أستروقراط بلاط قشرة الدماغ بشكل موحد، مما يجعل تحليل مورفولوجيا معقدة صعبة على المستوى الخلوي. يستخدم البروتوكول المقدم هنا وضع علامات متعددة الألوان استنادًا إلى الإلكتروبورات الرحمية لخَرَد الخلايا الفلكية القشرية وتحليل حجمها ومورفولوجياها باستخدام خط أنابيب لتحليل الصور سهل الاستخدام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في Electroporation الرحمية من متعدد الجينوم التكامل اللون (السحر) علامات لفردية استروقراط الماوس القشرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتجاور الخلايا الفلكية بروتوبلازميك (PrA) الموجودة في قشرة الدماغ الماوس بإحكام، مما يشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد مستمرة على ما يبدو في مراحل البالغين. حتى الآن، لا يمكن لأي استراتيجية مناعة أن ينفرد بها وينقطع مورفولوجيا في الحيوانات الناضجة وعلى مدى تكوين الكورتيوجين. ينشأ PrA القشرية من النسل الموجود في اللاميوم الظهري ويمكن استهدافه بسهولة باستخدام في الإلكتروبور الرحمي لناقلات الدمج. يتم تقديم بروتوكول هنا لتسمية هذه الخلايا مع متعدد الجينوم التكامل لون (MAGIC) إستراتيجية علامات، والتي تعتمد على نقل piggyBac /Tol2 وإعادة الدمج Cre /للوكس للتعبير عن stochastically بروتينات الفلورسنت متميزة (الأزرق، السماوي، الأصفر، والأحمر) موجهة إلى مقصورات فرعية محددة. هذه الاستراتيجية رسم خرائط مصير متعددة الألوان تمكن من وضع علامة في الموقع القريبة السلف القشرية مع مجموعات من علامات اللون قبل بدء gliogenesis وتتبع أحفادهم، بما في ذلك الخلايا الفلكية، من مراحل الجنين إلى الكبار على مستوى الخلية الفردية. وضع العلامات شبه المتناثرة التي تحققت عن طريق ضبط تركيز ناقلات الكهربائية وتناقضات اللون المقدمة من متعدد الجينوم التكامل علامات اللون (علامات السحر أو MM) تمكين لفردية الفلكية وتفرد أراضيها والمورفولوجيا المعقدة على الرغم من الترتيب التشريحي الكثيفة. هنا هو سير العمل التجريبي الشامل بما في ذلك تفاصيل إجراء الكهربائي ، ومتعددة القنوات كومة الصور اقتناء عن طريق المجهر confocal ، وتجزئة ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر التي من شأنها أن تمكن المجرب لتقييم حجم PRA الفردية ومورفولوجيا. باختصار، electroporation من علامات MAGIC يوفر طريقة مريحة لتسمية كل فرد العديد من الخلايا الفلكية والحصول على الوصول إلى ميزاتها التشريحية في مراحل النمو المختلفة. هذه التقنية ستكون مفيدة لتحليل الخصائص المورفولوجية الفلكية القشرية في نماذج الماوس المختلفة دون اللجوء إلى الصلبان المعقدة مع خطوط مراسل المعدلة وراثيا.
المقدمة
تلعب الخلايا الفلكية العديد من الوظائف الحيوية في تنمية الدماغ وعلم وظائف الأعضاء1. بجانب دورهم في حاجز الدم في الدماغ حيث أنها تنظم امتصاص المواد الغذائية وتدفق الدم، وأنها تساهم بنشاط في تشكيل المشبك الوظيفية في حين تنتج neuromodulators التي يمكن أن تغير نشاط وسلوك الخلايا العصبية2. وعلاوة على ذلك، الخلل في علم الدراجات الفلكية يساهم في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية3. تعرض الخلايا الفلكية الموجودة في قشرة الدماغ مورفولوجيا متقنة تمكن من الاتصال المكثف بالعمليات العصبية. هذه الاتصالات، ضرورية لوظيفة الدائرة، وأيضا السيطرة على morphogenesis الفلكية وsionaptogenesis من خلال البروتينات الخلوية التصاق4. يحتاج علماء الأعصاب إلى أدوات مريحة وقوية للتحقيق في تطور الدراجات الفلكية وmorphogenesis في نماذجهم العصبية ذات الاهتمام. ومع ذلك ، نظرًا لقرب الخلايا الفلكية من جيرانها وتبليطها الثلاثي الأبعاد ، فمن الصعب إفراد الخلايا الفلكية القشرية وتقييم مورفولوجياها بشكل شامل باستخدام المؤشرات المناعية.
