يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الالتصنت المناعي من الخصيتين Drosophila جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة

4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61061

⸱

أغسطس 27, 2020

 ,  , 
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكول محسن لإعداد التركيب الكامل والتلوي المناعي لخصيات دروسوفيلا ، ومناسبة للتنظير المجهري الكونفوكوكال ، كما تسمح بوضع علامات قابلة للاستنساخ وموثوق بها. نحن نوضح هذا البروتوكول من خلال التمثيل ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي لتجارب الكولوكاليشن على الخلايا المنوية الكبيرة S4-S5.

الملخص

الخصيتان Drosophila هي نظام نموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية والهندسة المعمارية النووية وداء الميوس وتنمية الحيوانات المنوية. ومع ذلك ، غالبا ما يرتبط التهيئة المناعية لاختبار Drosophila بأكمله بعدم التوحيد الكبير للتلطيخ بسبب اختراق الأجسام المضادة. المستحضرات المسحقة فقط جزئيا التغلب على المشكلة لأنه يقلل من نوعية 3D من التحليلات. هنا، ونحن نصف بروتوكول كامل جبل باستخدام NP40 وهبتان أثناء التثبيت جنبا إلى جنب مع وضع التوسيل المناعي في وسائل الإعلام السائلة. فهو يحافظ على الحجم المناسب للتنظير المجهري البؤري جنبا إلى جنب مع وضع العلامات القابلة للاستنساخ والموثوق بها. نعرض أمثلة مختلفة على إعادة تشكيل النواة ثلاثية الأبعاد لنوى الخلايا المنوية من أقسام الكونفوجال. تسمح القابلية للاستنساخ داخل الخصيتين وبينهما بالقياس الكمي ثلاثي الأبعاد ومقارنة الفلورسينس بين الخلايا المفردة من الأنماط الجينية المختلفة. استخدمنا مكونات مختلفة من هيكل MINT داخل النووية (Mad1 التي تحتوي على الأراضي النووية) فضلا عن عنصرين المرتبطة مجمع المسام النووية لتوضيح هذا البروتوكول وتطبيقاته على أكبر خلايا الخصية، وs4-S5 الحيوانات المنوية.

المقدمة

إن الخصيتان Drosophila نموذج قيم لدراسة البنية النووية. في الخلايا المنوية ميتوتيك، وتحتل إلى حد كبير الحجم النووي من الكروماتين. تخضع هذه الخلايا لأربع جولات من الانقسام ، مما ينتج كيسا من 16 خلية منوية أولية. على مدى الأيام القليلة القادمة ، تمر الخلايا المنوية عبر 6 مراحل نمو (S1-S6) ، وزيادة كبيرة في الحجم ، تقريبا 20 أضعاف1،2. كما أنها تغير مورفولوجيا النووية الخاصة بهم. الخطوط العريضة للنواة ، التي كشفت عنها صفح Dm0 ، يصبح غير منتظم ويظهر التغلغل العميق1،3. ويرافق ذلك تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني والتعديلات في chromatin المنظمة1،4،5،6،7. الكروموسومات بين المراحل محددة جيدا في المرحلة S4-S5، وتشكيل ثلاثة كتل متميزة المقابلة لautsomes ثنائية التكافؤ الرئيسية 2 والزوج X-Y رست مع النيوكليولوس.

تم عزل Mad1 أصلا كعنصر رئيسي في نقطة التفتيش mitotic (استعرضت في8). في مرحلة ما بين المراحل، ويوصف بأنه يقع في المقام الأول في المغلف النووي ولكن أيضا في النيوكليوبلازم9،10،11. في اختبار Drosophila ، أبلغنا أن Mad1 بارز في النيوكليوبلازم ، ويرتبط ارتباطا وثيقا بكتلة الكروماتين الذاتية الرئيسية وإلى حد أقل مع الكروماتين XY. لقد حددنا هذا الهيكل المرتبط بالكروماتين على أنه MINT (الإقليم النووي الداخلي المحتوي على Mad1)12. وارتبطت أربعة بروتينات أخرى مع MINTs في الحيوانات المنوية: نوكليوبورين Mtor / Tpr، وS SUMO peptidase Ulp1، وبروتين نقطة تفتيش ميتوتيك Mad2 و وحدة فرعية من مجمع يشبه بوليكومب Raf212.

