يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نهج Benchtop لموقع محدد فتح حاجز الدم الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة في نموذج الفئران

4.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61113

⸱

يونيو 13, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن تركز الموجات فوق الصوتية مع وكلاء microbubble فتح حاجز الدم في الدماغ بشكل مركز وعابر. وقد استخدمت هذه التقنية لتقديم مجموعة واسعة من العوامل عبر حاجز الدم في الدماغ. توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل للتسليم المترجمة إلى الدماغ القوارض مع أو بدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي.

الملخص

جراحة تكسيف هو المعيار الذهبي للمخدرات المحلية وتسليم الجينات إلى الدماغ القوارض. هذه التقنية لديها العديد من المزايا على التسليم النظامي بما في ذلك التعريب الدقيق إلى منطقة الدماغ المستهدفة والحد من الآثار الجانبية الهدف. ومع ذلك، فإن جراحة تكسينية مجسمة هي شديدة التوغل مما يحد من فعاليتها الترجمية، وتتطلب أوقات تعافي طويلة، وتوفر تحديات عند استهداف مناطق متعددة في الدماغ. يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) بالاقتران مع الزبقات الدقيقة المتداولة لفتح حاجز الدم في الدماغ (BBB) في مناطق بحجم ملليمتر. يسمح هذا التعريب داخل الجمجمة من العوامل التي يتم تسليمها بشكل نظامي التي لا يمكن عادة عبور BBB. توفر هذه التقنية بديلاً غير جراحي للجراحة اجسارية. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع في مختبرات علم الأعصاب بسبب محدودية الوصول إلى المعدات والطرق الموحدة. والهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير نهج سطح المقعد لفتح FUS BBB (BBBO) بأسعار معقولة وقابلة للتكرار، وبالتالي يمكن اعتماده بسهولة من قبل أي مختبر.

المقدمة

على الرغم من الاكتشافات العديدة في علم الأعصاب الأساسية، فإن عدد العلاجات الناشئة لاضطرابات النمو العصبي والاعصاب لا تزال محدودة نسبيا1،2. وقد اقترح فهم أعمق للجينات والجزيئات والدوائر الخلوية المشاركة في الاضطرابات العصبية العلاجات الواعدة التي لا يمكن إدراكها في البشر مع التقنيات الحالية3. غالباً ما تكون محدودة العلاجات الفعالة من قبل الحاجة إلى أن تكون penetrable الدماغ وموقع محدد4,5,6,7,8. ومع ذلك، فإن الطرق الحالية لتوصيل المخدرات المحلية إلى مناطق معينة من الدماغ (على سبيل المثال، الولادة عن طريق الحقن أو القنية) هي طرق غازية وتتطلب فتحًا في الجمجمة9. يمنع غزو هذه الجراحة الاستخدام الروتيني للتسليم الموضعي في الدماغ البشري. بالإضافة إلى ذلك ، تلف الأنسجة والاستجابات الالتهابية الناتجة هي الخلطات في كل مكان للدراسات الأساسية وما قبل الإكلينيكية التي تعتمد على الحقن داخل الدماغ10. القدرة على تسليم وكلاء nonininsiveively عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) واستهدافهم إلى مناطق محددة في الدماغ يمكن أن يكون لها تأثير هائل على علاجات الاضطرابات العصبية، في حين توفير في الوقت نفسه أداة تحقيق قوية للبحوث قبل الإكلينيكية.

طريقة واحدة من وسائل النقل المستهدفة عبر BBB مع الحد الأدنى من الضرر الأنسجة هو الموجات فوق الصوتية التركيز transcranial (فوس) جنبا إلى جنب مع microbubbles لفتح محوري وعابر BBB11،12،13،14،15،16. وقد اكتسب فتح FUS BBB الاهتمام الأخير لعلاج الاضطرابات العصبية ، السكتة الدماغية و الدبقية عن طريق توطين العلاجات لاستهداف مناطق الدماغ مثل العوامل العصبية17,18,19, العلاجات الجينية20,21,22, الأجسام المضادة23, الناقلات العصبية24, و الجسيمات النانوية25,26,27,28,29. مع مجموعة واسعة من التطبيقات وطبيعتها غير الباضعة30,31, فتح FUS BBB هو بديل مثالي للحقن التريو كسيائي داخل الجمجمة. وعلاوة على ذلك، نظرا لاستخدامها حاليا في البشر30،32، يمكن اعتبار التحقيقات قبل الظهر باستخدام هذه التقنية الترجمية للغاية. ومع ذلك ، FUS BBB فتح لم يتم بعد تقنية راسخة على نطاق واسع في العلوم الأساسية والبحوث قبل الكلينيكية بسبب عدم وجود إمكانية الوصول. لذلك، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنهج benchtop لفتح FUS BBB كنقطة انطلاق للمختبرات المهتمة في تأسيس هذه التقنية.

