أستروقراط بلاط قشرة الدماغ بشكل موحد، مما يجعل تحليل مورفولوجيا معقدة صعبة على المستوى الخلوي. يستخدم البروتوكول المقدم هنا وضع علامات متعددة الألوان استنادًا إلى الإلكتروبورات الرحمية لخَرَد الخلايا الفلكية القشرية وتحليل حجمها ومورفولوجياها باستخدام خط أنابيب لتحليل الصور سهل الاستخدام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في Electroporation الرحمية من متعدد الجينوم التكامل اللون (السحر) علامات لفردية استروقراط الماوس القشرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتجاور الخلايا الفلكية بروتوبلازميك (PrA) الموجودة في قشرة الدماغ الماوس بإحكام، مما يشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد مستمرة على ما يبدو في مراحل البالغين. حتى الآن، لا يمكن لأي استراتيجية مناعة أن ينفرد بها وينقطع مورفولوجيا في الحيوانات الناضجة وعلى مدى تكوين الكورتيوجين. ينشأ PrA القشرية من النسل الموجود في اللاميوم الظهري ويمكن استهدافه بسهولة باستخدام في الإلكتروبور الرحمي لناقلات الدمج. يتم تقديم بروتوكول هنا لتسمية هذه الخلايا مع متعدد الجينوم التكامل لون (MAGIC) إستراتيجية علامات، والتي تعتمد على نقل piggyBac /Tol2 وإعادة الدمج Cre /للوكس للتعبير عن stochastically بروتينات الفلورسنت متميزة (الأزرق، السماوي، الأصفر، والأحمر) موجهة إلى مقصورات فرعية محددة. هذه الاستراتيجية رسم خرائط مصير متعددة الألوان تمكن من وضع علامة في الموقع القريبة السلف القشرية مع مجموعات من علامات اللون قبل بدء gliogenesis وتتبع أحفادهم، بما في ذلك الخلايا الفلكية، من مراحل الجنين إلى الكبار على مستوى الخلية الفردية. وضع العلامات شبه المتناثرة التي تحققت عن طريق ضبط تركيز ناقلات الكهربائية وتناقضات اللون المقدمة من متعدد الجينوم التكامل علامات اللون (علامات السحر أو MM) تمكين لفردية الفلكية وتفرد أراضيها والمورفولوجيا المعقدة على الرغم من الترتيب التشريحي الكثيفة. هنا هو سير العمل التجريبي الشامل بما في ذلك تفاصيل إجراء الكهربائي ، ومتعددة القنوات كومة الصور اقتناء عن طريق المجهر confocal ، وتجزئة ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر التي من شأنها أن تمكن المجرب لتقييم حجم PRA الفردية ومورفولوجيا. باختصار، electroporation من علامات MAGIC يوفر طريقة مريحة لتسمية كل فرد العديد من الخلايا الفلكية والحصول على الوصول إلى ميزاتها التشريحية في مراحل النمو المختلفة. هذه التقنية ستكون مفيدة لتحليل الخصائص المورفولوجية الفلكية القشرية في نماذج الماوس المختلفة دون اللجوء إلى الصلبان المعقدة مع خطوط مراسل المعدلة وراثيا.
المقدمة
تلعب الخلايا الفلكية العديد من الوظائف الحيوية في تنمية الدماغ وعلم وظائف الأعضاء1. بجانب دورهم في حاجز الدم في الدماغ حيث أنها تنظم امتصاص المواد الغذائية وتدفق الدم، وأنها تساهم بنشاط في تشكيل المشبك الوظيفية في حين تنتج neuromodulators التي يمكن أن تغير نشاط وسلوك الخلايا العصبية2. وعلاوة على ذلك، الخلل في علم الدراجات الفلكية يساهم في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية3. تعرض الخلايا الفلكية الموجودة في قشرة الدماغ مورفولوجيا متقنة تمكن من الاتصال المكثف بالعمليات العصبية. هذه الاتصالات، ضرورية لوظيفة الدائرة، وأيضا السيطرة على morphogenesis الفلكية وsionaptogenesis من خلال البروتينات الخلوية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية. وقد تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل مجلس تشارلز داروين التجارب الحيوانية الأخلاقية (CEEACD / N درجة 5).
1. إعداد البلازميدات الخالية من الـ endotoxin لعلامات MAGIC في الإلكتروبوريشن الرحمي
- التحول البكتيري
- على الجليد، ذوبان DH5 ألفا الخلايا المختصة المخزنة في -70 درجة مئوية.