لإكمال وصف MINTs ، كنا بحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة وواجهنا المشاكل التقنية التي تواجه بشكل عام مع التثبط المناعي في الخصية: نفاذية ضعيفة مما يؤدي إلى عدم توحيد كبير للتلطيخ في عمق الخصية ، خاصة في الخلايا المنوية الكبيرة. Sألغت الاستعدادات زيادة الوصول إلى الأجسام المضادة ولكن أدى إلى صور مضغوطة, تقييد التحليلات 3D, ومنع قياس الفلورية الكمية, بما في ذلك كولوكالينج. ويمكن أيضا معالجة مشكلة اختراق الأجسام المضادة من قبل عوامل permeabilizing مثل 0.3٪ Na deoxycholate13، ولكن هذا الإجراء لم يسفر في أيدينا عن نتائج قابلة للاستنساخ. ولأننا قمنا بالعديد من تجارب وضع العلامات المشتركة، فقد تطلعنا إلى تحسين بروتوكول التهيئة. أدى الجمع بين 1٪ NP40 بالإضافة إلى الهيبتان إلى المزيد من القابلية للاستنساخ ، خاصة في دراسة الخلايا المنوية الكبيرة.

هذا البروتوكول ينفذ التثبيت والتلوي المناعي للخصيات في التعليق، وتحسين جودة العينة، فضلا عن تعزيز استنساخ، وجعلها مناسبة للفحص المجهري confocal. استخدمنا البروتوكول لتحديد أفضل للعلاقات المكانية لبعض بروتينات المغلف النووي مع الهياكل النووية للخلايا المنوية الكبيرة. ستسمح هذه الطريقة بإجراء تحقيقات أفضل للتغيرات المصاحبة لتطور الخلايا المنوية ، على سبيل المثال التغيرات الهيكلية الديناميكية للنواة بما في ذلك الكروماتين والنوكليوبلازم والمسام النووية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. مجموعة الخصية دروسوفيلا

ملاحظة: الذكور الصغار (0-15 ساعة بعد انهيار الدماغ) ضرورية لفحص الخلايا الجرثومية ثنائية الديبلويد (أي الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية).

  1. حدد الذباب الصغير قدر الإمكان لتقليل التداخل من تطوير الحيوانات المنوية.
  2. تخدير الذباب عن طريق التعرض القصير لثاني أكسيد الكربون ونقلها إلى منصة ذبابة14،15.
  3. تحت المجهر تشريح (10x التكبير)، واستخدام ملقط لإزالة الرأس.
  4. نقل 5 إلى 10 الذباب مقطوعة الرأس إلى 100 ميكرولتر من العازلة رينغر (183 MM KCI، 47 mM NaCl، 10 mM تريس-HCI، 1 mM EDTA، مثبط البروتين الكامل، درجة الحموضة 6.8) على شريحة زجاجية مغلفة بالسيليكون على دعم الخلفية السوداء.
  5. مع تشريح المجهر في التكبير 40x، استخدم زوج واحد من ملقط رقم 5 لعقد ذبابة بين الصدر والبطن، ومع ملقط أخرى، وسحب البطن بعيدا عن الصدر. عزل بسرعة الخصيتين والأنسجة المجاورة من جثة ذبابة15 ومكان في قطرة جديدة من العازلة رينغر على نفس الشريحة.
  6. مرة واحدة جميع الخصيتين جاهزة، وتنظيف الخصيتين من الأنسجة المتبقية (الغدة الملحقة والأعضاء التناسلية الخارجية).
  7. إزالة المخزن المؤقت الزائد من الإفلات الذي يحتوي على الخصية تشريح. عادة، استخدم ماصة P200 مع طرف 10 ميكرولتر مزودة على رأس طرف 200 ميكرولتر. وهذا يسمح بإزالة الفائض السائل من خلال فتحة صغيرة. ضع قطرة من 4٪ مثبت بارافورمالديهايد على رأس القطرة التي تحتوي على الخصيتات المشرحة، ثم قم بنقل الخصية بسرعة إلى أنبوب يحتوي على محلول مثبت جديد.

2. تثبيت بارافورمالدهيد

  1. إعداد 2 مل من محلول التثبيت قبل الاستخدام مباشرة: 600 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد مخففة في ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) مع 30 ميكرولتر من NP40 20٪ بالإضافة إلى 1200 ميكرولتر من الهيبتان في أنبوب طرد مركزي ميكروني سيليكون 2 مل. استخدام 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني أعدت في 600 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    تحذير: الهيبتان والبارافورمالديهيد سامان ويجب التعامل معهما في غطاء الدخان. التصرف فيها وفقا للوائح المعهد المضيف.
  2. نقل الخصيتين باستخدام p200 ميكروبايت مع طرف فتحة واسعة إلى حل PFA/NP40/heptane. يهز أنبوب صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية باليد. مواصلة تحديد الخصية على خلاط دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. وقف خلاط دوارة ووضع أنبوب في رف أنبوب للسماح فصل المرحلة والخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. إزالة جميع heptane والحل المثبت وشطف الخصيتان بسرعة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.
  5. نقل إلى أنبوب 200 μL الفردية نظيفة. إجراء جميع الحضانات في هذه الأنابيب الصغيرة لتقليل كميات الأجسام المضادة المستخدمة.
  6. إزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ميكروبايت 200 ميكرولتر مع كل من P200 وطرف P10 المرفقة. الحرص على عدم تستنشق الخصية.
  7. إبقاء الخصيتين في برنامج تلفزيوني 1x على الجليد حتى جميع العينات جاهزة.

3. تلطيخ الأجسام المضادة في الحل

  1. تجاهل برنامج تلفزيوني وترك الخصيتين في 0.3٪ PBS-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ل permeabilize أغشية الخلايا.
  2. قبل الحضانة في نفس العازلة بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 1 ساعة.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 0.3٪ PBS-T بالإضافة إلى 5٪ NGS(جدول المواد).
  4. احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) مع التحريض لطيف على الروك.
  5. غسل 3 مرات في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. السماح للخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1:500 من سلسلة DyLight المترافقة.
  7. احتضان الأجسام المضادة الثانوية في غرفة مظلمة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. غسل في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر مع 0.2٪ PBS-T و 0.1٪ PBS-T، في كل مرة لمدة 30 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. قم بغسل نهائي في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة لإزالة المنظفات.
  9. إضافة 180 ميكرولتر من حل DAPI في 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 15 دقيقة. حل الأسهم هو 10 ملغ / مل في H2O. تجنب صنع حل الأسهم في برنامج تلفزيوني، والتي يمكن أن تقلل من إشارة تلطيخ DAPI على الكروماتين المنتشر في الحيوانات المنوية أكبر.
  10. يغسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  11. استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة نظيفة.
  12. يستنشق الخصية ووضعها على الشريحة. قبل الشطف تلميح فتحة واسعة مع 0.1٪ PBS-T يمنع الخصيتين من التمسك تلميح. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة.
  13. إضافة قطرة (حوالي 100 ميكرولتر) من سيتيفلور AF1.
  14. ضع غطاء زجاجيا برفق فوق الأنسجة، مع الحرص على تجنب محاصرة فقاعات الهواء.
  15. ختم غطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
  16. مراقبة الشرائح على المجهر.