وقد أجريت هذه الدراسات مع إما الهواء عالية الطاقة المدعومة FUS محول الموجات فوق الصوتية محددة أو انخفاض الطاقة تخمد ركزت محول الغمر بالموجات فوق الصوتية. وكانت محولات مدفوعة من قبل مكبر للصوت RF السلطة مصممة للأحمال التفاعلية ومولد وظيفة benchtop القياسية. يمكن العثور على تفاصيل هذه العناصر في جدول المواد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة الدول الأمريكية.

1. التركيز على الموجات فوق الصوتية معدات القيادة الإعداد

  1. استخدام 50 أوم كابلات BNC محوري لتوصيل (1) مدخلات محول الموجات فوق الصوتية إلى إخراج مكبر للصوت RF و (2) مدخلات مكبر الصوت RF إلى إخراج مولد الدالة.
  2. تعيين وظيفة مولد وضع إلى انفجار الجيوب الأنفية مرة واحدة في الثانية مع دورة 1٪ واجب.
    1. لـ MHz 1 رطوبة منخفضة الطاقة غمر محول مع مسافة بؤرية 0.8 بوصة المستخدمة مع مضخم 50 dB RF، تعيين إعدادات البداية إلى: 1 ميغاهرتز موجة جيبية، 1 V الذروة إلى الذروة، 10K دورة، 1 s الفاصلة (أو الفترة).
    2. للهواء المدعوم، 1.1 ميغاهيرتز محول الطاقة العالية، تعيين الإعدادات الأولية إلى: 1.1 ميغاهيرتز موجة جيبية، 50 ميغا فولت الذروة إلى الذروة، 11k دورات، 1 S الفاصل الزمني.
      ملاحظة: لا تقم بتشغيل محولات ما لم تكن مغمورة. لا تضع اليد أو جزء آخر من الجسم في التركيز بالموجات فوق الصوتية أو تلمس وجه محول أثناء العمل.

