مقالة منهجية

نموذج من مرض القلب الإقفاري والمقارنة المستندة إلى الفيديو من انكماش القلبية من خلال استخدام هابسك المشتقة من القلب

DOI:

10.3791/61104

⸱

مايو 5, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم نموذجًا لأمراض القلب الإقفارية باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان، إلى جانب طريقة للتقييم الكمي لتلف الأنسجة الناجم عن نقص التروية. يمكن أن يوفر هذا النموذج منصة مفيدة لفحص المخدرات والمزيد من البحوث حول أمراض القلب الإقفارية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض القلب الإقفاري هو سبب كبير للوفاة في جميع أنحاء العالم. ولذلك كان موضوع كمية هائلة من البحوث، وغالبا مع نماذج الحيوانات الصغيرة مثل القوارض. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا قلب الإنسان تختلف اختلافا كبيرا عن قلب القوارض ، مما يؤكد الحاجة إلى نماذج ذات صلة سريريا لدراسة أمراض القلب. هنا، نقدم بروتوكولا لنموذج مرض القلب الإقفائي باستخدام cardiomyocytes متمايزة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPS-CMs) وتحديد الضرر والإعاقة الوظيفية للقلب الإقفاري. التعرض ل 2٪ الأكسجين دون الجلوكوز والمصل يزيد من نسبة الخلايا المصابة، والتي يشار إليها عن طريق تلطيخ النواة مع يوديد بروبيد، ويقلل من الجدوى الخلوية. كما تقلل هذه الشروط من قابلية قابلية قابلية hiPS-CMs كما أكدها تحليل حقل النزوح في مجال الصور المرئية المجهرية. علاوة على ذلك قد يوفر هذا البروتوكول طريقة مريحة لفحص الأدوية الشخصية من خلال تسهيل استخدام خلايا هيبس من المرضى الفرديين. ولذلك، فإن هذا النموذج من أمراض القلب الإقفاري، استنادا إلى iPS-CMs من أصل بشري، يمكن أن توفر منصة مفيدة لفحص المخدرات ومزيد من البحوث حول أمراض القلب الإقفاري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض القلب الإقفاري (IHD) معترف به في جميع أنحاء العالم كسبب رئيسي للوفاة، وكان من المقدر أن يكون مسؤولا عن أكثر من تسعة ملايين حالة وفاة في عام 20161. ولا يزال انتشار أمراض القلب والأوعية الدموية في ارتفاع، ويبدو أن العولمة قد أسهمت في انتشار عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب في البلدان النامية. ولذلك، فإن دراسة IHD أصبحت أكثر إلحاحا على نحو متزايد2.

النماذج التجريبية لأمراض القلب والأوعية الدموية حاسمة لدراسة آليات المرض، ودقة التشخيص، وتطوير علاجات جديدة. وقد اقترحت العديد من المختبرات عدة نماذج تجريبية. ومن الأهمية بمكان اختيار نموذج ذي مزايا هامة؛ الجدوى والتكرار والتشابه مع الأمراض البشرية هي عوامل رئيسية في اختيار نماذج أمراض القلب والأوعية الدموية3. الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) التي تحمل طفرات محددة مرتبطة باعتلال عضلة القلب هي بديل واعد للنماذج الحيوانية4. على الرغم من أن العديد من الاستراتيجيات قد وصفت لتحفيز cardiomyocytes باستخدام iPSCs5,6,7,8,9, هنا نقدم طريقة بسيطة لإنتاج نموذج IHD باستخدام cardiomyocytes تختلف عن hiPSCs, في اختيار شاقة من cardiomyocyte باستخدام علامات لا يتم تطبيقها. في هذه الطريقة، يتم اختيار cardiomyocytes وظيفيا عن طريق تحليل الانكماش التلقائي.