حاليا، اثنين من استراتيجيات الهندسة الوراثية الرئيسية تمكين وضع العلامات وفردية من الخلايا الفلكية القشرية في الموقع: تنشيط مراسل متفرق في خطوط الماوس المعدلة وراثيا أو تروس الجانسيس الجسدي باستخدام الكهربائي من plasmids مراسل. الاستراتيجية الأولى تعتمد على تربية خط الماوس مراسل floxed مع الفئران التعبير عن شكل غير قابل للانسج من إعادة الكومبيناز Cre activatinase تنشيطه على وجه التحديد في استربيات عند تسليم تاموكسيفين (على سبيل المثال، Aldh1l1-Creert25). وهناك عدة عيوب ترتبط بهذه الاستراتيجية. أولاً، تتطلب تربية الفئران المعدلة وراثياً عدداً كبيراً من الحيوانات، وعادة ما تكون هناك حاجة إلى عدة مقايسات لتحديد الجرعة المناسبة من تاموكسيفين لتوفير وضع العلامات المتناثرة الكافية للأوعية الفلكية القشرية. تحليل الأنماط الظاهرية الفلكية القشرية في نموذج الماوس الجينية من الفائدة تتطلب أكثر تربية واستهلاك الماوس. وعلاوة على ذلك, في حقن تاموكسيفين الرحمية ومن المعروف أن تتداخل مع الإتحاق, مما يجعل هذه الاستراتيجية من الصعب تطبيقها على دراسة المراحل الأولى من التنمية الفلكية. في الزهية الحمض النووي الكهربائي هو بديل تاموكسيفين خالية استراتيجية تعتمد على الحد الأدنى لعدد الحيوانات6. يتم إجراؤه إما في مراحل الجنين أو ما بعد الولادة ، ويتكون هذا النهج من حقن البلازميدات المراسل في البطينين الجانبي من القوارض تليها البقول الكهربائية التي تخلق المسام في غشاء الخلية ، وبالتالي السماح للحمض النووي لدخول الخلايا السلف بطانة البطين. في وقت لاحق، transgenes مراسل التي تحملها plasmids الكهربائية تتم معالجتها من قبل الآلات الخلية المستهدفة وأعرب عن7. وقد وصفت سابقا اثنين من أساليب الكهربائي لتسمية الماوس القشرية الفلكية: 1) بعد الولادة Astrocyte وضع العلامات عن طريق Electroporation (PALE), الذي يعتمد على الكهربائي من 1-2 واحد لون epismids مراسل epismids في المراحل المبكرة بعد الولادة4; 2) استراتيجية StarTrack على أساس في كهربائي الرحم (IUE) من متعددة لون واحد التكامل مراسل plasmids8،9،10. على الرغم من أن هذه التقنيات اثنين من تسمية بكفاءة PRA في قشرة الدماغ، كما أنها تقدم بعض القيود. في النسخة الأولية، وكلا الطريقتين تعتمد على البروتين حمضية الرجالية الرجالية (GFAP) المروج لدفع التعبير في الخلايا الفلكية، والتي قد تحيز وضع العلامات نحو غليا شعاعي وكذلك البزة وerscycytes التفاعلية التي تعبر عن GFAP بقوة أكثر من العادي يستريح PrA11،12. وفيما يتعلق PALE ، فإن العيوب الأخرى هي المرحلة المتأخرة من الكهربة ، والتي تمنع وضع العلامات على PrA المولودين في وقت مبكر (أو تلك التي تنشأ من أصول delaminating المبكرة) وتحليل المراحل المبكرة من تطوير الأستروجليا ، واستخدام ناقلات episomal التي تصبح مخففة من خلال الانقسامات المتعاقبة خلال الانتشار الهائل الذي يخضع له PrA خلال الأسبوع الأول بعد الولادة13،14. على النقيض من PALE ، يستند StarTrack على الكهربائي الجنيني لـ plasmids المراسل التكاملي الذي يسمح بتتبع مساهمة كل من السلف الجنينية وما بعد الولادة في PrA. مخطط StarTrack المحدثة التي تعتمد على المروج ubiquitin C (UbC-StarTrack) يحقق تعبير أوسع من المراسلين الفلورسنت في كل من النسب العصبي والزلي (شملت الفلكيات) من السلفالعصبية 15،16،17. غير أن تنفيذ هذا النهج في صيغته الحالية معقد، لأنه يعتمد على خليط من خليط من 12 من البلازميدات المتميزة التي تعبر عن ستة بروتينات فلورية مع استثارة جزئية وتداخل أطياف الانبعاثات.