2. التركيز على الموجات فوق الصوتية benchtop الإعداد

  1. 3D طباعة الإطار stereotaxic وحامل الإطار stereotactic.
  2. ربط محول إلى مُوضع XYZ باستخدام المشبك الذي يحمل أنبوب PVC(الشكل 1a). قم بلصق المشبك على شريحة المحور X وقفل مع الجوز الجناح.
    1. إذا كان استخدام محول الموجات فوق الصوتية عالية الطاقة، إرفاقه إلى الأنابيب البلاستيكية باستخدام زوج متطابقة من المغناطيس. تأكد من أن المغناطيس واحد لديه ثقب والآخر لديه نتوء مطابقة. كاب الجزء السفلي من الأنابيب البلاستيكية وإرفاق واحدة من المغناطيس لذلك باستخدام الايبوكسي (انظر الشكل 1b).
    2. نعلق المغناطيس الثاني إلى مركز أعلى من محول الموجات فوق الصوتية عالية الطاقة باستخدام الايبوكسي. تأكد من أنه في مركز جدا من محول (الشكل 1c).
  3. في حالة استخدام محول الموجات فوق الصوتية عالي الطاقة، قم بعمل مؤشر لإبطال مُوضع XYZ. يشير طرف هذا المؤشر إلى الموقع في مساحة مركز تركيز محول الموجات فوق الصوتية عند توصيل محول الموجات فوق الصوتية بموضع XYZ. جعل مؤشر من 18 G قطع إبرة لتكون طول المسافة البؤرية من محول زائد سمك محول (الشكل 1d).
    1. تطبيق الايبوكسي إلى المغناطيس الثالث (هذا المغناطيس أيضا أزواج مع المغناطيس غطاء PVC) وإرفاقه إلى أعلى المؤشر. المؤشر سوف تكون قادرة على إرفاق ثم إلى المغناطيس على الأنابيب البلاستيكية لXYZ الإبطال (الشكل 1d).
  4. إذا كان استخدام محول الغمر منخفض الطاقة، 3D طباعة الملف للمؤشر ومقطع تصاعد.
    1. إرفاق محول الغمر منخفضة الطاقة إلى الأنابيب البلاستيكية عن طريق قص مقطع تصاعد على الأنابيب PVC وإدراج محول في الحلبة (الشكل 1F).
  5. جعل حمام الماء عن طريق الإلتصاق معا قطع من ورقة الاكريليك التي سوف تكون قادرة على بقية على رأس الحيوان فوق إطار stereotactic (الشكل 1e).
    1. قطع فتحة في الجزء السفلي من الحمام الذي هو حول حجم رأس الحيوان. تغطية ثقب في حمام الماء مع شريط بوليميد.
      ملاحظة: يجب الحرص على ضمان عدم تسرب المياه حول الشريط البوليميد لأنها يمكن أن الرطب الفراء الفئران وتسبب انخفاض حرارة الجسم.
  6. جعل التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial عن طريق ملء 4 مم قطرها رقيقة قصفت البلاستيك أو الزجاج الكرة مع السائل المرئية التصوير بالرنين المغناطيسي (على سبيل المثال، فيتامين E النفط) وختم عليه. وضعه في حامل التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial على الجانب الأيمن من الإطار ستيريو 3D المطبوعة(الشكل 2a).
  7. تأمين بقوة حامل الإطار المطبوعة 3D إلى موضع XYZ في موقع جيد لتحديد المواقع الحيوانية. حرك علامة التبويب على الطرف الرستري لحامل الإطار إلى القناة المطابقة على السكك الحديدية المحور Y وتأمين مع مجموعة مسامير(الشكل 1h، السهام الحمراء).
  8. لقيادة مُوضع XYZ، قم بتثبيت USB إلى محول تسلسلي على جهاز كمبيوتر باتباع توجيهات الشركة المصنعة و توصيل المحول. تثبيت بيئة وقت التشغيل و برنامج تحكم المحرك على جهاز الكمبيوتر.
    1. تأكد من تحديد المنفذ التسلسلي المناسب في البرنامج عن طريق تحديد USB لتحويل تسلسلي في عنصر التحكم المنسدل تحديد المنفذ على اللوحة الأمامية لبرنامج وحدة التحكم. توصيل USB إلى محول تسلسلي إلى مربع تحكم المحرك السائر باستخدام كبل كروس تسلسلي 9-pin (على سبيل المثال، كبل مودم فارغ RS232).
    2. تشغيل برنامج وحدة تحكم لاختبار أن المحركات السائر يمكن أن تكون مدفوعة تحت مراقبة البرنامج. قد تتطلب هذه الخطوة المساعدة من دعم تكنولوجيا المعلومات المحلية.

3- إجراء الاستهداف داخل الجمجمة

ملاحظة: ذكور Sprague Dawley الفئران وزنها 250-350 غرام واستخدمت لهذه التجارب. الحيوانات كان لها حرية الوصول إلى الماء و الجرذان تشاو، وجرى الحفاظ على ضوء 12:12 ساعة: دورة مظلمة.