تحريض cardiomyocytes باستخدام hiPSCs يتجنب التضحية الحيوانية والجراحة الصعبة من الناحية الفنية. إنشاء نماذج حيوانية من IHD يتطلب تقنيات جراحية التحدي10. محاكاة تماما الجوانب المختلفة الفيزيولوجية الباثولوجية لأمراض القلب البشرية مثل معدل ضربات القلب وإمكانات العمل من علم وظائف الأعضاء من القوارض يكاد يكون من المستحيل. وإلى جانب أخلاق وأخلاقيات استخدام النماذج الحيوانية، لا بد من وضع نماذج تجريبية جديدة غير النماذج الحيوانية. Cardiomyocytes متباينة من الخلايا iPS الإنسان أفضل تقليد الحالة الفسيولوجية للقلب البشري. في هذا البروتوكول، ونحن إنشاء نموذج من IHD باستخدام cardiomyocytes المستمدة من خلايا هيبس (هيبس-CMs). في نموذجنا ، يؤدي الحرمان من الأكسجين والجلوكوز إلى انخفاض في القوة المتعاقدة وقابلية البقاء لـ hiPS-CMs. يوفر أسلوبنا نهجًا جديدًا لنموذج IHD ويوضح منصة جديدة لدراسة هذا المرض.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الصيانة hiPSC

  1. معطف لوحة ثقافة ستة-جيدا مع اللامينين (جدول المواد).
    1. تخفيف اللامينين إلى 0.5 ميكروغرام / مل في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
    2. أضف لامينيين مخفف إلى لوحة ستة جيدا في حجم 2.0 مل / جيدا.
    3. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إزالة محلول اللامينيين من الآبار.
  3. hiPSCs البذور في 2 مل من iPSC المتوسطة الصيانة(جدول المواد)على الآبار المغلفة في كثافة 3 × 104 خلايا / جيدا دون تجفيف السطح.
  4. الثقافة الفرعية hiPSCs.
    1. إعداد 0.5× إنزيمات تفكك الخلايا (جدول المواد) الحل.
      1. مزيج 10 ميكرولتر من 0.5 MEthylenediaminetetraacetic (EDTA) و 10 مل من برنامج تلفزيوني لجعل 0.5 مل EDTA / برنامج تلفزيوني.
      2. تمييع 10 مل من 1× إنزيمات تفكك الخلايا إلى 0.5× بإضافة 10 مل من 0.5 mM EDTA / PBS.
    2. استلهم الوسط المستهلك من الآبار.
    3. إضافة 2 مل / جيدا من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا، ثم تجاهل برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 800 μL من 0.5× إنزيمات تفكك الخلايا، واحتضان الخلايا لمدة 7 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن استخدام 0.05% التربسين-EDTA لفك الخلايا.
    5. قم بإزالة محلول إنزيمات فصّل الخلايا 0.5× بلطف.
    6. غسل الخلايا مع 2 مل PBS، ثم تجاهل برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: كن لطيف لأن الخلايا بسهولة فصل بعد إضافة حل إنزيمات تفكك الخلية.
    7. إضافة 1 مل من iPS صيانة المتوسطة(جدول المواد)التي تحتوي على 10 μM Y-27632.
      ملاحظة: إضافة Y-27632 يزيد معدل البقاء على قيد الحياة من hiPSCs.
    8. طرد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية، وجمعها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    9. حساب عدد الخلايا. ضبط كثافة الخلية إلى 1.5 × 104 خلايا / مل عن طريق إضافة iPS صيانة المتوسطة التي تحتوي على 10 μM Y-27632.
      ملاحظة: لا تستخدم الطرد المركزي لمنع تلف الخلايا.
    10. البذور 2 مل من خليط الخلية على لوحة ستة-جيدا المغلفة باللامينين (الكثافة النهائية: 3 × 104 خلايا / جيدا).
    11. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ CO2.
    12. استبدل الوسيطة الثقافية بـ iPS Medium بدون Y-27632 في الأيام 1 و4 و5 و6.
  5. ثقافة فرعية الخلايا في اليوم 7.
    ملاحظة: الثقافة الفرعية الخلايا باليوم 7 من أجل منع التمايز العشوائي من hiPSCs.