المعروض هنا هو واضح في الرحم الكهربائية القائمة على طريقة وضع العلامات متعددة الألوان باستخدام التكاملية بناءات مراسل مدفوعة من قبل المروج قوية ونشطة على نطاق واسع ل single out astrocytes القشرية14. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير برنامج تحليل الصور سهل باستخدام كل من المرخص (مثل Imaris) والوصول المفتوح (Vaa3D18،19،20)لتحليل الصور لشريحة حجم المناطق الفلكية وarborization ، على التوالي. بالمقارنة مع الأساليب الموصوفة سابقا، تعتمد هذه الاستراتيجية فقط على 1-2 متعددة الألوان المتكاملة transgenes متعددة الجينوم المتكاملة علامات اللون (علامات MAGIC أوMM 21)موجهة إلى cytoplasmic و (اختياريا) مقصور الخلية النووية التي يحركها التعبير من قبل المروج CAG الاصطناعية تتألف من محسن فيروس الخلايا المضخمة للخلايا، الدجاج β-actin المروج، والأرنب β جلوبين لصق موقع متقبل22. وهذا يتيح وضع العلامات وتتبع الخلايا الفلكية القشرية، من مراحل الجنين إلى المراحل المتأخرة بعد الولادة، مستقلة عن التعبير GFAP14،23. ويتحمل كل من هذه FP الأربعة المتميزة التالية: eBFP، mTurquoise2/mCerulean، EYFP، وtdTomato/mCherry، والتي تظهر تداخل طيفي الحد الأدنى الذي يمكن التحايل عليه بسهولة مع 1) اقتناء قناة متسلسلة؛ 2) الأمثل الإثارة السلطة والحصول على جمع؛ و 3) مرشحات dichroic محددة لجمع النوافذ الضيقة FP الانبعاثات. استراتيجية MM يستخدم Cre /lox إعادة الكومبينيشن مع إعادة الكومبينيز (seCre) recombe seCre (seCre) للقيادة التعبير العشوائي من FP في السكان الخلوية. وهناك نسخة واحدة من FP MM تعبر عن FP بطريقة حصرية بعضها البعض، في حين أن عدة transgenes تؤدي إلى تركيبات FP، وخلق العشرات من الأشكال المتميزة. يتم دفع التكامل الجينومي من transgenes من قبل piggyBac (PB) أو نظام نقل Tol224,25,26. لذلك ، من خلال في الإلكتروبورات الرحمية ، فإن مجموعة أدوات MM و "الفسيفساء" المتعددة الألوان التي تولدها تمكن من وضع علامات متزامنة على أصول القشرية القشرية المجاورة المتعددة وتتبع هبوطها الدبقية ، بما في ذلك الخلايا الفلكية القشرية ، على مدى فترات طويلة. تناقضات اللون الناتجة عن التعبير عن FP متميزة تصريح ترسيم من كفاف PrA واستخراج المعلومات الرئيسية في وقت لاحق حول حجم أراضيها (باستخدام IMARIS) ومورفولوجيا معقدة (باستخدام Vaa3D). استراتيجية متعددة الألوان المعروضة بالتفصيل هنا هي طريقة مريحة وقوية تعطي الوصول السريع والسهل إلى سطح الفلكية القشرية ومورفولوجيا في الفئران من النوع البري في مراحل النمو المختلفة ، ويمكن التكيف بسهولة للتحقيق في الميزات التشريحية الفلكية في نماذج الماوس للأمراض العصبية دون استخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية. وقد تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل مجلس تشارلز داروين التجارب الحيوانية الأخلاقية (CEEACD / N درجة 5).
1. إعداد البلازميدات الخالية من الـ endotoxin لعلامات MAGIC في الإلكتروبوريشن الرحمي
- التحول البكتيري
- على الجليد، ذوبان DH5 ألفا الخلايا المختصة المخزنة في -70 درجة مئوية.
- الاحماء لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين أو 50 ميكروغرام / مل kanamycin) في 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 ميكرولتر من 5-50 نانوغرام من علامات MAGIC plasmid الحمض النووي في 10 ميكرولتر من DH5 ألفا الخلايا المختصة المذابة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة دون خلط.
- لتحويل صدمة الحرارة، ضع aliquot في حمام مائي 42 °C لمدة 45 ث، ثم ضعه على الجليد فوراً وانتظر 3-5 دقائق.
- في ظل ظروف معقمة، إضافة 230 ميكرولتر من SOC المتوسطة واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- نشر محتوى aliquot على لوحة أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- ثقافة بلاسميد
- في صباح اليوم التالي، في ظروف معقمة، والتقاط مستعمرة من لوحة أجار ووضعها في أنبوب 14 مل تحتوي على 2 مل من LB المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة. دعها تحتضن اليوم عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز عند 300 دورة في الدقيقة.
- في نهاية اليوم، بذور 300 مل من LB مع المضادات الحيوية باستخدام ثقافة بداية 2 مل من الخطوة 1.2.1 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 300 دورة في الدقيقة.
- Plasmid إعداد الحمض النووي
- في صباح اليوم التالي المضي قدما في تنقية علامات MAGIC plasmid الحمض النووي (أي، PB-CAG-Cytbow و Tol2-CAG-Nucbow، فضلا عن PLAsmids CAG يحركها التعبير عن PB و Tol2 transposases و الكريبتيناز) باستخدام مجموعة maxiprep خالية من endotoxin بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- Elute الحمض النووي في 200 ميكرولتر من الماء المعقم وتقدير تركيزها باستخدام مقياس الطيف قبل التخزين في -20 درجة مئوية.
2. التحضير لعلامات السحر في كهربائي الرحم (MM IUE)
- إعداد الحل
- دافئ 30 مل من 0.9٪ محلول ملحي عند 37 درجة مئوية في حمام مائي و يبقيه دافئا خلال مدة الجراحة بأكملها.
