الهدف من تقييم المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك هو تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية عن طريق قياس إنتاج منتجات البيروكسيد الدهون، في المقام الأول malondialdehyde، وذلك باستخدام قياس الطيف الطول الموجي مرئية في 532 نانومتر. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا على المصل البشري ، وlysates الخلية ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية باستخدام اختبار المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على الرغم من خصوصية التحليل المحدودة ووعرة، تم استخدام الحمض thiobarbituric المواد التفاعلية (TBARS) على نطاق واسع كمقياس عام من البيروكسيد الدهون في السوائل البيولوجية. وغالبا ما يعتبر مؤشرا جيدا لمستويات الإجهاد التأكسدي داخل عينة بيولوجية، شريطة أن تكون العينة قد عولجت وخزنت على النحو الصحيح. ينطوي المقايسة على تفاعل منتجات البيروكسيد الدهون ، في المقام الأول malondialdehyde (MDA) ، مع حمض ثيوباربيتوريس (TBA) ، مما يؤدي إلى تشكيل إضافات MDA-TBA2 تسمى TBARS. TBARS ينتج اللون الأحمر والوردي التي يمكن قياسها الطيفيةصورية في 532 نانومتر. يتم إجراء فحص TBARS في ظل ظروف حمضية (درجة الحموضة = 4) وعند 95 درجة مئوية. نقية MDA غير مستقر، ولكن هذه الشروط تسمح الافراج عن MDA من MDA بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال)، والذي يستخدم كمعيار تحليلي في هذه الطريقة. إن اختبار TBARS هو طريقة مباشرة يمكن إكمالها في حوالي 2 ساعة. يتم وصف إعداد الكواشف المقايسة بالتفصيل هنا. يمكن للباحثين المهتمين بالميزانية استخدام هذه الكواشف لإجراء تجارب متعددة بتكلفة منخفضة بدلا من شراء مجموعة مقايسة TBARS باهظة الثمن تسمح فقط ببناء منحنى قياسي واحد (وبالتالي لا يمكن استخدامها إلا لتجربة واحدة). ويظهر تطبيق هذا المقايسة TBARS في مصل الدم البشري, البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة, وlysates الخلية. وينبغي أن يكون المقايسة متسقة وقابلة للتكرار، ويمكن بلوغ حدود الكشف عن 1.1 ميكرومتر. وتقدم توصيات لاستخدام وتفسير المقايسة الطيفية TBARS.
المقدمة
البيروكسيد الدهني هو عملية تهاجم فيها الجذور الحرة، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية وأنواع النيتروجين التفاعلية، الروابط المزدوجة بين الكربون والكربون في الدهون، وهي عملية تنطوي على تجريد الهيدروجين من الكربون وإدخال جزيء الأكسجين. هذه العملية تؤدي إلى خليط من المنتجات المعقدة بما في ذلك، الجذور البيروكسيدات الدهنية، والهيدروكسيدات والمنتجات الأولية، وكذلك malondialdehyde (MDA) و 4 هيدروكسينالونال كمنتجات ثانوية السائدة1.
وقد استخدمت على نطاق واسع MDA في البحوث الطبية الحيوية كعلامة على البيروكسيد الدهون بسبب رد فعل سهل مع حمض ثيوباربيتريك (TBA). رد الفعل يؤدي إلى تشكيل MDA-TBA2، وهو اقتران يمتص في الطيف المر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على عينات مصل الإنسان من المتطوعين بالتراضي بموجب موافقة مجلس الهجرة والعقاقير ووفقا للمبادئ الواردة في إعلان هلسنكي. وتم ترميز العينات وإزالة تحديدها قبل نقلها إلى المختبر التحليلي.
1. إعداد العينة
- lysates الخلية HepG2
- البذور حوالي 10 × 106 خلايا HepG2 لكل قارورة في 16 قوارير T75 مع 14 مل من وسائل الإعلام EMEM تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) وتنمو الخلايا لمدة 2 أيام.
- إعداد RIPA العازلة: في أنبوب 50 مل، إضافة 1.5 مل من 5 M NaCl، 2.5 مل من 1 M تريس-HCl (درجة الحموضة = 7)، 500 ميكرولتر من كاشف NP-40، ثم جلب الحجم النهائي إلى 50 مل مع مياه DI.