2. التعريفي من التمايز القلبي من مرض الهبس

  1. معطف 96- بئر لوحة ثقافة مع اللامينين (جدول المواد).
    1. تخفيف اللامينين إلى 1.675 ميكروغرام / مل مع برنامج تلفزيوني.
    2. أضف محلول اللامينيين المخفف إلى لوحة 96-well بحجم 0.1 مل/بئر.
    3. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. hiPSCs البذور على لوحة 96 جيدا في كثافة 3 × 104 خلايا / جيدا.
  3. تتكاثر hiPSCs في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ CO2.
    1. بعد يوم واحد، استبدال المتوسطة مع 200 ميكرولتر/ جيدا iPS متوسطة النمو(جدول المواد).
    2. قم بتغيير الوسط كل يوم لمدة 2-3 أيام إضافية حتى تصل الخلايا إلى 70% إلى 80% من الالتقاء.
  4. تطبيق وسائط التمايز.
    1. التعرق المتوسط المستهلكة واستبدالها ببطء مع 200 ميكرولتر / بئر من التمايز قبل الدافئة المتوسطة A (جدول المواد).
    2. ضع الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% CO2.
    3. بعد 48 ساعة، التعرق المتوسطة واستبدالها ببطء مع 200 ميكرولتر/بئر من التمايز قبل الدافئة المتوسطة B(جدول المواد).
    4. ضع الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% CO2.
      ملاحظة: من المهم للغاية أن يتم الاحتفاظ وسائط التمييز الطازجة. وسوف تفقد تدريجيا تأثير التمايز، وعادة في غضون أسبوعين. إذا لزم الأمر، aliquot المتوسطة الطازجة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  5. تطبيق القلبmyocyte صيانة المتوسطة.
    1. بعد 48 ساعة، وpirate المتوسطة واستبدال ببطء مع 200 ميكرولتر/جيدا من قبل تدفئة القلب والدفء وسط الصيانة(جدول المواد).
    2. ضع الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% CO2.
    3. استبدال التمايز cardiomyocyte المتوسطة كل يومين حتى اليوم 30.
      ملاحظة: من المهم أن يتم تعيين مدة تطبيق وسائل التمايز A و B بدقة إلى 48 ساعة لضمان تسلسل التعبير الدقيق للجينات المطلوبة للتمايز.

3- التعرض لنقص التروية

  1. حرمان الوسيلة الثقافية من المواد الغذائية والأكسجين.
    1. إعداد Dulbecco في المتوسط النسر المعدلة (DMEM) دون الجلوكوز والمصل.
    2. متوسط ثقافة التعرق من آبار لوحة 96 بئرا التي تحتوي على hiPS-CMs.
    3. إضافة المتوسط المحروم من المغذيات إلى الآبار بحجم 200 ميكرولتر/بئر.
  2. ضع لوحة الثقافة في حاضنة نقص الأكسجة (جدول المواد).
  3. ضخ غاز النيتروجين، والحفاظ على تركيز الأكسجين الداخلي في 2٪ CO2 التركيز في 5٪ لمدة 24 ساعة.
  4. المضي قدما في التحليلات المطلوبة: على سبيل المثال،قابلية الاستمرارية، تقييم قابلية العقد، أو تقييم الضرر الخلوي.

4. تقييم صلاحية الخلوي باستخدام MTT مقايسة

  1. استخدام مجموعة MTT فحص(جدول المواد)لتقييم كميا جدوى الخلايا.
    ملاحظة: يمكن استخدام التعرض لـ 1 mM بيروكسيد الهيدروجين في DMEM لمدة 1 ساعة لتلف الخلايا (التحكم الإيجابي). يمكن استخدام التعرض لـ 0 mM بيروكسيد الهيدروجين في DMEM للتحكم السلبي.
    1. إضافة 10 ميكرولتر من الكواشف MTT إلى الخلايا باستخدام الأنابيب المتكررة.
    2. مزيج بلطف لمدة دقيقة واحدة على شاكر المدارية.
    3. احتضان الخلايا لمدة 3-4 ح في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة. بعد الحضانة ، فإن formazan المنتجة في الخلايا تظهر كبلورات داكنة في الجزء السفلي من الآبار.
    4. بعد إزالة سوبرنات، حل بلورات غير قابلة للذوبان في 100 ميكرولتر من محلول سلفوكسيد ثنائي الميثيل (DMSO). هذا الحل سوف يحل بلورات formazan، وإنتاج حل الأرجواني.
      تنبيه: يمكن أن تهيج DMSO العينين والجهاز التنفسي والجلد. ارتداء القفازات المناسبة وحماية العين / الوجه.
    5. قياس امتصاص كل عينة مع قارئ microplate في طول موجة من 570 نانومتر.