- إعداد مزيج plasmid تحتوي على PB-CAG-Cytbow و Tol2-CAG-Nucbow (التركيز النهائي، 0.8 ميكروغرام/ميكرولتر لكل منه)، PB و Tol2 transposases (التركيز النهائي، 0.4 ميكروغرام/ميكرولتر لكل منه)، CAG-seCre (التركيز النهائي، 0.16 ميكروغرام/ميكرولتر)، و 0.01٪ صبغة خضراء سريعة في PBS دون Ca2+ و Mg2+.
ملاحظة: لأغراض إعادة البناء التشريحية الفلكية، قد يتم حذف بناء Tol2-CAG-Nucbow. ومع ذلك، هذا البلازميد مفيد للتمييز بين doublets من الخلايا الفلكية المتجاورة بشكل وثيق وعند استخدام علامات سحرية للتحقيق في العلاقات التخفي بين الخلايا الفلكية14. - إعداد محلول التخدير الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من الكيتامين (100 ملغ /مل) و 100 ميكرولتر من الإكسيلازين (20 ملغ/مل) المخفف في 2 مل من محلول ملحي.
- إعداد المحلول المسكن عن طريق تخفيف 0.3 ملغ / مل بوبرينورفين الأسهم حل 1:10 في محلول ملحي.
- إعداد مواد الجراحة
- تعقيم الأدوات الجراحية (انظر جدول المواد)في درجة حرارة عالية في خرزة الزجاج أو ما يعادلها.
- ضع قطرة من جل القطب في طبق 35 ملم.
- إدراج micropipette في حامل ناخن microinctor، وكسر غيض من micropipette، والتطلع إلى حل الحمض النووي.
- ضع قطرة 1 ميكرولتر من محلول Fast Green (0.01٪) في غطاء طبق 3 سم ، واستخدامه كمرجع ، قم بضبط قطر طرف micropipette عن طريق كسر طرفها مع ملقط غرامة. ضبط معلمة الضغط بحيث يتم إنتاج قطرات الحجم المكافئ من قبل الحقن المجهري، مما يتيح تسليم ما يقرب من 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي لكل حقنة.
- إعداد الماوس الإناث الحوامل
- وزن RjOrl: السويسري الماوس الحوامل.
- إجراء حقن داخل الصفاق مع 12.5 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم (BW) من محلول التخدير. انتظر لمدة 5 دقائق وتأكد من أن الماوس نائم عن طريق قرص إصبع قدمه.
- مرة واحدة الحيوان لا يستجيب لقرصة، وحقنها تحت الجلد مع 1.6 μL / ز BW من محلول مسكن.
- إضافة قطرة من هلام العين على كل عين لمنع التجفيف أثناء الجراحة ووضع بطن الحيوان حتى على وسادة الاحترار.
- حلق بطنه بلطف، وتنظيفه بلوحة مبللة باليود، وطهر المنطقة الحليقة بمنصة كحولية.
- قم بترتيب حقل تشغيل من خلال وضع كمادات معقمة حول المنطقة المحلاة، والمنظفة، والمطهرة.
3. في الرحم الكهربائي (IUE)
- الحقن داخل الغدد الـدّين
- قطع شق عمودي 2 سم على طول خط الوسط بدءا من الجزء السفلي من البطن، من خلال الجلد، ومن ثم من خلال العضلات الكامنة. فضح قرون الرحم عن طريق التلاعب بلطف أكياس الجنين وتقييم موقع عنق الرحم وعدد من أكياس الجنين على كل جانب من عنق الرحم.
- توجيه الدماغ من الجنين E15.5 أن تكون كهربائيا من أجل رؤية البريغما، معترف بها بسهولة كما يطابق موقعه مع تقاطع الأوعية الدموية الرئيسية الثلاثة التي تعمل على طول الشقوق الدماغية.
- تخيل خط الظاهري بين bregma (مرئية من خلال الجمجمة) والعين; إدخال micropipette بين الخط الافتراضي والشقوق الطولية، ثم اضغط على دواسة القدم حاقن لتقديم 1 ميكرولتر من حل الحمض النووي في البطين الجانبي من نصف الكرة الأرضية المستهدفة.
ملاحظة: عندما يتم حقنه في الموقع المناسب، يظهر البطين الجانبي الملئ باللون الأزرق، مما يشير إلى أنه قد تم ملئه بمحلول الحمض النووي.
- الكهرباء
- تطبيق الأقطاب الكهربائية (انظر جدول المواد)، مغموسة سابقا في هلام القطب، على جانبي الجنين حقن مع الأنود تغطي نصف الكرة الأرضية المحقونة. اضغط على دواسة القدم من electroporator لتقديم سلسلة من أربع نبضات مللي 50 من 35 V، كل فصلها من قبل فاصل 950 مللي ثانية.
- خفف الجنين بمحلول ملحي دافئ.
