يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

5.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

يونيو 10, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

CENP-A في كل مكان هو شرط مهم ل CENP-A ترسب في السنترومير، ورثت من خلال تخمير بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية. هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A) البروتين.

الملخص

دراسة بنية وديناميكيات الكينتوتشورات و centromeres مهم في فهم عدم استقرار الكروموسومات (CIN) وتطور السرطان. إن كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) والمشاركة في الفصل الدقيق للكروموسومات هو سؤال أساسي. ويقترح أن يكون مؤشر الحمض النووي غير (علامة وراثية) هوية سنترومير، وCENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في السنترومير، موروثة من خلال التمدن بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية.

هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن يتم حث في كل مكان في ليسين مختلفة بسبب وضع علامات EYFP في البروتين المتحول CENP-A K124R. تم تحديد Lysine 306 (K306) في كل مكان في EYFP-CENP-A K124R بنجاح، والذي يتوافق مع الlysine 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل القياس الطيفي الشامل. ويناقش التحذير في استخدام GFP / EYFP أو وضع علامات على ارتفاع الوزن الجزيئي البروتين كأداة لتحليل وظيفة البروتين. كما يناقش الحد التقني الحالي للكشف عن النطاقات في كل مكان، وتحديد كل مكان في كل مكان (ق) محددة، وتصور في كل مكان في الخلايا الحية أو خلية واحدة محددة خلال دورة الخلية بأكملها.

طريقة تحليل قياس الطيف الشامل المعروضة هنا يمكن تطبيقها على البروتين CENP-A البشري مع علامات مختلفة وغيرها من البروتينات centromere-kinetochore. ويمكن التوصية بهذه الطرق الجمعية التي تتكون من عدة مقايسات/تحليلات للباحثين المهتمين بتحديد الأدوار الوظيفية للدمج في كل مكان.

المقدمة

في معظم eukaryotes ، يجب أن تلتصق ميكروتيبولس المغزل إلى منطقة واحدة من كل كروموسوم ، يطلق عليه السنترومير. الكينتوشور هو مجمع من البروتينات التي تقع في السنترومير. دراسة توقيت حركات البروتين السنتروميري و kinetochore وبنية kinetochores و centromeres مهم لفهم عدم الاستقرار الكروموسوم (CIN) وتطور السرطان. وتتمثل الأسئلة الرئيسية في كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) وكيفية مشاركتهم في الفصل الدقيق للكروموسومات. في معظم الأنواع، وجود نواة خاصة تحتوي على بروتين معين يشبه هيستون يسمى CENP-A يحدد هوية السنترومير. ولذلك، يُقترح أن يكون مؤشر CENP-A هو مؤشر غير الحمض النووي (علامة اللاجينية) لهوية الميرومير. من المهم توضيح آلية كيفية تعريف CENP-A لهوية السنترومير في البشر.

إن بروتين التعرف على تقاطع هوليداي (HJURP) هو شابرون CENP-A-محددة الذي يودع CENP-A في نوى 11،2،3. لقد سبق أن ذكرت أن مطلوب CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase لCENP-A في كل مكان على lysine 124 (K124) وتوطين centromere4. كما أن نتائجنا أظهرت أن التوظيف centromere من توليفها حديثا CENP-A يتطلب موجودة من قبل في كل مكان CENP-A5. وهكذا، تم تقديم نموذج يشير إلى أن CENP-A في كل مكان موروثة من خلال التملم بين الانقسامات الخلية.

وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها وتلك التي توصلنا إليها، فقد تم نشر النتائج السلبية المتعلقة بـ CENP-A وتوطينها في المنطقة الوسطى مؤخراً6. وادعى المقال أن CENP-A التعديلات على lysine 124 (K124) هي الاستغناء عن إنشاء، وصيانة، وظيفة طويلة الأجل من تينتروميرس الإنسان، استنادا إلى نتائجها السلبية تبين أن طفرة K124R لم تؤثر على CENP-A centrom توطين لا خلية قابلية البقاء6. ومع ذلك، هناك ما يكفي من النقاش في النتائج والاستنتاجات، وقد سبق أن وصفنا ما هي المشكلة التي يمكن أن تكون هناك في نشرتهم السابقة7. وينبغي إيلاء الاهتمام بأنهم تنصهر البروتينات مع CENP-A، التي لديها أوزان جزيئية أكبر بكثير من حجم CENP-A الذاتية: على سبيل المثال، تنصهر ~ 30 كيلو ادا المعزز البروتين الفلورسنت (EYFP) إلى ~ 16 كيلو ادا CENP-A وتحليل EYFP-CENP-A K124R البروتين الانصهار في نظامهم RPE-1CENP-A-/F خروج المغلوب. لا يتوقع أن يرتبط K124 ubiquitin مباشرة إلى HJURP استناداً إلى التنبؤات الهيكلية4، ومع ذلك ، من المتوقع أن يكون لإضافة أحادية ubiquitin تأثير على بروتين التشكل من CENP-A. يمكن تغيير بروتين CENP-A التشكل من خلال وجود بروتين انصهار كبير ، وهذا التغيير التشكلي قد يخفي التغيرات الهيكلية الناجمة عن فقدان في كل مكان. نقترح أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في lysine غير K124 في EYFP -CENP -A K124R متحولة وهذا في كل مكان في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة. دليل على أن يحدث في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين المتحول K124R CENP-A مع بروتين كبير (EYFP) تم الإبلاغ عنها في نشرتنا السابقة8. ووجد أن علامات EYFP تحفز في كل مكان من موقع ليسين آخر من EYFP -CENP-A K124R وأن EYFP-CENP-A K124R يربط متحولة HJURP. ونتيجة لذلك ، فإن هذا ubiquitylation في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R الأصلي نمط ظاهري متحولة واحدة ، وكلاهما EYFP - CENP - A WT وK124R المسوخ أظهرت تعريب centromere (استخدمنا وقارنا pBabe - EYFP - CENP - A WT و K124R متحولة ، جنبا إلى جنب مع pBabe - EYFP control.). وأظهرت النتائج أن العلم الموسومة أو غير الموسومة CENP- A K124R المسوخ قاتلة ولكن يمكن إنقاذها من قبل الانصهار monoubiquitin، مما يشير إلى أن CENP-A في كل مكان هو لا غنى عنه لقابلية الخلية.

في السنوات الأخيرة، وضعت العديد من الدراسات المقايسات المختلفة لتحديد التعديلات ما بعد التحويل (PTMs) من البروتين CENP-A والبروتينات المركزية-كينتوشور الأخرى سواء في الجسم الحي وفي المختبر9،10،11. مماثلة ل PTMs من بروتينات هيستون التي هي آلية رئيسية تنظم وظيفة الكروماتين، وتشارك أيضا PTMs من مكونات الكروماتين chromatin centromeric في آلية أساسية لتنظيم الهيكل العام ودالة centromeres. معظم مواقع CENP-A PTM محددة للنيات التي تحتوي على CENP-A، على الرغم من أن يتم حفظ عدد قليل منها في H3، مما يشير إلى أن تعديل هذه المخلفات تساهم في وظيفة centromere محددة. PTMs من CENP-A بما في ذلك الفسفر، أستيليشن، methylation، وفي كل مكان كانت قد ذكرت سابقا9، مما يشير إلى أن CENP-A يتعرض لمجموعة متنوعة من PTMs والمصفوفات الخاصة بهم الجمعي على الدلفين الأمينية وC-terminus هيستون أضعاف المجال. وقد كشفت عن أهمية CENP -A التعديلات في وظائف متعددة من قبل العديد من المجموعات بما في ذلك لنا. وتشمل هذه الوظائف CENP-A ترسب في centromeres، واستقرار البروتين، وتوظيف CCAN (الشبكة المرتبطة centromere التأسيسية)9. ومع ذلك، فإن الدراسات والنتائج المحدودة لـ CENP-A PTMs هي preformed حيث يتم إجراء مقارنات مع واحدة من النغمات الكنسية التي تنظم وظيفتها بشكل مباشر أو غير مباشر. كما أن التقارير التقنية التي تركز على منهجية تحديد هذه التدابير CENP-A PTMs محدودة أيضاً.