5- تقييم قابلية التعاقد بين نظام iPS-CMs

  1. إذا لم يتم تثبيت، والحصول على الجسيمات صورة Velocimetry ImageJ المساعد11 في https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv وتثبيت.
  2. باستخدام المجهر النقيض مرحلة ، وتسجيل صور الفيديو من hiPS - CMs باستخدام 4× عدسة الهدف في ~ 20 لقطة في الثانية لمدة ~ 10 ثانية ، وحفظ "analyze.avi". لمقارنة قابلية التعاقد بين قبل وبعد نقص التروية، تأكد من تسجيل موقع الفائدة.
    ملاحظة: المجهر مع مرحلة آلية مفيد لاستهداف موقع الفائدة. يجب أن يكون ملف الفيلم بتنسيق .avi لتحليل لاحق. إذا لم يكن كذلك، قم بتحويل الفيلم إلى .avi.
  3. إنشاء بنية المجلد كما هو مبين في الشكل 1. مثال على "joblist.txt" هو المشار إليها في ملف تكميلي.
  4. تحليل منفصلة ثنائية الأبعاد حقول ناقلات من النزوح الخلوي.
    1. إطلاق فيجي (ImageJ) البرمجيات12، انتقل إلى الإضافات > وحدات الماكرو > تحرير وفتح "vector_analysis.ijm" (ملف التشفير التكميلي).
    2. انقر فوق تشغيل. سيتم إجراء التحليل تلقائياً.
      ملاحظة: يتم حساب المتجهات الإزاحة D(x, y) لكل 16 × 16 بكسل بين الإطار المرجعي (الإطار الأول) وكافة الإطارات اللاحقة (الإطارات 1 مقابل 2، 1 مقابل 3، 1 مقابل 4، إلخ). يتم حساب النتيجة لكل إطار وحفظها كـ "vec_x.txt"(x هو رقم إطار). يتم تعريف متجه أقصى إزاحة M (x، ص) لكل زوج (س، ص) كما يلي:
      figure-protocol-1
      حيث تمثل k رقم الإطار الذي | دك (س ص)| الحد الأقصى [| D2 (س، ص)|، | D3 (س، ص)|، ...، | Dn (x,y)|] و n يدل على الإطار الأخير يتم حفظ النتيجة كـ "Max_vector.txt". | M(x, y)| يمثل الحد الأقصى للنزوح الناجم عن انكماش القلب والتقلص عند نقطة التحليل (x, y). يتم حساب قيمة قابلية التعاقد C في الوحدات العشوائية كما يلي:
      figure-protocol-2
      يتم حفظ هذه القيمة في العمود 7، الصف 1 في "Max_vector.txt". C يمثل مجموع التشريد للجميع (x، ص). كلما كان الجزء الذي يكون فيه النزوح بسبب انكماش عضلة القلب كبيرًا ، كلما زادت قيمة C. يتم تراكب الحقل المتجه من أقصى إزاحة، M(x، ص)، مع صورة النقيض المرحلة من الإطار الأول ("Phase_contrast.png") وحفظها باسم "overlaid.png". وبما أن حجم متجه الإزاحة محسوباً استناداً إلى الإطار الأول من الفيديو، فمن الأفضل أن تكون الـ HIPS-CMs في فترة انبساطية مريحة للإطار الأول.