- إعداد العازلة تحل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في ظل الظروف الحمضية (درجة الحموضة = 4) وعند 95 درجة مئوية، مالونديالدهيد (MDA) بيس (ثنائي ميثيل الأسيتال) غلة MDA23. MDA والمتجانسات الكيميائية ذات الصلة الوثيقة تتفاعل مع اثنين من جزيئات حمض ثيوباربيتيوريك (TBA) لإنتاج مركبات تسمى المواد التفاعلية حمض thiobarbituric (TBARS), التي تعطي اللون الأحمر والوردي ولها امتصاص λmax في 532 نانومتر (الشكل 1, الشكل 2). وباستخدام ثنائي الفينيل متعدد الدالات (ثنائي ميثيل الأسيتال) كمعيار، ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من القيود1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 وعدم ملاءمة المقارنة بين المختبرات, فإن اختبار TBARS هو واحد من أقدم
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للكشف عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم البحث المبلغ عنه هنا جزئيا المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم 1000/2000. R33 CA217702 ومبادرة تعظيم تنمية الطلاب (IMSD) البرنامج. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1x معقم PBS درجة الحموضة 7.4 1 لتر | VWR ، PA | - 262 | كاشف تحلل الخلية |
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي قائم بذاته | Corning ، NY | CLS430897 | المواد العامة |
| 96 لوحة بئر ، غير معالجة ، واضحة ، مع غطاء ، غير معقمة | Thermo Fisher Scientific ، MA | 280895 | لقياس الامتصاص |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD جهاز تصفية الدوران بالطرد المركزي | فيشر Scientific ، NH | UFC510024 | تنقية LDL |
| للأنابيب الزجاجية | Thermo Fisher Scientific ، MA | 14-930-15D | لفحص TBARS |
| كلوريد النحاس II | SIGMA ، MO | 222011-250G | للحث على أنابيب ثقافة الأكسدة |
| ، يمكن التخلص منها ، مع تشطيب الغطاء اللولبي ، زجاج البورسليكات (13 × 100 مم) | VWR ، PA | 53283-800 | لفحص TBARS |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر (EMEM) | ATCC ، | VA HB-8065 | HepG2 خلية الوسائط |
| Eppendorf أنابيب القفل الآمن ، 1.5 مل | eppendorf ، نيويورك | 22363204 | المواد العامة |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes ، 2.0 مل | Genesee Sceitific ، CA | 22363352 | المواد العامة |
| مصل الأبقار الجنيني المصدر الأمريكي | أوميغا العلمية ، CA | FB-11 | لزراعة الخلايا |
| حمض الخليك الجليدي | SIGMA ، MO | 27225-1L-R | TBARS كاشف |
| وقف كوكتيل مثبط البروتياز (100x) | Thermo Scientific ، MA | 87786 | كاشف تحلل الخلية |
| HEPES | SIGMA ، MO | H3375-250G | LDL مذيب |
| HepG2 خلايا | ATCC ، VA | HB-8065 | نموذج أولي للمصفوفة البيولوجية |
| حمض الهيدروكلوريك (HCl) | فيشر العلمي ، NH | A144-212 | كاشف |
| تحلل الخليةLegend Micro 17 جهاز طرد مركزي | حراري علمي ، ماجستير | 75002431 | مادة عامة |
| البروتين الدهني منخفض الكثافة ، أبحاث البلازما | البشرية أثينا & التكنولوجيا ، GA | 12-16-120412 | النموذج الأولي للمصفوفة البيولوجية |
| قضبان التحريك المغناطيسية ، مثمن 6 تشكيلة | VWR ، PA | 58948-025 | المواد العامة |
| Malondialdehyde bis (ثنائي ميثيل أسيتال) | SIGMA ، MO | 8207560250 | TBARS القياسي |
| Multiskan Go Microplate | Spectrophotometer Fisher Scientific ، NH | 51119200 | لقياس الامتصاص |
| NP-40 | EMD Millipore Corp ، MA | 492016-100ML | كاشف تحلل الخلية |
| كلوريد الصوديوم | SIGMA ، MO | S7653-1KG | كاشف تحلل الخلية |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | SIGMA ، MO | 436143-100G | TBARS كاشف |
| هيدروكسيد الصوديوم | SIGMA ، MO | 367176-2.5KG | TBARS كاشف |
| SpeedVac مكثف | حراري علمي ، MA | SC250EXP | ل تحلل الخلايا المركزة |
| قارورة T-75 ، زراعة الأنسجة المعالجة ، 250 مل ، مع غطاء مرشح | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، فلوريدا | 658175 | زراعة الخلايا |
| حمض Thiobarbituric | SIGMA ، MO | T5500-100G | TBARS كاشف |
| قاعدة TRIS | Fluka ، GA | 93362 | كاشف تحلل الخلية |
| Trypsin (1x) | VWR ، PA | 16777-166 | لفصل خلايا HepG2 |
المراجع
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