لأن CENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في12سنترومير ، ورثت من خلال dimerization بين انقسام الخلية5، ولا غنى عنه لقابلية الخلية8، فإن طريقة لتحديد CENP -A في كل مكان يكون من الضروري في المستقبل لدراسة النشاط الوظيفي ، وتحديد المواقع ، وهيكل من centromere. ولذلك، هنا نحن وصف تحليل الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن علامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. كما يتم عرض بروتوكولات من المقايسات وغيرها من التحليلات السيطرة (تحليل المناعةfluorescence، محك مستعمرة خارج نمو، وفي التحليل في كل مكان vivo) لمناقشة نتائج التحليل الرئيسي لقياس الطيف الشامل بشكل صحيح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ثقافة الخلية وvirus retro transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد

ملاحظة: يتم التعبير عن EYFP-CENP-A من pBabe-EYFP-CENP-A على مستوى بروتين مماثل إلى CENP-A الذاتية. يتم استبدال مجموع البروتين الخلوي CENP-A مع هذا EYFP-CENP-A بعد تعطيل CENP-A-/F أليل بواسطة إعادة الكومبينيز Cre كما هو الحال في RPE-1 CENP-A-/- الخلايا6.

  1. إعداد من فوقي يحتوي على الفيروس الرجعي باستخدام خلايا التعبئة والتغليف 293T.
    1. اليوم 0: انتشار خلايا التعبئة والتغليف 293T على لوحة ثقافة 6-جيدا (1.0 × 106 خلايا / جيدا). الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 24 ساعة.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
    2. اليوم 1: إعداد رد فعل transfection حول 23 ساعة بعد انتشار (24 نقطة ساعة هو 0 نقطة ساعة من transfection). عبر العبارة بلازميد من كل pBabe-EYFP (B3182)، pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161)، وpBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (انظر الجدول 1).
    3. اختيار مزيج واحد من plasmids المساعد / التعبئة والتغليف المذكورة في الجدول 2 وإضافتها إلى أنابيب تحتوي على واحدة من plasmids المذكورة أعلاه. هناك في الغالب هذه 3 تركيبات للمساعد / التعبئة والتغليف plasmids(الجدول 2). عملت أي تركيبة في هذه التجارب وأظهرت كفاءة مماثلة transfection.
    4. إعداد 50 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض وخلط 2.0 ميكروغرام من كل pBabe-EYFP (B3182)، pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316 وpBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (انظر الجدول 1)إضافة مزيج واحد من plasmids المساعد /التعبئة والتغليف المذكورة في الجدول 2 (انظر أدناه). احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. هذا الخليط هو الحل A.
    5. إعداد 50 ميكرولتر آخر من متوسط المصل المخفض وخلط 1.5 ميكرولتر من الكواشف عبر I و II على التوالي (جدول المواد). احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. هذا الخليط هو الحل B.
      ملاحظة: اختياريا، إضافة فقط 6.0 ميكرولتر من كاشف transfection الثالث (البولي ايثيلينمين [PEI]؛ 1.0 ملغ / مل) في الحل B أو إضافة 6.0 ميكرولتر من الكثيف الثالث بالإضافة إلى الكواشف عبر الأول والثاني في الحل B(جدول المواد).
    6. مزيج الحلول A و B معا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    7. بعد غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة خليط من الحلول A وB (أي، الحمض النووي الدهون المعقدة) مباشرة إلى كل بئر من 6-بئر لوحة ثقافة التي لديها 500 ميكرولتر انخفاض مصل المتوسطة. التركيز النهائي للبقة هو 3.3 ميكروغرام / مل.
    8. بعد احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 4.5 ح، تغيير متوسطة إلى عالية الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. وضع 2 مل / جيدا من المتوسط الثقافة بعد تغيير المتوسطة في لوحة ثقافة 6-well.
    9. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 48 ح بعد transfection. أداء عدوى الفيروس الرجعي في اليوم 3 باستخدام supernatant التي تحتوي على الفيروس الرجعي.
  2. عدوى الفيروس الرجعي للخلايا المستهدفة CENP-A-/F RPE-1.
    1. اليوم 2: قبل يوم واحد من الإصابة، انتشار الخلايا المستهدفة CENP-A-/F RPE-1 إلى transfect في ثقافة 6-جيدا جيدا (2.25 × 105 الخلايا / جيدا). الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة(جدول المواد)مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين.
      ملاحظة: تنتشر الخلايا لم مقايسات مُنَتَجِمَة المستعمرة، وفلورة المناعة، وتحليل البقعة الغربية كتحكم. للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
    2. اليوم 3 (يوم العدوى من الفيروس): في 48 ساعة بعد transfection من خلايا التعبئة والتغليف 293T، وجمع فائقة تحتوي على الفيروس وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر (لا تستخدم مرشح 0.2 μm التي سوف القص مغلف الفيروس). من المستحسن استخدام مرشحات البولي إيثيرسولفون (PES).
    3. تصيب خلايا CENP-A-/F RPE-1 بالفيروس. للحصول على بئر واحد من لوحة ثقافة 6-جيدا، إضافة 1 مل وسائل الإعلام الطازجة، 1 مل فيروس متكاثر والبوليبرين إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل. احتضان CENP-A-/F RPE-1 الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 لمدة 4 أيام حتى اليوم 7 بعد transfection.
      ملاحظة: يجب تحديد فترة الحضانة لنمو الخلايا CENP-A-/F RPE-1 تجريبيًا باتباع التحليلات لتحقيق النتائج المثلى.