6. تقييم الأضرار الخلوية باستخدام عملية استئصال الخلايا

  1. تمييع 1 ملغ / مل حل من يوديد بروبديسيوم إلى 1:1000 في برنامج تلفزيوني.
  2. وصمة عار الخلايا المنفصلة مع يوديد بروبديسيوم.
    1. استلهم الوسط وضعه في أنبوب طرد مركزي مناسب الحجم.
    2. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة بعناية فائقة حتى لا تفقد الخلايا الرسوبية.
    3. احتضان الخلايا مع محلول يوديد البروديوم المخفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    4. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة بعناية فائقة حتى لا تفقد الخلايا الرسوبية.
    5. إعادة تشكيل الخلايا في ~ 1 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: من المهم جمع الخلايا العائمة المنفصلة من الوسط إلى تحديد مقدار التلف الخلوي بدقة.
  3. وصمة عار تعلق الخلايا مع يوديد بروبديسيوم.
    1. غسل الخلايا المرفقة مرتين مع برنامج تلفزيوني بلطف، ثم تجاهل برنامج تلفزيوني.
    2. احتضان الخلايا مع محلول يوديد البروديوم المخفف لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    3. التعرق محلول يوديد بروبديسيوم.
    4. فصل الخلايا باستخدام 0.25% التربسين. نقل حل الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي.
    5. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة بعناية فائقة حتى لا تفقد الخلايا الرسوبية.
    6. إعادة تشكيل الخلايا في ~ 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. اخلط الخلايا العائمة والمرفقة لتحليل فرز الخلايا المُنشّطة (FACS).
  5. تمرير حل الخلية من خلال مرشح 30 ميكرومتر.
    ملاحظة: تمرير الخلايا إلى مرشح مهم جداً لقياس FACS دقيقة.
  6. تحليل العينات باستخدام نظام FACS.

7- المناعة

  1. إصلاح نموذج الخلية.
    1. التعرق الوسط الثقافة.
    2. إضافة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يوصى بحل ما قبل شكلي طازج من أجل التثبيت الأمثل.
  2. Permeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 15 دقيقة، ثم تجاهل الكاشف.
  3. إضافة 3٪ البوم مصل البقر لمنع الخلايا لمدة 30 دقيقة.
  4. تطبيق الأجسام المضادة الأولية.
    1. تجاهل حل الألبومين المصل البقري من لوحة الثقافة.
    2. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 °C.
    3. إزالة حل الأجسام المضادة.
    4. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية.
    1. تجاهل حل PBS من لوحة الثقافة.
    2. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      ملاحظة: يتم استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة مضادة مضادة مضادة للقلب الأولية (TNNT2) في تخفيف 1:750 في 3٪ BSA. يتم تخفيف اليكسا فلور 488-مترافق الثانوية المضادة الماوس الماعز الأجسام المضادة إلى 1:1،000 في 3٪ BSA.
  6. تلطيخ إضافية من النواة والألياف actin.
    1. إزالة حل الأجسام المضادة.
    2. احتضان الخلايا في نواة تلطيخ الكاشف (جدول المواد) و actin تلطيخ كاشف (جدول المواد) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      ملاحظة: 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) أو Hoechst 33342 يمكن استخدامها في تلطيخ النووية.
    3. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  7. التقاط الصور الفلورية باستخدام المجهر المفلور.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الخلايا المتمايزة بنجاح تقلصاً عفوياً تحت المجهر(فيديو 1). عادة، 50٪ من الآبار تظهر انكماشا تلقائيا في < 20 يوما(الشكل التكميلي 1). يمكن استخدام بروتين علامة القلب (مثل cTnT) لتأكيد التمايز الناجح(الشكل 2).

عادة، تظهر الخلايا من المجموعة الإقفارية قابلية أقل في مقايسات MTT(الشكل 3A)و قابلية (الشكل 3E, F, الشكل التكميلي 2) من تلك من مجموعة التحكم في القواعد التنظيمية. أيضا، فإن نسبة الخلايا الإيجابية الإيوديد بروبدييوم أعلى في مجموعة الإقفاري مما هي عليه في مجموعة التحكم(الشكل 3B-D)،مما يشير إلى ارتفاع تلف الخلايا.