ملاحظة: يجب أن تبقى الأجنة رطبة باستخدام محلول ملحي دافئ خلال العملية الجراحية بأكملها ويجب ألا يجف الرحم. - كرر الخطوات 3.1.2-3.2.2 لكل جنين.
- مرة واحدة وقد تم تحويل جميع الأجنة المستهدفة الكهربائي، استبدال قرون الرحم في البطن عن طريق دفع بلطف لهم ملقط العودة إلى وضعها الأصلي. املأ تجويف البطن بمحلول ملحي دافئ لمنع الرحم من الجفاف أثناء إجراء الغرز.
- أولا إغلاق عضلة البطن مع خياطة امتصاص مستمر، ومن ثم الجلد مع غرز فردية متعددة (~ 10) باستخدام 4-0 خياطة.
- وضع الحيوان في قفص نظيف، مستلقيا على جانبه على منشفة ورقية نظيفة وتحويل الحيوان إلى الجانب الآخر كل 5-10 دقيقة حتى يستيقظ ويبدأ يتحرك من تلقاء نفسه.
- تقييم حالة الحيوان في اليوم التالي، خاصة إذا كان قد تم صنع عش.
ملاحظة: لا يلزم علاج ما بعد الجراحة. في حالة عدم وجود عش ، أي علامة على الألم (على سبيل المثال ، السجود ، الفراء الأشعث) ، و / أو النزيف الشديد ، يجب أن يكون الحيوان القتل الرحيم دون تأخير.
4- حصاد الأنسجة والقطع
- جمع الأنسجة
- حقن الفينوباربيتال (100 ملغم/ كغ من BW) intraperitoneally للتخدير الطرفي في وقت الحصاد المطلوب. وفي هذه الحالة، كانت أوقات الحصاد في الأيام التالية للولادة (P) P4 و P7 و P21.
- قم بإجراء عملية الضخ داخل القلب باستخدام محلول بارد قائم على شبه شكلي مسبق.
- تشريح خارج الدماغ ووضعها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حل القائم على شبه شكلي ل postfixation.
- علم الأنسجة
- في صباح اليوم التالي شطف الدماغ 3x لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1x.
- تضمين الدماغ في 3٪ agarose حل في 1X PBS.
- قطع 80 ميكرومتر باستخدام microtome يهتز شفرة.
- جمع أقسام في لوحة 24 جيدا شغلها مسبقا مع 1X برنامج تلفزيوني.
- تحميل المقاطع في المتوسط المتصاعد (انظر جدول المواد)بين الشريحة وأغطية. حافظ على الشرائح المثبتة عند -20 درجة مئوية للحفاظ على البروتين الفلورسنت الأمثل والتخزين على المدى الطويل.
5. التصوير confocal متعددة القنوات
- إعدادات المجهر
- إعداد تكوين المجهر confocal لإثارة بشكل منفصل mCerulean /mTurquoise2، EYFP، tdTomato/ mCherry باستخدام خطوط الليزر 440، 515، و 559 نانومتر، على التوالي.
- استخدم هدف 20x 0.8 NA (أو أعلى NA) وضبط XY أخذ العينات وحجم الخطوة Z وفقا لمعايير Nyquist.
ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها بدقة أعلى (مثل هدف زيت 60x 1.4 NA) وخوارزميات deconvolution ستمكن من إعادة بناء التفاصيل الدقيقة لآربورات الأستروسيات. ومع ذلك، ينبغي أن تضع في اعتبارك المجرب أن العمليات الفلكية أرقى قد لا يتم حلها عن طريق التصوير البصري التقليدي.
- الحصول على الصور
- العثور على ألمع الخلايا الفلكية في المنطقة الكهربائية.
- لأن الخلايا المسماة الموجودة بالقرب من السطح قد تظهر أكثر إشراقا من تلك أعمق في شريحة، وضبط إعدادات الامتلاك على الخلايا السطحية لتجنب تشبع الصور.
- اضبط إعدادات الامتلاك بشكل منفصل لكل من القنوات الثلاث مع التأكد من تجنب تشبع البكسل باستخدام HiLo LUT، والتي تعرض قيم الصفر كقيم زرقاء وأقصى قيم بكسل كأحمر.
ملاحظة: يجب أن تعرض صورة متوازنة بشكل مناسب فقط بضعة بكسلات زرقاء و غير حمراء تقريباً. - الحصول على البلاط 1024 × 1024 بكسل Z - مداخن باستخدام المرحلة الآلية من المجهر ، مع تداخل 10 ٪ بين المداخن المجاورة لتمكين إعادة بناء الفسيفساء في وقت لاحق من المنطقة الكهربائية أو منطقة الاهتمام.
6 - تجزئة الحجم الإقليمي للسيّد الفلكي
ملاحظة: يتم تنفيذ هذا باستخدام برنامج تجاري (على سبيل المثال، IMARIS).
-
إعداد مجموعة البيانات
- احصد الخلايا الفلكية المسماة في إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد (250 × 250 بكسل) عن طريق تحديد الخلايا المحاطة بالكامل في قسم الأنسجة المصورة.