2. تحليل الفلوروسنس المناعي للخلايا التي تحتوي على pBabe-EYFP-CENP-A

  1. اليوم 7: 4 أيام بعد عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A يبني، وإزالة وسيلة الثقافة من قبل الطموح. شطف الخلايا مرة واحدة مع TBS (25 mM تريس-HCl، 7.5 pH؛ 125 mM NaCl). تطبيق TBS إلى جانب الآبار الثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحديد نقطة الوقت الأمثل لتثبيت الخلية تجريبياً. إشارات الفلوروس المناعي لكل من EYFP-CENP-A WT وK124R قابلة للكشف في السنترومير على الأقل 4 أيام بعد عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A يبني حتى بدون عدوى Cre (البيانات غير مبينة، الشكل 1C-E للبيانات مع عدوى Cre).
  2. أداء تثبيت الخلية الميثانول وصبغ المناعةfluorescence كما هو موضح سابقا13.
  3. كما تستخدم الأجسام المضادة الأولية المضادة للجسم المضاد GFP (1:1,000 تخفيف) والأجسام المضادة CENP-B (نسبة التخفيف من 1:200) لعلامة موقع السنترومير في TBS تحتوي على مصل الماعز 4٪ (انظر جدول المواد للأجسام المضادة المستخدمة).
  4. إزالة زيادة تصاعد المتوسطة مع منشفة ورقية وختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر في الخطوة الأخيرة.
  5. الرجوع إلى الطريقة13 الموصوفة سابقاً لمراقبة صورة الفلورة المناعية، والاكتساب، وتحديد الكم، وتحليل الإشارات المتبقية من EYFP-CENP-A في السنترومير.
  6. تنفيذ عملية الحصول على الصور ومعالجتها بما في ذلك فك التكوير، وتحديد الكم، والتحليل باستخدام البرامج A أو البرامج B1 و B2 (انظر جدول المواد). اختياريا استخدام برامج C1-C3 (انظر جدول المواد)لمجهر المسح الضوئي ليزر confocal.
    ملاحظة: راجع 2.6.1 في ملفات ترميز تكميلية لكافة الأوامر المستخدمة في البرنامج A. انظر 2.6.2 في ملفات الترميز التكميلية لكافة الأوامر المستخدمة في البرامج B1 و B2.

3. مستعمرة مُقايسات النمو باستخدام pBabe-EYFP-CENP-A بعد عدوى فيروس الرجعية-Cre

ملاحظة: سبب إجراء هذا الفحص هو مقارنة صلاحية الخلية بين EYFP-CENP-A WT و K124R متحولة بعد تعطيل CENP-A-/F الأليل بواسطة Cre إعادة الكومبينيز (بعد استبدال إجمالي البروتين الخلوي CENP-A).