figure-results-1
الشكل 1: بنية المجلد لتحليل ناقلات النزوح باستخدام imageJ.
"joblist.txt" يصف مسار ملفات الأفلام لكل سطر. إذا كان هناك ثلاثة ملفات لتحليل، سيكون هناك ثلاثة مجلدات (movie1، movie2، و movie3)، التي يجب وضعها "analyze.avi" (الفيلم من الفائدة). بعد أن يتم إجراء التحليل بواسطة رمز "vector_analysis.ijm" ، سيتم إنشاء الملفات (المشار إليها باللون الأزرق) في كل مجلد الفيلم. يتم شرح المعلومات المخزنة في كل ملف بالتفصيل في النص الرئيسي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صورة تمثيلية لعلامة القلب تلطيخ.
التعبير عن القلب علامة بروتين القلب تروبونين تي (cTnT). الأزرق: 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI)، أحمر: أكتين، الأخضر: cTnT. Inset: تعبير مُرَقّر من cTnT، الذي يتوافق مع بنية الساركومير. شريط مقياس، 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من Wei et al.13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صور تمثيلية لقابلية الخلية للقابلية للقابلية للقابلية للقابلية للقابلية للقابلية للقابلية، وتقييم الأضرار الخلوية، و قابلية التقلص.
(أ) مقارنة الجدوى الخلوية (MTT المقايسة). ارتفاع امتصاص يشير إلى قابلية أعلى. n = 5 لكل حالة. (باء وجيم ونا' و (دال) تحليل تدفق الخلايا الجذعية من يوديد بروبديسيوم (PI) - الخلايا الملطخة. تظهر الخلايا الإقفارية كثافة التشتت الأمامي المُقلَّلة وزيادة الفلورية PI، مقارنةً بالتحكم. (د) النسبة المئوية للخلايا الملطخة ببي في تحليل قياس الخلايا المتدفقة. n = 3 لكل حالة. (هـ) تحليل قابلية التقلص بين نظام iPS وCMs باستخدام برنامج ImageJ. تشير المتجهات الحمراء والزرقاء إلى أكبر وأصغر تقلصات على التوالي. شريط مقياس، 100 ميكرومتر. (و) التحليل الكمي للانكماش بين نظام iPS وCM باستخدام الكود. n = 3 للتحكم و n = 8 لشرط الإقفاري. تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي في الوسط. بالنسبة للتحليل الإحصائي، تم إجراء اختبار t-t للطالب غير المدفوع بذيلين. *: p < 0.05, **: p < 0.01. p < 0.0001. ويستشهد بهذا الرقم من Wei etal. 13،يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تظهر الخلايا المتمايزة تقلصاً عفوياً تحت المجهر. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

الشكل التكميلي 1: تحليل كابلان-ماير للنسبة المئوية للعينات دون انكماش تلقائي. وأظهرت 50٪ من عينات iPS-CM انكماش في اليوم 20. في اليوم 30، أظهر 64.4٪ من العينات انكماشًا. n = 83. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: تقييم الإصابة بالتقلص القلبي. تم رسم قابلية التعاقد المقسّمة التي تم الحصول عليها بقسمة قابلية التعاقد C على عدد نقاط التحليل (س، ص) لمجموعات التحكم ونقص التروية قبل وبعد التعرض لـ 24 h hypoxia. n = 3 للتحكم و n = 8 لشرط الإقفاري. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: تقييم محتوى عضلة القلب. مناعة من بروتين علامة القلب على لوحة 96 جيدا. الأخضر: cTnT، الأزرق: DAPI. وقد حُسب معدل الخلايا المتمايزة على أنه 20.7 ± 9.6 في المائة عن طريق قسمة منطقة المنطقة الملطخة بالـ CTnT على منطقة المنطقة الملطخة بدبي. شريط المقياس = 1 مم. n = 4 لحالة التحكم. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

ملف ترميز تكميلي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالباً ما يستخدم الباحثون نماذج الحيوانات الصغيرة المختبرية لإجراء تجارب IHD. هنا، طورنا نموذج ثقافة الخلية من IHD الإنسان لإجراء مثل هذه التجارب.

المشكلة الرئيسية التي قد يواجهها المستخدم لهذا البروتوكول هو انخفاض معدل عضلة القلب المختلفة. وينبغي اتخاذ عدة خطوات مع الحرص الشديد على تحسين معدل التمايز الناجح: (أ) أن تكون لطيف عند الأنابيب لأن الخلايا بسهولة فصل بعد إضافة إنزيمات تفكك الخلايا الكاشفة، (ب) إضافة Y-27632 يزيد من معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا iPS عند فصل، و (ج) توقيت التغيرات المتوسطة في بداية التمايز يجب أن يكون بالضبط 48 ح بعيدا لضمان التعبير عن السيطرة على الجينات المشاركة في التمايز.