ملاحظة: من الممكن أيضاً العمل مباشرة على وحدات التخزين الكبيرة إذا كان الكمبيوتر المستخدم يمكن التعامل معها. - انقر على زر السطح الأزرق في شريط الأدوات الكائن من طريقة العرض تجاوز لإنشاء سطح جديد لكل استروبايت.
- للحصول على تباين مرئي أفضل، قم أولاً بضبط قيم تباين الألوان الدنيا والأقصى بالنقر على تحرير | إظهار خيار ضبط العرض وسحب المقابض. إذا لزم الأمر، قم بتغيير لون القناة بالنقر مباشرة على اسم القناة في إطار تعديل العرض لتحديد لون جديد.
ملاحظة: يفضل دائماً العمل مع نفس اللون عرض لمنع التحيز البصرية. - انقر على | التحرير خصائص الصورة للإشارة إلى حجم voxel في ميكرومترات يدويا. إذا كان حجم voxel غير دقيق، فإن حسابات الحجم تكون غير صحيحة.
- حفظ الإعدادات الجديدة.
- احصد الخلايا الفلكية المسماة في إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد (250 × 250 بكسل) عن طريق تحديد الخلايا المحاطة بالكامل في قسم الأنسجة المصورة.
-
تجزئة السطح
- استخدم الرمز الأزرق لإدخال سطح. سيظهر رمز سطح ومربع في قائمة المشهد. يسمح مربع وحدة التخزين برؤية/إخفاء مجموعة البيانات.
- حدد خط السطح وانقر على تخطي إنشاء التلقائي | تحرير يدوياً.
- انقر على | كونتور الرؤية ثم انقر فوق بلا. ثم انتقل إلى عرض تحديد وانقر على زر السحب.
- انقر على وضع لتحديد وضع الرسم.
- استخدام أداة الرسم Isoline semiautomated سريعة وفعالة. تعريف المخطط التفصيلي للخلية عن طريق تحريك مؤشر الماوس عليه. إذا لم تطابق معاينة isoline المخطط التفصيلي لـ astrocyte، اضبط موضع مؤشر الماوس. للتحقق من صحة المعاينة ، انقر على اليسار على التحديد. لتصحيح الأخطاء المحتملة، استخدم نافذة اللوحة لحذف محيط الطائرة Z الحالي أو اضغط على Ctrl + Z.
- استخدام | الشريحة وضع للتنقل من خلال طائرات Z، والانتقال إلى الطائرة التالية عن طريق تغيير رقم الطائرة Z وبدء كفاف جديد. تبدأ بشكل تفضيلي من منتصف الخلية ومن ثم الانتقال إلى الأطراف.
- عندما تم رسم ملامح في جميع ال Z-الطائرات التي تحتوي على astrocyte، انقر على إنشاء سطح. قبل إنشاء سطح، تحقق من أن كافة المكونات متصلة. إذا لم يكن الأمر كذلك، حدد أكبر أو قم بتوصيلها قبل تصدير بيانات وحدة التخزين.
- تحقق من البيانات الكمية المعروضة في لوحة البيانات وإحصائيات التصدير بتنسيق جداول البيانات، مما يوفر قيمة وحدة التخزين.
- حفظ السطح تحت اسم جديد للوصول إليه لاحقاً.
7- تتبع التربيع الفلكي
ملاحظة: يتم ذلك باستخدام برنامج الوصول المفتوح Vaa3D.
- إعداد مجموعة البيانات
- قم بتحميل رصة الصور وابحث عن الخلايا الفلكية المعزولة أو الخلايا الفلكية القريبة التي تعرض ألوانًا مميزة.
ملاحظة: يمكن تحسين قرار إعادة الإعمار عن طريق زيادة الهدف NA وأخذ العينات. في نهاية المطاف ، ومع ذلك ، بسبب الحد من قرار المجهر confocal ، فإن أرقى العمليات الفلكية لا يمكن تتبعها بدقة. وينبغي توخي الحذر لتجنب تجاوز حجم الصور التي تم الحصول عليها. - باستخدام فيجي، المحاصيل 250 × 250 بكسل كومة صورة حول كل استروسيتي.
- بما أن تتبع Vaa3D يتم تنفيذه على لون واحد فقط، حدد قناة واحدة وقم بإلغاء تنشيط القنوات الأخرى.
- قم بتحويل الصورة إلى RGB واحفظها بتنسيق .tiff.
- قم بتحميل رصة الصور وابحث عن الخلايا الفلكية المعزولة أو الخلايا الفلكية القريبة التي تعرض ألوانًا مميزة.
- تتبع أربور
- افتح صورة RGB في Vaa3D. الانتقال إلى | الصورة | البيانات الهندسة ثم إعادة اختمة الصورة، وضبط قيم حجم X / Y و Z voxel.
ملاحظة: في حين إعادة بناء أربورات الفلكية، ينبغي توخي الحذر لعدم تتبع التفاصيل الدقيقة من القرار المقدمة من الصور. - افتح نافذة ثلاثية الأبعاد بالنقر على تصور | عارض ثلاثي الأبعاد للصورة بأكملها. انقر بزر الماوس الأيمن فوق صورة ثلاثية الأبعاد واختر نقرة 1 بزر الماوس الأيمن لتحديد العلامة. أشر إلى المؤشر في مركز أستروسيتي ثم انقر بزر الماوس الأيمن لتعيين علامة.
ملاحظة: انقر فوق Escape للوصول إلى طريقة العرض ثلاثية الأبعاد مرة أخرى. - انتقل إلى | تتبع ثلاثي الأبعاد | المتقدم Vaa3D-Neuron2-السيارات التتبع.
- في النافذة المفتوحة حديثًا، حدد القناة التي تريد تطبيق المكون الإضافي عليها.
- اختر عتبة خلفية (غالباً ما تكون بين 30 و90). تطويع هذه القيمة لكل استروبايت إذا لزم الأمر.
- قم بإلغاء تحديد نصف القطر من 2D والاحتفاظ بعينة تلقائية لأسفل وإعادة تشكيل تلقائي تم فحصها.
- تعيين cnn_type في 3، length_thresh في 1، SR_ratio في 0.1.
- بعد النقر فوق موافق، تأكد من أن المكونات في تلقائيا يولد ملفين استنادا إلى الاسم الأصلي. سيتم إضافة لاحقة -ini.swc و-coordinateX-coordinateY-coordinateYZ-app2.swc. إضافة تسمية مميزة يدوياً إلى ملفات الأسماء هذه لكي لا الكتابة فوقها أثناء الاستمرار في تشغيل المكون الإضافي.
- فتح إدارة الكائن، انتقل إلى | العصبية خط هيكل، حدد astrocyte تتبع ، انقر على وضع العرض، وحدد دائما وضع الخط.
- العودة إلى النافذة 3D، حيث يظهر هيكل عظمي من الفلكية.
ملاحظة: إذا لم تتطابق التجزئة والإشارات، كرر الخطوات من 7.2.3 إلى 7.2.10 ثم قم بضبط العتبة حتى يتم ذلك. تأكد من إعادة إدخال المعلمات الأخرى كما يتم إعادة تعيين عند إعادة تشغيل المكون الإضافي. - انقر بزر الماوس الأيمن على الهيكل العظمي وحدد الخيار الأول الخلايا العصبية | الخط # 1... APP2_Tracing الوصول إلى القياسات الكمية التي ستظهر على سطح نافذة جديدة| التعليق التوضيحي للكائن.
ملاحظة: نظراً لدقة محدودة من المجهر الخفيفة، والقياسات المعروضة تحت العناصر المدرجة عدد الفروع وعدد التشعبات توفر فقط تقدير تقريبي من تعقيد arbor astrocyte.
- افتح صورة RGB في Vaa3D. الانتقال إلى | الصورة | البيانات الهندسة ثم إعادة اختمة الصورة، وضبط قيم حجم X / Y و Z voxel.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Electroporation من علامات MAGIC في السلف القشرية الجنينية يسمح لوضع العلامات من الخلايا الفلكية من وقت مبكر إلى المراحل المتأخرة من تطور قشرة الدماغ(الشكل 1). تم العثور على هذه الخلايا الفلكية في جميع الطبقات القشرية في مراحل مختلفة بعد الولادة (P4، P7، P21) لأنها تفرقت على نطاق واسع في قشرة الدماغ بأكملها. تم تقييمها مع الصور البلاط confocal المكتسبة مع 20x 0.8 NA (أو أعلى NA) الهدف وتجميعها كما Z - المكدس إعادة البناء (الشكل 2). مكّن علامات MAGIC وضع العلامات ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الأقطاب الكهربائية الرحمية (IUE) من علامات MAGIC في السلف القشرية(الشكل 1)تمكين وضع العلامات من الخلايا الفلكية في جميع أنحاء قشرة الدماغ بعد الولادة في مراحل مختلفة بعد الولادة (P4-P7-P21، الشكل 2). ومن المثير للاهتمام، فإن مرحلة IUE ليست حرجة، حيث أن الكهربة التي يتم تنفيذها من E13.5 إلى E15.5 تنتج أنماط وضع العلامات المشابهة فيما يتعلق بالجماهر القشرية14. ومع ذلك، يختلف موقع الخلايا العصبية الهرمية المسماة في البارينشيما القشرية مع ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر س. فوكيه ومرافق التصوير والحيوانات الأساسية التابعة لـ Institut de la Vision ومعهد علم الأعصاب دي مونبلييه (MRI وذاكرة الوصول العشوائي) على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل زمالات من Région Ile-de-France و Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer إلى S.C، ومن جامعة باريس - ساكلاي (مبادرات دكتوراليس متعددة التخصصات) إلى لوس أنجلوس، بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC-SG 336331، PI J. Valette) إلى E.H.، من قبل الوكالة الوطنية دي لا ريشيرتشي بموجب عقود ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses)، ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2)، ANR-10-INBS-04 (فرنسا BioImaging) ، بواسطة مؤسسة من أجل Médicale Recherche (المرجع DBI20141231328)، من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG 649117، PI J. Livet) وبرنامج ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1.1 البكتيريا التحول< / قوي> | |||
| أمبيسيلين | يوروميدكس | EU0400-C | |
| DH5 ألفا الخلايا المختصة | فيشر ساينتيك | 11563117 | |
| صندوق الثلج | دوتشر | 139959 | |
| كاناميسين | سيجما | 60615 | |
| رطل أجار | سيجما | L2897 | |
| SOC وسط | فيشر ساينتيك | 11563117 | |
| طبق بتري معقم - 10 سم | ثيرمو فيشر | 150350 | |
| حمام مائي | VWR 462-0556H | ||
| <قوي>1.2 ثقافة البلازميد< / قوي> | |||
| 14 مل أنبوب ثقافة | دوتشر | 187262 | |
| زجاج erlenmeyer- 2 لتر | فيشر ساينتيك | 11383454 | |
| رطل متوسط | سيجما | L3522 | |
| <قوي>1.3 تحضير الحمض النووي البلازميد< / قوي> | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| <قوي>2.1 تحضير المحاليل < / قوي> | |||
| 26 جم × 1/2 إبرة | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 جم × 1/2 إبرة | Terumo | 8AN3013R1 | |
| أخضر سريع | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| حقنة بولي بروبلين أحادية الاستخدام ، 1 مل | Dutscher | 50002 | |
| <قوي>2.2 تحضير مادة الجراحة< / قوي > | |||
| ملقط أدسون - نمط ديباكي - 12.5 سم | FST | 11617-12 | |
| ملقط طرف مقوس - 10 سم | FST | 11071-10 | |
| معقم حبة زجاجية ستيري 250 | سيجما | Z378569 | |
| ماصة زجاجية دقيقة 1 مم قطر | FHC | 10-10-L | |
| ملقط Graefe - تيتانيوم 1 مم أطراف منحنى طفيف - 10 سم | FST | 11651-10 | |
| ملقط Graefe - تيتانيوم 1 مم أطراف مستقيمة - 10 سم | FST | 11650-10 | |
| مقص قزحية - مستقيم دقيق - 9 سم | FST | 14060-09 | |
| شريط مختبر | فيشر ساينتيك | 11730454 | |
| حاقن دقيق | INJECT + MATIC | بدون رقم | |
| حامل إبرة Olsen-Hegar - 12 سم | FST | 12002-12 | |
| الألياف الضوئية | VWR | 631-1806 | |
| ورق أبيض مطلي بالبلاستيك | مقتل | 700103 | |
| جل قطب Signagel | فري ميد | 15-60 | |
| بتري معقم - 35 مم | 056714 Dutscher | ||
| معقم ، حبة زجاجية جافة ، Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 تحضير الفأر الأنثوي الحامل < / قوي > | |||
| وسادة كحولية | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 مجم / مل | |
| ضغط | tRAFFIN | 70189 | |
| الكيتامين | ميريال | إيمالجين 1000 | |
| جل العين | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl: الفئران السويسرية | Janvier Labs | ||
| Vetadine ، محلول 10٪ | فيتوكينول | 4337400113B | |
| وسادة الاحترار | هارفارد | 72-0493 | |
| زيلازين | باير | رومبون 2٪ | |
| <قوي>3.2 التثقيب الكهربائي < / قوي > | |||
| خياطة قابلة للامتصاص حجم 4-0 45 سم خياطة 1-إبرة 19 مم طول 3/8 دائرة عكسية | نوفوسين | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel Sonidel | NEPA 21 | ||
| ماصات نقل معقمة (ملفوفة بشكل فردي) | Dutscher | 043202S | |
| ملاقط بأقطاب قرص بلاتينيوم 3 مم | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 حصاد الأنسجة وتقطيعها < / قوي > | |||
| 24 بئر صفيحة | فالكون | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U / P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X) ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم طلاء أظافر | فيشر Scientific | 11540486 | |
| EMS | 72180 | ||
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. التصوير متحد البؤر متعدد القنوات< / قوي > | |||
| 20X زيت NA 0.85 | أوليمبوس | ||
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | كارل زايس | LSM880 | |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد | البؤر أوليمبوس | FV1000 | |
| خطة أبوكرومات 20x / 0.8 M27 | كارل زايس | ||
| <قوي>6. تجزئة الحجم الإقليمي للخلايا النجمية | |||
| IMARIS 8.3 والإصدارات الأحدث | Bitplane | ||
| 7. تتبع الأشجار النجمية < / قوي > | |||
| الأبعاد مجموعة برامج التحليل بمساعدة التصور (Vaa3D) | HHMI - حرم أبحاث جانيليا / معهد ألين لعلوم |
المراجع
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039(2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697(2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896(2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87(2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342(2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662(2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163(2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