  1. وضع الحيوان تحت التخدير (3٪ isoflurane مع الأكسجين) والتحقق من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم. ثم أدخل القسطرة كما هو موضح أدناه.
    1. دفء الذيل مع مصباح لجعل من الأسهل لتصل إلى الوريد. يجب الحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة الحيوان أو لحرق الذيل.
    2. مرة واحدة في حالة من النوم الحيوان (لا يستجيب لقرصة إصبع القادوم)، إدراج 24 G الذيل الوريد القسطرة التي سيتم استخدامها لتقديم microbubbles، ايفانز صبغة زرقاء (EBD)، gadobutrol MRI التباين إذا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، وعامل تجريبي من الفائدة. بمجرد إصابة الوريد ، سيملأ الدم الغدد ، ويزيل الإبرة الداخلية ببطء بينما يدفع الغدد إلى الوريد.
      ملاحظة: انظر دليل مثل ستيوارت وشرودر33 إذا كان يفعل حقن الوريد ذيل الفئران للمرة الأولى.
    3. إذا لم يكن هناك تدفق للدم، قم بتحريك ادمة القسطرة ببطء خارج الوريد لاختبار أن الإبرة قد تكون قد مطعونة من خلال الوريد. إذا تدفق الدم عندما يتم سحب القسطرة قليلاً، ثم أولاً كزة ذهب من خلال الوريد ووضع القسطرة سوف تحتاج إلى إعادة تشغيل في مكان آخر على الذيل الذي هو روسسترال إلى الموقع السابق.
  2. املأ قابس القسطرة بالملوحة الملحية والمسمار في توصيل القسطرة في نهاية منفذ القسطرة بمجرد أن يمتلئ المنفذ بالدم. لف بعناية شريط المختبر حول القسطرة والذيل لإبقائه في مكانه. تبدأ مع قطعة صغيرة في الجزء العلوي والعمل في اتجاه السد، وترك نهاية جدا من القسطرة المكونات يتعرض.
  3. قم بتوصيل خط التخدير على موصل التخدير على الإطار المجسّم(الشكل 2a)وقم بإصلاح رأس الحيوانات في الإطار عن طريق وضع الفم على شريط العضة وتوجيه قضبان الأذن في كل من قنوات الأذن ، ثم شد مسامير المجموعة. تأكد من أن رأس الحيوانات آمن ومستوٍ.
  4. حرك الحيوان إلى سرير التصوير بالرنين المغناطيسي وربط خط التخدير بمخروط الأنف. في هذا البروتوكول تم استخدام 9.4 T صغيرة تحمل الرنين المغناطيسي الحيوانات.
  5. جمع الصور التاجية وتكيناتية T2 التي تلتقط الدماغ كله، فضلا عن التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial(الشكل 2b)لقياسات التنسيق. تزويد الفيزيائي أو التكنولوجيا المحلية التصوير بالرنين المغناطيسي المعلومات التالية حتى يتمكنوا من بناء بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي.
    1. للصور الإكللية(الشكل 2B الأعلى) ، استخدم المعلمات التالية: عدد الصور: 27 ، العرض: 62.2 مم ، الارتفاع: 62.2 مم ، العمق: 37.97 مم ، حجم Voxel: 0.24 × 0.24 × 1.41 مم3.
    2. للصور المحورية(الشكل 2b القاع)، استخدم المعلمات التالية: عدد الصور: 13، العرض: 61.47 مم، الارتفاع: 53.81 مم، العمق: 16.7 مم، حجم فوكسل: 0.41 × 0.21 × 1.29 مم3.
      ملاحظة: ليس من الضروري أن يكون هذه المعلمات الدقيقة طالما أن التاجي في دقة الطائرة هو قريب من 0.25 ملم والصور تغطي الدماغ كله وfiducial.