فيما يتعلق بروتينات المصفوفة خارج الخلية المستخدمة لطلاء سطح لوحة الثقافة، يمكن استخدام مواد أخرى من اللامينيين التي استخدمناها في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، تستخدم Matrigel14و15و الجيلاتين16و17 لثقافة الصيانة الخالية من التغذية من الهيكس. وفقا لهاراغوتشي وآخرون، تم تمييز hiPSCs المصنفة على Matrigel بنجاح في ورقة خلايا القلب18.

هناك عدد من الدراسات السابقة بشأن نماذج الثقافة لنمجة الأمراض باستخدام cardiomyocytes المستمدة من hiPSCs. وفيما يتعلق بالنمذجة من إصابة الإقفاريات reperfusion، التلاعب في البيئة الخلوية، مثل فرط بوتاسيوم الدم، والحمض، وتراكم اللاكتات، وقد أدخلت19. وتشمل الأساليب الأخرى بيليه الخلية لإعاقة انتشار الأكسجين20 وتثبيط الأيض باستخدام السيانيد21. في البروتوكول الحالي ، تم تحقيق إصابة الخلايا بطريقة بسيطة نسبيًا ، وهي حرمان 24 ساعة من الأكسجين والمواد المغذية. ومع ذلك ، ينبغي الحرص على النظر في العمليات الدقيقة فيزيائية المرضية من مرض القلب الإقفاري ، كما أن هناك اختلافات بين المرض في الجسم الحي ونموذج المرض للبروتوكول الحالي ، مثل وجود أو عدم وجود بيئة خلوية ثلاثية الأبعاد والدم.

فيما يتعلق بالجانب التكنولوجي لتقييم وظيفة cardiomyocyte، أبلغ Toepfer وآخرون خوارزمية MatLab مقرها لتحديد انكماش الساركومير والاسترخاء في hiPS-CMs22. سميث وآخرون ذكرت طريقة متقدمة من التحليل الكهربائي عالية الإنتاجية من الخلايا القابلة للإثارة المستمدة من HIPS-CMs، وذلك باستخدام متطورة nanotopographically منقوشة متعددة الأقطاب صفائف multielectrode23،24. وميزة بروتوكولنا هو أنه يتطلب فقط البرمجيات التقليدية والمواد الاستهلاكية، مثل برنامج imageJ ولوحات 96-جيدا.

فيما يتعلق بمستوى الأكسجين في القلب، يُعتقد أن ضغط الأكسجين في الأوردة التي تصل إلى القلب يبلغ 40 مم زئبق25. وفقا لMcDougal وآخرون، ويقدر ضغط الأكسجين خارج الخلية تحت نقص الأكسجة أن يكون < 12.8 مم زئبق26. عن طريق تطبيق طريقة جولات وآخرون27، يتم حساب ضغط الأكسجين في الوسط الثقافة (الملوحة: 35%)) تحت حالة نقص الأكسجين (2٪ الأوكسجين) في 37 درجة مئوية تعامل مع البروتوكول الحالي لتكون 14.9 مم زئبق، وهو أعلى من التقدير أعلاه. ومن المثير للاهتمام أن العاني وآخرون أفادوا أن هناك تدرج ضغط الأكسجين في الوسط الثقافي، ويتأثر ضغط الأكسجين بنوع الخلية وكثافة البذر والحجم المتوسط28. عادة، تركيز الأكسجين في الجزء السفلي من لوحة الثقافة حيث تتواجد الخلايا هو أدنى. ولذلك، فإن تأثير العمق في الوسط ثقافة زيادة خفض ضغط الأكسجين الفعال بالقرب من هيبس-CMs. من أجل إحداث ضرر كاف لـ hiPS-CMs باستخدام حالة نقص الأكسجين ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لعمق الخلايا المتوسطة وكثافة الخلايا.