  1. الفيروس الرجعية transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد.
    1. تنفيذ العدوى بالفيروسة الرجعية للخلايا CENP-A-/F RPE-1 كما هو موضح في القسم 1. الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين ستربتوميسين لمدة 72 ساعة بعد عدوى الفيروس.
    2. بعد ثلاثة أيام من عدوى الفيروس الرجعية من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّاد (في اليوم 6)، إضافة blasticidin S (10 ميكروغرام/مل) في الآبار التي تحتوي على الخلايا العابرة لعدوى لاستخدامها في مقايسات مستعمرة خارج والسيطرة التجارب. تزرع الخلايا على الأقل بعد 14 يوما من عدوى الفيروس في وجود blasticidin S. تغيير المتوسطة التي تحتوي على blasticidin S كل 5 أيام.
      ملاحظة: إذا وصلت الخلايا إلى حوالي 80٪ التقاء قبل البذر للملمع مستعمرة (3.2.7. و 3.2.8)، مرور الخلايا في 1:2 و 1:5 نسبة عن طريق التربسيني والطلاء في لوحة ثقافة 6 جيدا.
    3. جمع الخلايا للطخة الغربية في اليوم 7 لتأكيد التعبير البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A يبني دون عدوى كري. إجراء تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في القسم 4. وتظهر النتائج في الشكل 1B (الممرات 1-4).
    4. لمستعمرة مقايسة مع عدوى فيروس Cre، والحفاظ على الخلايا التي تنمو لمدة 14 يوما بعد عدوى الفيروس في وجود blasticidin S (أي، تنمو الخلايا في blasticidin S التي تحتوي على المتوسطة حتى يوم 17 للنتائج المقدمة هنا).
  2. عدوى فيروس الرجعية كري من pBabe-بورو-كري
    ملاحظة: يوم 0 في الخطوة 3.2.1 يتوافق مع يوم 13 من في المقطع 3.1.
    1. يوم 0 إلى يوم 3: تنفيذ transfection الفيروسة الرجعية من CENP-A -/F RPE-1 الخلايا باستخدام pBabe-puro-Cre (B3027) كتعبير plasmid (انظر القسم 1 للحصول على التفاصيل). تأكد من إضافة البلاستيسيدين S (10 ميكروغرام/مل) في الوسط المُزَمِر.
    2. اليوم 4: الخلايا التربسينيزي لفصله عن لوحة. لوحة 500 أو 5000 خلية في ثلاث ية في لوحة ثقافة 6-جيدا. الخلايا في DMEM الثقافة: F12 المتوسطة مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين.
    3. اليوم 5: إضافة blasticidin S (10 ميكروغرام / مل) إلى الوسط ثقافة. ل5000 أو 500 خلية ' الطلاء, حدد الخلايا مع blasticidin S (10 ميكروغرام / مل) 3-24 يوما (حتى اليوم 14 في [3.2.7]) أو 3-28 يوما (حتى يوم 18 في [3.2.8]) بعد عدوى الفيروس من الانشاءات (pBabe-EYFP-CENP-A الانشاءات).
      ملاحظة: في هذه المستعمرة مُقايسة النمو، يتم إضافة transfection من pBabe-puro-Cre جنبا إلى جنب مع transfection من pBabe-EYFP-CENP-A. يتم تنفيذ نقل pBabe-EYFP-CENP-A في 3.1. يتم تنفيذ transfection من pBabe-puro-Cre في 3.2.1.
    4. اليوم 10 (7 أيام بعد عدوى فيروس الرجعية كري): جمع الخلايا لتحليل النشاف الغربية لتأكيد استنفاد البروتين من CENP-A الذاتية بعد عدوى فيروس الرجعية-كري و/ أو تعبير البروتين من pBabe-EYFP-CENP-A يبني في نفس اليوم 10.
    5. تنفيذ النشاف الغربية كما هو موضح في القسم 4 في نفس اليوم 10. وتظهر النتائج في الشكل 1B (الممرات 5-7).
    6. إجراء تحليل مناعي (القسم 2 أعلاه) للتأكد من أن كل من EYFP-CENP-A WT وK124R المترجمة إلى centromere 7 أيام بعد تعطيل CENP-A 1000 endnp المتبقية. وتظهر النتائج في الشكل 1C-1E.
    7. اليوم 14: أداء مقايسة المستعمرة خارج مع لوحة بذر مع 5000 الخلايا. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة في الميثانول وصمة عار لمدة 10 دقيقة في حل البنفسجي الكريستال (2.3٪ البنفسجي الكريستال، 0.1٪ أوكسالات الأمونيوم، 20٪ الإيثانول (انظر الشكل 2B). عد عدد المستعمرات باستخدام برنامج OpenCFU (انظر الشكل 2C).
    8. اليوم 18: استخدام لوحة بذر مع 500 خلية. إصلاح وخلايا البقع كما هو موضح في الخطوة 3.2.7 (انظر الشكل 2B). عد عدد المستعمرات (انظر الشكل 2C).