  6. جمع القياسات تنسيق من الصور أعلاه عن طريق تسجيل المسافة من التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial إلى منطقة الدماغ التي سيتم استهدافها مع فوس.
    1. في الماسح الضوئي، على الصور التاجية التي تم جمعها في الخطوة 3.5، العثور على الصورة التي fiducial هو الأكبر، مما يدل على مركز fiducial. تسجيل المسافة من أعلى fiducial إلى منطقة الدماغ من الفائدة في مم (برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي سيكون لها مقياس أو أداة قياس نقطة، استشارة المحلية التصوير بالرنين المغناطيسي أو الفيزيائي حول كيفية القيام بذلك) في كل من اتجاه الوسيط / الجانبي وفي الاتجاه البطني الظهرية(الشكل 2B،أعلى).
    2. في الماسح الضوئي، على الصور المحورية التي تم جمعها في الخطوة 3.5، العثور على الصورة التي تظهر أعلى جدا من fiducial وقياس المسافة من مركز fiducial إلى منطقة الدماغ الهدف في كل من اتجاه الظهر /فيترالي وفي اتجاه وسطي / الجانب(الشكل 2B،أسفل).
    3. قارن بين القياسات الوسيطة / الجانبي وإذا كانت مختلفة استخدام المتوسط. سيتم استخدام هذه القياسات الإحداثيات لاحقاً في الخطوة 4.3 لتوجيه نقطة اتصال FUS إلى منطقة الدماغ الهدف مع موضع XYZ.
  7. جمع صور التصوير بالرنين المغناطيسي prescan. قارن هذه الصور إلى الصور التي تم جمعها بعد فتح FUS BBB(الشكل 4). سيتم استخدام الصور ذات الأوزان T1 لاحقًا لتصور افتتاح BBB ، سيتم استخدام الصور المرجحة T2 لاحقًا لضمان عدم حدوث تلف في الأنسجة بعد علاج FUS34.
    1. بالنسبة للصور المحورية المرجحة بـ T1، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 51.2 مم، العمق: 3.0 مم، حجم voxel: 0.23 × 0.2 × 0.23 مم3،عدد الصور: 13.
    2. بالنسبة للصور المحورية المرجحة بـ T2، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 51.2 مم، العمق: 2.6 مم، حجم voxel: 0.2 × 0.2 × 0.2 مم3،عدد الصور: 13.
    3. بالنسبة للصور التاجية المرجحة بـ T1، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 30 مم، العمق: 27 مم، حجم voxel: 0.16 × 0.16 × 1 مم3، عدد الصور: 27.
    4. بالنسبة للصور التاجية المرجحة بـ T2، استخدم المعلمات التالية: العرض: 30 مم، الارتفاع: 30 مم، العمق: 27 مم، حجم voxel: 0.12 × 0.12 × 1 مم3، عدد الصور: 27.
      ملاحظة: كما في الخطوة 3.5، يجب أن لا تكون هذه المعلمات التصوير نفس تماماً كما المسرودة. هذه الصور لها FOV أصغر ودقة أعلى من تلك التي تم تجميعها في الخطوة 3.5.
  8. حفظ الحيوان في إطار stereotaxic، نقل بسرعة الحيوان من السرير التصوير بالرنين المغناطيسي إلى سطح المقعد FUS الإعداد. تأكد من أن الحيوان لا يزال نائما لنقل تحت تأثير التخدير.
  9. لأوقات النقل الأطول، استخدم مربع لنقل كبير بما يكفي ليلائم الحيوان والإطار. مع قابس التخدير لا تزال تعلق، وضع الحيوان والإطار داخل منطقة الجزاء والسماح isoflurane الزائدة لملء مربع لبضع دقائق. افصل خط التخدير ونقل بسرعة.

4. تركيز إجراء الموجات فوق الصوتية

  1. عند وصوله إلى سطح المقعد FUS الإعداد، على الفور سد خط التخدير في مخروط الأنف والاستمرار في تشغيل 1.5-3٪ isoflurane مع الأكسجين. القيام بذلك في أسرع وقت ممكن لتجنب يستيقظ الحيوان.
  2. قم بزلاق الإطار إلى حامل الإطار ثم قم بمحاذاته في مكانه بحزم. استخدام مقصات لحلاقة رأس الحيوان. فرشاة بعيدا الشعر الزائد وتطبيق كريم مزيل الشعر على فروة الرأس. واسمحوا الجلوس لمدة 3 دقائق ومسح بعيدا بالماء والشاش.
  3. إذا لم يكن التصوير بالرنين المغناطيسي متاحًا لاستهدافه، استخدم إطارًا مجسمًا قياسيًا (غير مطبوع ثلاثي الأبعاد) لإبطال موضع المؤشر إلى البرما عن طريق لمس طرف المؤشر إلى البريغما (ستكون هناك حاجة إلى شق فروة رأس لهذا) وإبطال البرنامج أو تسجيل الإحداثيات. حرك حرف XYZ لأعلى بمقدار 50 مم بالنقر فوق الزر لأعلى 50 في البرنامج ومبادلة المؤشر للمحول. استنادا إلى أطلس دماغ الفئران كما هو موضح سابقا35، والانتقال إلى إحداثيات الدماغ المطلوب باستخدام أزرار يخطو في البرنامج. إذا كان استخدام هذا الأسلوب بدلاً من التصوير بالرنين المغناطيسي، انتقل لأسفل إلى المقطع 4.6.
  4. إذا كان استخدام التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي، إرفاق المؤشر وتحريك المؤشر إلى موقع التصوير بالرنين المغناطيسي fiducial(الشكل 1d،ز). ضع المؤشر في أعلى مركز التصوير بالرنين المغناطيسي (يتم توفير ثقب صغير في أعلى الحامل فيديوسيل للإشارة). انقر فوق زر الموضع الخالية الذي هو النقطة التي تم حسابها من خلالها جميع المسافات في صورة MRI.
  5. إزالة المؤشر وتحريك الموضع إلى إحداثيات الوسيط/الجانبي وإحداثيات rostral/caudal. رفع الموضع حتى عن طريق الضغط على زر لأعلى 50 للسماح لوضع حمام الماء والموجات فوق الصوتية هلام. إذا تم الوصول إلى أعلى مفتاح السفر بمحور Z، سيتم إبطال موقع الإبطال. سيتم تعيين الإحداثيات الظهرية/البطنية بعد إضافة محول.
  6. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على فروة رأس الحيوان ووضع حمام الماء على الحيوان مع نافذة الشريط البوليميد ضغطت على هلام. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في هلام الموجات فوق الصوتية.
  7. ملء حمام الماء بالماء دي الغاز.
  8. إذا كان استخدام محول الطاقة العالية، وخفض الموضع بحيث المغناطيس هو فقط فوق الماء. إرفاق محول إلى الموضع عن طريق خفض بعناية محول في الماء في زاوية لمنع فقاعات الهواء من الحصول على المحاصرين تحت الوجه وربط المغناطيس.
  9. إذا كان استخدام محول الغمر المنخفض الطاقة، خفض الموضع في الماء فقط فوق مقطع محول. ثم مقطع محول في مكان عن طريق خفض ببطء في الماء في زاوية لمنع فقاعات الهواء من الحصول على المحاصرين تحت الوجه.
    ملاحظة: حمام شفاف مفيد عند النظر تحت واجهة محول للفقاعات.
  10. خفض موضع إلى تنسيق الظهر /فينطال.
  11. قم بتشغيل AMP طاقة RF.
  12. حقن 1 مل / كغ من 3٪ ايفانز صبغة زرقاء (EBD) عن طريق التمسك تلميح إبرة في القسطرة المكونات والحقن. السماح لها لتعميم لمدة 5 دقائق.
  13. تفعيل microbubbles عن طريق هز لهم بعنف مع مع شاكر فقاعة.
    1. إعداد 5x جرعة 30 ميكرولتر / كغ من microbubbles (conc. 1.2 ×10 10 /مل) في 0.2 مل من المالحة لحساب 2 FUS العلاجات والأنابيب في 18 G مجنحة مجموعة التسريب. على سبيل المثال، إذا كان الجرذ يزن 200 غرام، ثم ملء حقنة تحتوي على 18 G إبرة تلميح مع 30 ميكرولتر من microbubbles في 1 مل من المالحة.
      ملاحظة: تأكد من استخدام نصائح إبرة 18 G لكل من أخذ وحقن مع مجموعة ضخ مجنحة.
    2. عكس حقنة عدة مرات للحصول على توزيع موحد من microbubbles. ثم نعلق وملء مجموعة ضخ مجنحة. ضع الحقنة على مضخة التسريب واضبط مضخة التسريب لتقديم 0.2 مل بمعدل 6 مل/ساعة. وهذا سيوفر ضخ بطيء من microbubbles على مدى 2 دقيقة FUS التعرض.
    3. أدخل الإبرة المجنحة في قابس القسطرة.
  14. أولا، تشغيل مضخة التسريب، والانتظار 3 ق وبدء العلاج FUS عن طريق الضغط على زر تمكين الإخراج على مولد وظيفة (المسمى "على" على مولد وظيفة في جدول المواد). كرر هذه مرتين في المنطقة الواحدة مع 5 دقائق في ما بين للسماح للmicrobubbles لمسح.
    1. اضغط على زر على مرة أخرى على مولد وظيفة لوقف العلاج FUS عندما تتوقف مضخة ضخ في 2 دقيقة.
    2. انتظر لمدة 5 دقائق لmicrobubbles لمسح. ثم ابدأ في التسريب والعلاج الثاني FUS.
    3. مباشرة بعد العلاج FUS الثاني, حقن gadobutrol التباين (إذا كان استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي) وعامل الفائدة, على سبيل المثال, جزيئات الفيروسية. يجب ألا يتجاوز إجمالي حجم الكميات المسلمة لجميع الوكلاء 5 مل/كغ.
      ملاحظة: قد يختلف توقيت التسليم (على سبيل المثال، قبل أو بعد فتح FUS BBB) من وكيل الفائدة اعتمادا على الوكيل المستخدم.
  15. إيقاف أمبير الطاقة RF ونقل الحيوان فورا مرة أخرى إلى التصوير بالرنين المغناطيسي.

5. MRI تأكيد افتتاح BBB

  1. إذا لم يكن MRI متوفراً، انتقل إلى القسم 6 واستخدم تعبير EBD لتأكيد فتح BBB.
  2. ضع الحيوان مرة أخرى على سرير التصوير بالرنين المغناطيسي في نفس الموقع بالضبط كما هو الحال في الخطوة 3.7 وقم بتوصيل خط التخدير.
  3. جمع التصوير بالرنين المغناطيسي بعد بمسح مع نفس المعلمات التصوير المستخدمة في الخطوة 3.7 لتصور تحسين التصوير بالرنين المغناطيسي gadobutrol في منطقة BBB فتح(الشكل 3B،ه).

6. الضخ وجمع الأنسجة

  1. Perfuse الحيوان مع cold 4٪ formalin حتى الدم يعمل واضحة تماما.
  2. إزالة الدماغ ومكان في 4٪ formalin أو PFA في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، ضع الدماغ في محلول السكروز 30٪ حتى يغرق الدماغ (حوالي 2-3 أيام). وأخيرا، فلاش تجميد في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التبريد.
  3. تجميد الدماغ في أكتوبر وأخذ اكيات.
  4. إصلاح وأغطية المقاطع للمجهر الفلوريسنس. تبلغ ذروة الإثارة EBD عند 470 و 540 نانومتر والانبعاثات ذروتها عند 680 نانومتر. Coverlip مع DAPI المتوسطة التركيب من أجل تصور المورفولوجيا الخلوية الشاملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، ونحن نبرهن على أن التركيز على الموجات فوق الصوتية مع microbubbles يمكن أن تحفز فتح BBB المترجمة باستخدام المعلمات المحددة أعلاه مع كل من محول الغمر المنخفض الطاقة(الشكل 3)وFUS محول (الشكل 4). أولاً، في التجارب المبكرة، تم استهداف محول الغمر منخفض الطاقة إلى نصف الكرة الدماغي واحد إما الأمامي(الشكل 3b)أو الوسيط(الشكل 3a). ثم تم التضحية الحيوانات 2 ساعات في وقت لاحق مع perfusion(...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا وصفنا نهج benchtop لmicrobubble ساعد FUS BBB فتح مع نهج بديلة بما في ذلك، اثنين من محولات مختلفة وأساليب لاستهداف داخل الجمجمة مع وبدون التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي. حاليا، من أجل إنشاء التصوير بالرنين المغناطيسي الموجهة FUS BBB فتح في المختبر، وهناك خيار لشراء ممتازة جاهزة للاستخدام الأجهزة التي توفر نتائج موحدة للغاية وقابلة للتكرار مع واجهات سهلة الاستخدام. ومع ذلك، العديد من المختبرات غير مستعدة لتكلفة هذه الأدوات. ولذلك، فإن الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو توفير نقطة انطلاق يمكن لأي مختبر أن ينشئها من أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل منحة البنية التحتية للبحوث EPSCoR NSF لجامعة كليمسون (1632881). بالإضافة إلى ذلك، تم دعم هذا البحث جزئيًا من قبل مركز سيفيتان الدولي للأبحاث، برمنغهام، AL. الكتاب الاعتراف بامتنان استخدام الخدمات والمرافق من جامعة ألاباما في برمنغهام الصغيرة الحيوانات تصوير مرفق منحة المشتركة [المعاهد الوطنية للصحة P30 CA013148]. ويعترف أصحاب البلاغ راجيف شوبرا بدعمه وتوجيهه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شاكر الفقاعاتLantheus التصوير الطبيVMIXVIALMIX ، جهاز التشغيل المستخدم لتنشيط Definity microbubbles قابس
القسطرة / غطاء الحقنتقنيات التسريب SAIرقم الجزء:قابس القسطرة IC / غطاء الحقن
صبغة إيفانز الزرقاءSigmaE2129-10Gإيفانز صبغة زرقاء
مولدوظيفة TektronixAFG3022Bقناة مزدوجة ، 250 مللي ثانية / ثانية ،
محول طاقة FUS 25 ميجا هرتز ، 1.1 ميجا هرتزFUS InstrumentsTX-110محول طاقة كروي مركز كرويا متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي 1 ميجا هرتز مع وسادة
تسخين هيدروفون للفئران والجرذان كينتScientificPS-03وسادة تسخين - PhysioSuite للفئران والفئران
التسريبKD Scientific780100KDS 100 مضخة ضخ حقنة واحدة قديمة
شريط KaptonGizmo Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref = cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) للطابعات ثلاثية الأبعاد والطباعة ، 8 × 8 بوصات ، 10 أوراق لكل عبوة
محول طاقة غمر منخفض الطاقة ،أوليمبوسV303-SU، 1 ميجاهرتز ، 0.50 بوصة. قطر العنصر ، نمط العلبة القياسي ، موصل UHF مستقيم ، مجموعات مغناطيس F = 0.80IN PTF
WINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref = cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15mm خياطة في مشابك حقيبة مغناطيسية لخياطة سكرابوكينغ - 10 مجموعات
مكبر للصوت RFE & IA07575W
قسطرة الوريد الذيلBD382512 / فيشر العنصر: NC122851324 جرام BD Insyte Autoguard القسطرة الوريدية المحمية (غير مجنحة)
الفقاعات الدقيقة على النقيض بالموجات فوق الصوتيةLantheus Medical ImagingDE4 ، DE16DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
جل الموجات فوق الصوتيةAquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref = cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		جل بالموجات فوق الصوتية Aquasonic 100 ناقل حركة 1 لتر زجاجة ضغط
مجموعات التسريب المجنح ، 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Winged Infusion
Sets برنامج تحكم في المحركN / AN / Aبرنامج مخصص مكتوب في LabView للتحكم في بيئة وقت تشغيل وحدة التحكم في المحرك Velmex
لبرنامج التحكم في المحركNational InstrumentsLabView إصدار محرك وقت التشغيل 2017 أو أفضلhttps://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
محاور مشغل المرحلة الخطية (محدد موضع XYZ)مسامير Velmex
MB-1BiSlide Bolt 1 / 4-20x3 / 4 "برغي غطاء المقبس (10 عبوات) ، الكمية: 3
وحدة تحكم في المحركVelmexVXM-3التحكم ، 3 محاور قابلة للبرمجة في المحرك ، الكمية: 1
مرابطالتثبيتVelmexMC-2Clate ، 2 حفرة BiSlide ، الكمية: 6
مرابط متصاعدةVelmexMC-2، 2 ثقب BiSlide ، الكمية: 2
USB إلى محول تسلسليVelmexVXM-USB-RS232USB إلى RS232 كابل اتصالات تسلسلي 10 أقدام ، الكمية: 1
مرحلة خطية ذات محور xVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide ، السفر = 10 بوصة ، 2 مم / دورة ، حدود ، NEMA 23 ، الكمية: 1
محرك متدرج للمحور xVelmexPK266-03A-P1Vexta Type 23T2 ، محرك متدرج أحادي المحور ، الكمية: 1
مرحلة خطية ذات محورy VelmexMN10-0100-M02-21BiSlide ، السفر = 10 بوصة ، 2 مم / دورة ، حدود ، NEMA 23 ، الكمية: 1
محرك متدرج ذو محورy VelmexPK266-03A-P1Vexta Type 23T2 ، محرك متدرج أحادي المحور ، الكمية: 1
مثبط المحور zVelmexD6CL-6.3FD6CL المثبط للنوع 23 السائر مزدوج العمود المحرك ، الكمية: 1
المرحلة الخطية للمحور zVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide ، السفر = 10 بوصة ، 2 مم / دورة ، الحدود ، NEMA 23 ، الكمية: 1
محرك متدرج المحورz VelmexPK266-03B-P2Vexta Type 23T2 ، محرك متدرج مزدوج العمود ، الكمية: 1
ملفات
حامل محول الغمر والمؤشرhttps://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
تجسيميhttps://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
حاملhttps://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T صغير التجويف MRIBrukerBruker BioSpec 94/20ParaVision الإصدار 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
كريم مزيل الشعرالكنيسة & دوايتناير كريم
جادوبوترول عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسيبايرجادافيست (جادوبوترول ، 1 مللي / مل)
إطار تجسيميStoelting# 51500غير متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي
جهاز تسليم FUS تسليمFUS InstrumentsRK-300جاهز للاستخدام FUS متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي للقوارض
مضخة محول غمر 1 ميجا هرتز 3 قابلة للطباعة ثلاثية الأبعادإطار إطار تجسيمي

المراجع

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197(2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15(2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986(2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86(2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نهج Benchtop لموقع محدد فتح حاجز الدم الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة في نموذج الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.