لدينا نموذج HIPS-CM، وهو قريب جدا من الظروف الفسيولوجية من myocytes القلبية البشرية، يحاكي بشكل مفيد IHD الإنسان. وتشمل المناهج المستندة إلى نماذج الحيوان القضايا الأخلاقية والتقنية والأكاديمية. بشكل خاص، في نماذج vivo تتطلب تقنية متقدمة من الجراحة المجهرية لتحقيق بيانات قابلة للاستنساخ: على سبيل المثال، انسداد الفرع التنازلي الأمامي من الشريان التاجي الأيسر في القوارض3. يتغلب نموذج HIPS-CM الموصوف هنا على هذه الحواجز الحرجة ويوفر منصة مفيدة وملائمة وقابلة للتكرار لأمراض القلب والأوعية الدموية.

غير أنه ينبغي ملاحظة بعض القيود. وهناك فرق واضح بين أمراض القلب التي يسببها iPS والقلبية العادية هي عدم وجود تي-أنابيب29، ونحن لم تشمل العوامل الخلطية مثل تلف الأنسجة الناجمة عن الكريات البيض وتنشيط نظام مكمل في دراستنا. وعلاوة على ذلك, ينبغي تحسين معدل عضلة القلب المختلفة في هذا النموذج (20.7 ± 9.6%, الشكل التكميلي 3). يصف المنشور الأخير من قبل Halloin وآخرون طريقة قابلة للتطوير ومحددة كيميائيًا للحث على نقاء HIPS-CM من > 95٪ بواسطة محفزات مسار WNT الكيميائية دون اشتراط أي اختيار بواسطة علامات30. ومع ذلك، نموذجنا من IHD الإنسان بسيط نسبيا وقابلة للتطبيق سريريا (على سبيل المثال، فحص المخدرات باستخدام الخلايا iPS المستمدة من المريض). نموذجنا هو أيضا منصة فريدة من نوعها لزيادة توضيح الآليات الكامنة في IHDs.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة JSPS KAKENHI، صندوق تعزيز البحوث الدولية المشتركة (تعزيز البحوث الدولية المشتركة)، 17KK0168. الكتاب ممتنين الاعتراف مختبر البحوث المركزية ، كلية الطب جامعة أوكاياما لمساعدة FACS.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف تلطيخ الأكتين (كاشف ActinRed 555 ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةR37112
الأجسام المضادة للتروبونين Tللقلب Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةMA5-12960
وسيط صيانة خلايا عضلة القلب (مجموعة تمايز خلايا عضلة القلب PSC)Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةA2921201
إنزيمات تفكك الخلايا (TrypLE Select)ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةوسط
A (مجموعة تمايز خلايا عضلة القلب PSC)ثيرمو فيشر ساینتيف ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية
B (مجموعة تمايز خلايا عضلة القلب PSC) ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية
نظامFACS Aria IIIBD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
مجهر الفلورKEYENCE ، أوساكا ، اليابانBZ-X710
الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 488 الجسم المضاد الثانويThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةA28175
خلايا iPS البشريةRIKEN ، تسوكوبا ، اليابان201B7
حاضنة نقص الأكسجينسانيو ، أوساكا ، اليابانMCO-175M
وسيط نمو iPSC (أساسي 8 متوسط)Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةA1517001
وسيط صيانة iPSC (StemFit AK02N)Ajinomoto ، طوكيو ، اليابانRCAK02N
Laminin (iMatrix-511)Nippi ، طوكيو ، اليابانمجموعة فحص iMatrix-511
MTT (مجموعة فحص انتشار الخلايا MTT)شركةكايمان للكيماويات ، آن أربور ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية10009365
كاشف تلطيخ النواة (كاشف NucBlue Fixed Cell ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةR37606
Triton X-100Nacalai Tesque ، كيوتو ، اليابان35501-02
المضادة التمايز 12563011 وسط التمايز A2921201 A2921201

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94(2019).
  2. Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375(2019).
  3. Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
  4. Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
  5. Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
  6. Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
  7. Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
  8. Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590(2017).
  9. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  10. Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
  11. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
  14. Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
  15. Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
  16. Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
  17. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
  18. Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
  19. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  20. Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
  21. Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666(2010).
  22. Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
  23. Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
  24. Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
  25. Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
  26. McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
  27. Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
  28. Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269(2018).
  29. Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
  30. Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة