIllumina ، انظر جدول المواد)، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإنشاء المكتبات.
    ملاحظة: أثناء إعداد المكتبة، من المهم تخطي خطوة تجزئة الحمض النووي الريبي للعينات المتدهورة وضمان استخدام التمهيديات العشوائية لتوليف cDNA خيوط الأولى.
  4. لتحسين الكفاءة والسرعة ، وخاصة بالنسبة للعينات منخفضة الإدخال ، استخدم الرفوف المغناطيسية المناسبة مع مغناطيس ثابت قوي لخطوات التنقية والاختيار الحجم القائم على خرز (انظر جدول المواد).
  5. لإثراء PCR من الحمض النووي المُربط للمحول، قم بضبط عدد دورات التضخيم استنادًا إلى كمية الحمض النووي للمدخلات لضمان أقصى تمثيل مع تجنب الازدواجية غير الضرورية لجزيئات المكتبة. بالنسبة لعينات FFPE-RNA منخفضة الإدخال (<100 نانوغرام)، نوصي بدورات تضخيم 16-18، في حين أن عينات الإدخال العالي (1000 نانوغرام) عادة ما تولد كميات كافية من المكتبة في 12-14 جولة من التضخيم.
  6. بعد تضخيم PCR وتنظيف هافيتعليمات الشركة المصنعة، وتقييم جودة المكتبة من خلال تحليل تركيز المكتبة وتوزيع جزيء على منصة مناسبة (على سبيل المثال، Agilent Bioanalyzer رقاقة الحمض النووي، انظر جدول المواد). للحصول على عينات ذات قمم التمهيدي (~ 80 bp) أو قمم محول ديمن (~ 128 bp)، كرر تنظيف لإزالة تلك القمم.
  7. حساب متوسط حجم المكتبة لكل مكتبة (على سبيل المثال، باستخدام برنامج الخبراء Bioanalyzer 2100).

3. تسلسل مكتبة QC

  1. وبمجرد التأكد من خلو المكتبات من الملحقات الزائدة وأجهزة التمم، ولديها تركيز كاف ٍ للتسلسل اللاحق، وكميات إضافية بواسطة qPCR.
    ملاحظة: نظراً لحساسية توليد الكتلة تجاه تركيز المكتبة، فإن التحديد الكمي الدقيق أمر حيوي لمنع التسلسل المكلف من الأداء الناقص أو الحمولة الزائدة. والأساليب الكمية للـ PCR (qPCR) مفيدة لتحسين كثافة الكتلة على منصات إيلومينا دون أن يؤدي ذلك إلى التكتل المفرط. طريقة qPCR أكثر دقة وأكثر حساسية من الأساليب القائمة على التحليل النوعي و / أو الكمي لجميع جزيئات المكتبة (على سبيل المثال ، محلل Bioanalyzer Agilent) ، لأنه يقيس القوالب التي تحتوي على كل من تسلسل المحولعلى كلا الطرفين التي ستشكل مجموعات على خلية التدفق. ومع ذلك، يجب أن يعرف حجم المكتبة مسبقاً كما يجب تطبيق تصحيح الحجم على كافة العينات بحيث يمكن مقارنة النتائج مع منحنى قياسي.
    تنبيه: يجب ارتداء معاطف وقفازات المختبر دائمًا عند إجراء qPCR ، ويجب إجراء الإجراء في خزانة السلامة البيولوجية بناءً على تعليمات الشركة المصنعة.
    1. إعداد لوحة بئر 96 مع ثلاثة يكرر لكل عينة للوقاية من الخطأ باستخدام مجموعة مناسبة (على سبيل المثال، KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix لمكتبات Illumina، وهو جزء من مجموعة أدوات قياس كمية المكتبة، انظر جدول المواد)،جنبا إلى جنب مع المعايير، والتحكم الإيجابي (على سبيل المثال، التحكم في فيإكس، انظر جدول المواد)،ومراقبة أي قالب (NTC). المجلس الوطني الانتقالي هو مزيج qPCR دون مكتبة الحمض النووي. يمكن أن يكون التحكم الإيجابي أي مكتبة ذات تركيز معروف وحجم جزء.
      1. إعداد ما لا يقل عن ستة تخفيف للمعايير بعد بروتوكول المورد.
    2. بعد إضافة جميع المكونات (أي مزيج qPCR الرئيسي والمكتبات والمعايير) ، قم بتغطية اللوحة بختم الفيلم واستخدام الصرير لضمان أن يجعل الفيلم اتصالًا آمنًا وآمنًا مع اللوحة.
    3. دوامة وتدور أسفل لوحة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على الأقل. فحص بصريا لوحة للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الجزء السفلي من الآبار.
    4. قم بإعداد اللوحة على الدراجة الحرارية (على سبيل المثال نظام اللمس CFX96 ، انظر جدول المواد)باستخدام الإعدادات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
    5. حفظ مجلد التشغيل حيث يمكن الوصول إليه لتحليل البيانات.
    6. أثناء تحليل البيانات، تحقق من أن الميل في نطاق -3.1 إلى -3.6، والكفاءة من 90٪ إلى 110٪ وR2 (معامل الارتباط الذي تم الحصول عليه للمنحنى القياسي) ما لا يقل عن 0.98.
  2. التجميع:بمجرد الحصول على تركيز qPCR للمكتبات الجاهزة المتسلسلة ، تجمع كميات equimolar لكل مكتبة من المكتبات ، اعتمادًا على عدد القراءات التسلسلية المطلوبة لكل عينة والإخراج التسلسلي للأداة.
  3. QC من تجمعات: كمية تجمعات المكتبة مرة أخرى بواسطة qPCR باتباع نفس البروتوكول كما هو موضح في الخطوة 3.1.

4- التسلسل

  1. اعتمادا على معلمات التشغيل، سحب مجموعات كاشف التسلسل وذوبان لهم بعد دليل المستخدم. يرجى مراجعة موقع Illumina للحصول على أحدث إصدارات جميع أدلة المستخدم لتسلسل على الصكوك Illumina.
  2. تأكد من إذابة الكواشف تمامًا ووضع علبة الكواشف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. يجب بدء التشغيل في موعد لا يتجاوز 2 ساعة بعد أن تم إذابة الكواشف. عدم القيام بذلك يمكن أن يؤثر على جودة نتائج التشغيل.
  3. عكس خرطوشة 5x لخلط الكواشف والنقر بلطف على مقاعد البدلاء للحد من فقاعات الهواء.
  4. وضع حزمة خلية تدفق غير ملفوفة جانبا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. فك حزمة خلية التدفق وتنظيف السطح الزجاجي لخلية التدفق مع مسح الكحول خالية من الوبر. تجفيف الزجاج بنسيج مختبر منخفض الوبر.
  6. فتح Illumina"مدير التجربة"التطبيق. اختيار "إنشاء ورقة عينة" ، ثم اختر المنظم وانقر فوق"التالي".
  7. إنشاء وتحميل ورقة عينة على أساس معايير تسلسل Illumina (على سبيل المثال، Illumina مدير التجربة، دليل البرمجيات).
  8. عند المطالبات، قم بالمسح الضوئي في الباركود مجموعة الكاشف وأدخل تشغيل إعداد المعلمات (على سبيل المثال، لتشغيل دورة PE 75 مفهرسة واحدة، أدخل 76-8-76).
  9. تشويه وإضعاف تجمع المكتبة على أساس توصية دليل المستخدم المنظم (على سبيل المثال، دليل النظام NextSeq 500 من Illumina، انظر جدول المواد).
  10. تشويه وإضعاف مكتبة التحكم PhiX (انظر جدول المواد)إلى التركيز المناسب (على سبيل المثال، 1.8 متر في م لNextSeq).
  11. مزيج مكتبة عينة والتحكم في X لينتج نسبة حجم التحكم في 1٪ فيإكس.
  12. تحميل عينة مشوهة ومخففة في خرطوشة الكاشف في الخزان المعين.
  13. قم بتحميل خلية التدفق وخرطوشة المخزن المؤقت وخرطوشة الكاشف.
  14. إجراء فحص تلقائي ومراجعة للتأكد من أن معلمات التشغيل تجتاز فحص النظام.
  15. عند اكتمال الفحص التلقائي، حدد البدء لبدء تشغيل التسلسل.

5 - تحليل البيانات وتقييم الجودة

ملاحظة: يتضمن سير عمل تحليل بيانات RNA-seq النموذجي(الشكل 1)المعالجة المسبقة ومراقبة الجودة ، والمحاذاة إلى الجينوم ومحاذاة مراقبة الجودة ، والقياس الكمي للجين والنسخ ، وتحليل ارتباط العينة ، والتحليل التفاضلي بين مجموعات العينة المختلفة ، وشروط العلاج ، وإثراء مجموعة الجينات وتحليل المسار.

قد تحتوي بيانات RNA-seq على مشكلات تتعلق بالجودة يمكن أن تؤثر على دقة التنميط الجيني وتؤدي إلى استنتاجات خاطئة. لذلك ، فإن فحوصات مراقبة الجودة الأولية للجودة التسلسلية ، والتلوث ، وتحيز تغطية التسلسل ، وغيرها من مصادر القطع الأثرية مهمة للغاية. يوصى بتطبيق خط أنابيب RNA-Seq QC مشابه لسير العمل الموصوف هنا للكشف عن القطع الأثرية وتطبيق التصفية أو التصحيح قبل تحليل المصب.

  1. تجهيزها
    ملاحظة: يتضمن هذا demultiplexing، وتقييم جودة قراءة التسلسل، ومحتوى GC، ووجود محولات التسلسل، ممثلة تمثيلاً زائداً ك-mers، وقراءات مكررة PCR. تساعد هذه المعلومات على الكشف عن أخطاء التسلسل أو قطع العمل اتّصال PCR أو التلوث.
    1. Demultiplex Illumina تسلسل تشغيل باستخدام أداة برنامج Illumina bcl2fastq2 لتوليد ملفات FASTQ الخام لكل عينة محددة في ورقة العينة. السماح لعدم تطابق واحد في الرموز الشريطية فهرس العينة لتحمل أخطاء التسلسل إذا لم يكن هناك تصادم الباركود.
    2. تشغيل أداة برنامج FASTQC15 لإجراء فحص الجودة على ملفات FASTQ الخام للكشف عن أي نوعية رديئة أو تشوهات في قراءة التسلسل.
    3. للحصول على محول وتقليم قواعد منخفضة الجودة، قم بتقليم محولات التسلسل وقواعد الجودة المنخفضة باستخدام أدوات برامج Cutadapt16 أو Trimmomatic17. حفظ القراءات المشذبة في ملفات fastq ذات نهاية الزوج.
    4. شاشة التلوث
      1. تشغيل FASTQ_screen18 للكشف عن التلوث العرضي المحتمل مع الأنواع الأخرى.
      2. تشغيل miniKraken من Kraken219 لتحديد تصنيفات الأنواع الملوثة.
  2. محاذاة للإشارة الجينوم ومحاذاة آخر QC
    1. يمكن محاذاة القراءات المشذبة إلى تسلسل الجينوم المرجعي (GRCh Build hg19 أو hg38) باستخدام مُمصفف STAR20. تطبيق ملف GTF التعليق التوضيحي Gencode لتوجيه محاذاة النص الربط. فمن المستحسن لتشغيل ستار 2-تمريرل لزيادة الحساسية لتقاطعات لصق الرواية. في الممر الثاني ، سيتم إعادة تعيين جميع القراءات باستخدام الجينات المشروحة والنصوص وتقاطعات الرواية من الممر الأول.
    2. تنفيذ مراقبة الجودة بعد المحاذاة.
      1. تشغيلMarkDuplicates 21بيكارد لتقييم تعقيد المكتبة عن طريق تحديد مقدار القراءات الفريدة أو غير المكررة في العينات.
      2. تشغيل برنامج CollectRnaSeqMetrics بيكارد لجمع نسب رسم الخرائط على الترميز، intronic، intergenic، مناطق UTR، وتغطية الجسم الجيني.
      3. تشغيل RSeQC22 لتحديد المسافة الداخلية الزوج قراءة، وقراءة التوزيع بين exons CDS، 5'UTR، 3'UTR، إنترون، TSS_up_1kb، TSS_up_5kb، TSS_up_10kb، TES_down_1kb، TES_down_5kb، TES_down_10kb، قراءة محتوى GC، تشبع تقاطع، ومعلومات حبلا المكتبة.
      4. تشغيل متعدد QC23 لإنشاء تقرير مجمعة في تنسيق HTML.
  3. قياس الجينات وتحليل التصحيح
    1. تشغيل RSEM24 للحصول على العد الخام وكذلك تطبيع قراءة العد على الجينات والنصوص. قياس عدد القرأات مثل RPKM (يقرأ لكل كيلو قاعدة من نموذج exon لكل مليون يقرأ)، FPKM (شظايا لكل كيلو قاعدة من نموذج exon لكل مليون قراءات معينة)، وTPM (نصوص لكل مليون) هي الأكثر في كثير من الأحيان ذكرت الحمض النووي الريبي seq قيم التعبير الجيني. يمكن تصفية الجينات المعبر عنها تحت عتبة صاخبة (مثل TPM < 1 أو العدد الخام <5).