- الاحماء لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين أو 50 ميكروغرام / مل kanamycin) في 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 ميكرولتر من 5-50 نانوغرام من علامات MAGIC plasmid الحمض النووي في 10 ميكرولتر من DH5 أل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Electroporation من علامات MAGIC في السلف القشرية الجنينية يسمح لوضع العلامات من الخلايا الفلكية من وقت مبكر إلى المراحل المتأخرة من تطور قشرة الدماغ(الشكل 1). تم العثور على هذه الخلايا الفلكية في جميع الطبقات القشرية في مراحل مختلفة بعد الولادة (P4، P7، P21) لأنها تفرقت على نطاق واسع في قشرة الدماغ بأكملها. تم تقييمها مع الصور البلاط confocal المكتسبة مع 20x 0.8 NA (أو أعلى NA) الهدف وتجميعها كما Z - المكدس إعادة البناء (الشكل 2). مكّن علامات MAGIC وضع العلامات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الأقطاب الكهربائية الرحمية (IUE) من علامات MAGIC في السلف القشرية(الشكل 1)تمكين وضع العلامات من الخلايا الفلكية في جميع أنحاء قشرة الدماغ بعد الولادة في مراحل مختلفة بعد الولادة (P4-P7-P21، الشكل 2). ومن المثير للاهتمام، فإن مرحلة IUE ليست حرجة، حيث أن الكهربة التي يتم تنفيذها من E13.5 إلى E15.5 تنتج أنماط وضع العلامات المشابهة فيما يتعلق بالجماهر القشرية14. ومع ذلك، يختلف موقع الخلايا العصبية الهرمية المسماة في البارينشيما القشرية مع .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر س. فوكيه ومرافق التصوير والحيوانات الأساسية التابعة لـ Institut de la Vision ومعهد علم الأعصاب دي مونبلييه (MRI وذاكرة الوصول العشوائي) على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل زمالات من Région Ile-de-France و Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer إلى S.C، ومن جامعة باريس - ساكلاي (مبادرات دكتوراليس متعددة التخصصات) إلى لوس أنجلوس، بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC-SG 336331، PI J. Valette) إلى E.H.، من قبل الوكالة الوطنية دي لا ريشيرتشي بموجب عقود ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses)، ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2)، ANR-10-INBS-04 (فرنسا BioImaging) ، بواسطة مؤسسة من أجل Médicale Recherche (المرجع DBI20141231328)، من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1.1 البكتيريا التحول< / قوي> | |||
| أمبيسيلين | يوروميدكس | EU0400-C | |
| DH5 ألفا الخلايا المختصة | فيشر ساينتيك | 11563117 | |
| صندوق الثلج | دوتشر | 139959 | |
| كاناميسين | سيجما | 60615 | |
| رطل أجار | سيجما | L2897 | |
| SOC وسط | فيشر ساينتيك | 11563117 | |
| طبق بتري معقم - 10 سم | ثيرمو فيشر | 150350 | |
| حمام مائي | VWR 462-0556H | ||
| <قوي>1.2 ثقافة البلازميد< / قوي> | |||
| 14 مل أنبوب ثقافة | دوتشر | 187262 | |
| زجاج erlenmeyer- 2 لتر | فيشر ساينتيك | 11383454 | |
| رطل متوسط | سيجما | L3522 | |
| <قوي>1.3 تحضير الحمض النووي البلازميد< / قوي> | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| <قوي>2.1 تحضير المحاليل < / قوي> | |||
| 26 جم × 1/2 إبرة | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 جم × 1/2 إبرة | Terumo | 8AN3013R1 | |
| أخضر سريع | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| حقنة بولي بروبلين أحادية الاستخدام ، 1 مل | Dutscher | 50002 | |
| <قوي>2.2 تحضير مادة الجراحة< / قوي > | |||
| ملقط أدسون - نمط ديباكي - 12.5 سم | FST | 11617-12 | |
| ملقط طرف مقوس - 10 سم | FST | 11071-10 | |
| معقم حبة زجاجية ستيري 250 | سيجما | Z378569 | |
| ماصة زجاجية دقيقة 1 مم قطر | FHC | 10-10-L | |
| ملقط Graefe - تيتانيوم 1 مم أطراف منحنى طفيف - 10 سم | FST | 11651-10 | |
| ملقط Graefe - تيتانيوم 1 مم أطراف مستقيمة - 10 سم | FST | 11650-10 | |
| مقص قزحية - مستقيم دقيق - 9 سم | FST | 14060-09 | |
| شريط مختبر | فيشر ساينتيك | 11730454 | |
| حاقن دقيق | INJECT + MATIC | بدون رقم | |
| حامل إبرة Olsen-Hegar - 12 سم | FST | 12002-12 | |
| الألياف الضوئية | VWR | 631-1806 | |
| ورق أبيض مطلي بالبلاستيك | مقتل | 700103 | |
| جل قطب Signagel | فري ميد | 15-60 | |
| بتري معقم - 35 مم | 056714 Dutscher | ||
| معقم ، حبة زجاجية جافة ، Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 تحضير الفأر الأنثوي الحامل < / قوي > | |||
| وسادة كحولية | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 مجم / مل | |
| ضغط | tRAFFIN | 70189 | |
| الكيتامين | ميريال | إيمالجين 1000 | |
| جل العين | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl: الفئران السويسرية | Janvier Labs | ||
| Vetadine ، محلول 10٪ | فيتوكينول | 4337400113B | |
| وسادة الاحترار | هارفارد | 72-0493 | |
| زيلازين | باير | رومبون 2٪ | |
| <قوي>3.2 التثقيب الكهربائي < / قوي > | |||
| خياطة قابلة للامتصاص حجم 4-0 45 سم خياطة 1-إبرة 19 مم طول 3/8 دائرة عكسية | نوفوسين | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel Sonidel | NEPA 21 | ||
| ماصات نقل معقمة (ملفوفة بشكل فردي) | Dutscher | 043202S | |
| ملاقط بأقطاب قرص بلاتينيوم 3 مم | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 حصاد الأنسجة وتقطيعها < / قوي > | |||
| 24 بئر صفيحة | فالكون | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U / P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X) ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم طلاء أظافر | فيشر Scientific | 11540486 | |
| EMS | 72180 | ||
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. التصوير متحد البؤر متعدد القنوات< / قوي > | |||
| 20X زيت NA 0.85 | أوليمبوس | ||
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | كارل زايس | LSM880 | |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد | البؤر أوليمبوس | FV1000 | |
| خطة أبوكرومات 20x / 0.8 M27 | كارل زايس | ||
| <قوي>6. تجزئة الحجم الإقليمي للخلايا النجمية | |||
| IMARIS 8.3 والإصدارات الأحدث | Bitplane | ||
| 7. تتبع الأشجار النجمية < / قوي > | |||
| الأبعاد مجموعة برامج التحليل بمساعدة التصور (Vaa3D) | HHMI - حرم أبحاث جانيليا / معهد ألين لعلوم |
المراجع
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit acti....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