4. تحليلات التكلس

  1. الحصول على صور confocal. استخدمنا المجهر زايس LSM 710 confocal (63x خطة الزيت أبوكروماتيك) مع دقة z من 0.5 أو 1 ميكرومتر.
  2. حدد خلايا مختلفة من الخصية المستقلة.
  3. استيراد الصور إلى برامج المعالجة (مثل Imaris).
  4. تعريف النواة عن طريق تجزئة يدوية من أجل استبعاد النوى المجاورة. استخدام برنامج كولوك؛ فإنه يجمع معاملات الارتباط بيرسون (PCCs) داخل وحدة التخزين بأكملها بين 2 الفلوروفور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

العقبة الرئيسية للحصول على تلطيخ كافية من الخصيتين Drosophila هو penetrability محدودة من الأجسام المضادة، والتي تم حلها جزئيا باستخدام الاستعدادات سحقت ولكن على حساب الحث على تقييد التحليلات 3D (على سبيل المثال التمثيل 3D أو قياس الكولوكاليد). يسمح الإجراء وضع العلامات موحدة ويحافظ على حجم كافة خلايا الخصية. هنا ركزنا التوضيح للطريقة على التمثيل ثلاثي الأبعاد لخلايا الحيوانات المنوية S4-S5 ، لأنها أكبر الخلايا وبالتالي أكثر حساسية للتشوه من السحق. استخدمنا علامات نووية مختلفة، بما في ذلك النيوكليوبورينات ووضع العلامات عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول طريقة للتكبيل المناعي الناجح لخصيات Drosophila البالغة الكاملة التركيب. كما ورد في إجراءات أخرى يجب استخدام الذكور الصغار (حتى أننا قصرنا العمر إلى أقل من 20 ساعة بعد الانفجار) لتقليل وجود الحيوانات المنوية النامية، مما يهدد بعرقلة الحيوانات المنوية. يجب أن يكون التشريح سريعا ويجب تعديل تمييع الأجسام المضادة لتحسيننسبة الإشارةإلى الضوضاء 21و22و23. لأنه باستخدام بروتوكولات أخرى ، لم نلاحظ تلطيخ في جميع أنحاء ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

نشكر ب. فيريجزر، ج. يوهانسن ه. ، أوخورا على الأجسام المضادة وألف ديبيك، ومراكز بلومينغتون وفيينا للأسهم للذباب. بفضل جاكسون جيم للاقتراحات وتحفيز المناقشات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ذبابة الفاكهة srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyOGift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFPJ Cell Sci. 2011 May 15; 124 (Pt 10): 1664-71.
Mtor RNAi VDRC110218مركز ذبابة الفاكهة RNAi
في فييناMaterials
DAPI مخزون ThermoD1306في H2O
Dumont # 5 Fine Forseps أدوات
الدقيقة MBP نصائح ماصة واسعة التجويففيشربراند11917744طرف فتحة واسعة
Thermo Scientific   0.2 مل أنبوب فرديThermoAB-0620
2 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة سيجماT3531-200EA أنبوب 2 مل من السيليكون
سيتي فلور AF1سيتي فلورAF1
داكوبن سيجماZ377821-1EA 
مصل الماعز العادي (NGS)سيجماNS02L-1ML
بارافورمالدهيد 4٪سيجماP6148-500G & nbsp ؛بارافورمالدهيد (4٪) مذاب في PBS 1X ; aliquot بمقدار 600 مل 
PBS 1XThermo14190094DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم
0.1٪ (0.2 أو 0.3٪) PBS-T & nbsp ؛PBS 1X  تحتوي على 0.1٪ (0.2٪ أو 0.3٪) Triton X-100
Triton X-100 ، للبيولوجيا الجزيئية ،  SigmaT8787
Antibodies
GFP boosterChromotekgba4881/200
Mouse anti-Mtor1/40 هدية من J. Johansen ، هدية الفئران بجامعة ولاية
المضادة ل Nup621/200 من H. Ohkura (جامعة إدنبرة ، المملكة المتحدة
- خنزير غينيا مضاد ل Ulp1هدية 1/200 من C. P. Verrijzer ، جامعة إيراسموس ، هدية روتردام
أرنب مضادة ل Raf21/200 من C. P. Verrijzer ، جامعة إيراسموس ، سلسلة روتردام
DyLight المترافقة   ؛Thermo1/500 Donkey مضاد (خنزير غينيا ، فأر ، أرنب أو فأر) كأجسام مضادة ثانية
معرف يجب تحضير محلول العلوم أيوا

المراجع

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

NP40
الالتصنت المناعي من الخصيتين Drosophila جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.