    2. تنفيذ التحديد الكمي للنص لتجميع الأعداد الخام من القراءات المعينة لكل تسلسل نص باستخدام برامج مثل HTSeq-count أو featureCounts.
    3. تشغيل تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام برنامج نصي R لتحديد تأثيرات الدُفعة وتقييم خريطة جودة مجموعة البيانات المعطاة25. يمكن إجراء تحليل ارتباط العينة باستخدام ارتباط Pearson بين مقاييس مختلفة.
  4. تحليل التعبير الجيني التفاضلي
    1. إجراء تحليل تفاضلي الجينات بين ظروف العينة باستخدام البرنامج edgeR26،,27 و / أو limma-Voom28 واستخدام أساليب التطبيع بما في ذلك TPM، TMM، DESeq،أو UpperQuartile.
    2. من المستحسن تشغيل ما لا يقل عن أداتين لبرامج التحليل التفاضلي من أجل استدعاء مجموعتين من قوائم DEGs للمقارنة والحصول على مجموعات DEGs النهائية لتحسين حساسية الكشف ودقته.
  5. التخصيب مجموعة الجينات وتحليل المسار
    1. إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA)29,30 على أساس ترتيب النصوص وفقا لقياس الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) قائمة لتحديد ما إذا كانت DEGs تظهر الاختلافات الهامة إحصائيا، متوافقة بين الظروف البيولوجية.
    2. إجراء تحليل الوظائف باستخدام موارد مثل الأنطولوجيا الجينية31، DAVID32،33، أو أدوات البرامج الأخرى المتاحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وطبقت المنهجية المذكورة أعلاه على 67 عينة من عينات FFPE التي تم تخزينها في ظل مجموعة متنوعة من الظروف المختلفة لمدة 7-32 سنة (كان متوسط وقت تخزين العينة 17.5 سنة). وقد سبق وصف مجموعة البيانات ونتائج التحليل المعروضة هنا ونشرها في تشاو وآخرون11. عند التحقق من جودة العينة كما هو موضح سابقًا (أي آثار المثال في الشكل 2)، وجد أن DV100 أكثر فائدة من DV200 لأنه أكثر حساسية لقياس نسبة أحجام الأجزاء الأصغر بشكل دقيق لعينات الحمض النووي الريبي المتدهورة لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتوضح الطريقة الموصوفة هنا الخطوات الرئيسية المطلوبة للحصول على بيانات تسلسل جيدة من عينات FFPE-RNA. النقاط الرئيسية للنظر مع هذه الطريقة هي: (1) ضمان الحفاظ على الحمض النووي الريبي على أفضل وجه ممكن بعد الاستخراج عن طريق تقليل مناولة العينة وتجميدها وذوبان دوراتها. الaliquots مراقبة الجودة منفصلة مفيدة جدا. (2) استخدام مقياس مراقبة الجودة الذي هو أفضل لمجموعة عينة معينة. قيم RIN و DV200 غالباً ما تكون غير مفيدة للعينات المتدهورة، وقد يكون DV100 المقياس المفضل لتقييم الجودة في مجموعة عينة معينة. (3)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقد مول هذا العمل المعهد الوطني للسرطان، المعاهد الوطنية للصحة. Leidos بحوث الطب الحيوي ، وشركة هي العمليات والدعم الفني المقاول لفريدريك المختبر الوطني لأبحاث السرطان الذي تموله بالكامل المعاهد القومية للصحة. العديد من المؤلفين (YZ، MM، KT، YL، JS، BT) منتسبون إلى Leidos Biomedical Research, Inc. ، ولكن يتم تمويل جميع المؤلفين بالكامل من قبل المعهد الوطني للسرطان بما في ذلك رواتب المؤلفين والمواد البحثية. لم تقدم Leidos Biomedical Research, Inc. راتبًا للمؤلفين (YZ ، MM ، KT ، YL ، JS ، BT) أو مواد للدراسة ، كما لم يكن لها أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو التحليل أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

شكر وتقدير

نحن ممتنون للدكتورة دانييل كاريك (قسم مكافحة السرطان وعلوم السكان، المعهد الوطني للسرطان) للحصول على مساعدة مستمرة، وخاصة لبدء هذه الدراسة، وتزويدنا بالعينات، وللاقتراحات المفيدة أثناء تحليل البيانات. نشكر بإخلاص جميع أعضاء مرفق تسلسل CCR في مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان لمساعدتهم أثناء إعداد العينة وتسلسلها ، وخاصة بريندا هو للمساعدة في عينة QC ، أوكسانا الألمانية لمكتبة QC ، تاتيانا سميرنوفا لتشغيل المنظمين. كما نود أن نشكر تساي وي شين وآشلي والتون في مجموعة المعلوماتية الحيوية لمرفق التسلسل للمساعدة في تحليل البيانات وتنفيذ خط أنابيب RNA-seq. كما نشكر CCBR وNCBR على المساعدة في خط أنابيب تحليل RNaseq وأفضل الممارسات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
Agilent DNA 7500 KitAgilent5067-1506
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511
AllPrep DNA / RNA FFPE KITQiagen80234
CFX96 نظاماللمسBio-Rad 1855195
v2-IlluminaKapaBiosystemsKK4824
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit ل IlluminaNew England BiolabsE7765Shttps://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit< / u>
NEBNext rRNA Depletion Kit (الإنسان / الفأر / الجرذ)نيو إنجلاند BiolabsE6310L
NextSeq 500 نظام التسلسلIlluminaSY-415-1001NextSeq 500 دليل النظام: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf
NextSeq PhiX Control KitIlluminaFC-110-3002
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)Illumina20024907
10X الجينوم فاصل مغناطيسي10X الجينوم120250
دوار MultimixerVWR13916-822
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851197
مجموعة كاشف التسلسلIllumina20024907
Flow Illumina 20024907
خرطوشة العازلة وخرطوشة الكاشفIllumina20024907
محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.2N)Millipore SigmaSX0607D-6
TRIS-HCL Buffer 1.0M ، درجة الحموضة 7.0Fisher Scientific50-151-871
مجموعة القياس الكمي لمكتبة

المراجع

  1. Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
  2. Hedegaard, J., et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 9 (5), 98187(2014).
  3. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. 2017, 1926304(2017).
  4. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  5. von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2 (12), 1261(2007).
  6. Esteve-Codina, A., et al. A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples. PLoS One. 12 (1), 0170632(2017).
  7. Vukmirovic, M., et al. Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15(2017).
  8. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  9. Sinicropi, D., et al. Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue. PLoS One. 7 (7), 40092(2012).
  10. Altekruse, S. F., et al. SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).
  11. Zhao, Y., et al. Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas. PLoS One. 14 (5), 0216050(2019).
  12. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).
  13. Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma. Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).
  14. Wimmer, I., et al. Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples. Scientific Reports. 8 (1), 6351(2018).
  15. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2019).
  16. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  17. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  18. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/ (2019).
  19. Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), 46(2014).
  20. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  21. Broad Institute. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2019).
  22. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  23. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  24. Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  25. Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data. BioMed Research International. 2018, 2906292(2018).
  26. McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).
  27. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  28. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).
  29. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  30. Mootha, V. K., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).
  31. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
  32. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
  33. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
  34. Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FastQC STAR RSeQC Multi QC
الأمثل لتسلسل وتحليل العينات FFPE-RNA المتدهورة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.