4. الغربية لطخة التحليل باستخدام pBabe -EYFP-CENP-A

ملاحظة: راجع الطريقة13 الموصوفة سابقاً لتحليل البقعة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها في الشكل 1B والشكل 2A وجدول المواد للبروتينات EYFP-CENP-A. Table of Materials

  1. عزل البروتينات عن طريق lysing الخلايا المزروعة مع عدوى فيروس مختلف. ثم، استخدام 20 ميكروغرام من البروتين في بئر واحد من هلام صفحة SDS. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF كما هو موضح سابقا13.
  2. غسل الغشاء 3x بعد الاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية. كشف وتحليل نطاقات البروتين على الغشاء مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء و / أو التصوير chemiluminescence للكشف عن المناعة. وتظهر هذه النتائج في الشكل 1B والشكل 2A.
    1. للحصول على نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء للكشف عن وتحليل نطاقات البروتين، راجع الخطوة 4.2.1 في ملفات التشفير التكميلية.
    2. استخدم مصوّر chemiluminescence للكشف عن نطاقات البروتين وتحليلها، راجع الخطوة 4.2.2 في ملفات التشفير التكميلية. لهذا النظام، استخدم الركيزة chemiluminescent (ECL) الحساسة للغاية(جدول المواد).
    3. اختياريا، استخدم لطخة الغربية تجريد العازلة لتجريد من الأجسام المضادة قبل المحتضنة من غشاء PVDF و reblot مع الأجسام المضادة المختلفة لدور المقبل من التحليل الغربي. تحديد تجريبيا الوقت الأمثل الحضانة ودرجة الحرارة لاستخدامها.

5. خلية الثقافة، transfection، وفي vivo في كل مكان مقايسات باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A

ملاحظة: مستوى البروتين من EYFP-CENP-A أعرب عن من pQCXIP-ناقلات هو ~ 10x أعلى من مستوى البروتين CENP-A الذاتية. إن استخدام هذا المتجه يسهل التحلل المناعي لكمية أعلى من بروتينات EYFP-CENP-A، ومراقبة نطاقات EYFP-CENP-A، وتحديد كل مكان للبروتين EYFP-CENP-A (EYFP-CENP-A) من خلال تحليل قياس الطيف الكتلي.

  1. Transfection لفي vivo في كل مكان مقايسات باستخدام pQCXIP -EYFP-CENP-A.
    1. البذور 36.2 × 105 CENP -A-/F RPE-1 الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم. الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، حدد تجريبيًا كثافة الخلايا التي سيتم استخدامها في البذر. إعداد ما لا يقل عن 2 أطباق لعينة واحدة مناعي (IP) للحصول على ما لا يقل عن 1 ملغ من البروتين الكلي.
    2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 18 ساعة.
    3. في 17 ساعة بعد البذر، وإعداد الكواشف transfection.
    4. جعل الحل عن طريق خلط 6.7 ميكروغرام بلازميد من كل pQCXIP-EYFP (B3252)، pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254)، pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(الجدول 1)في 335 μL من مصل متوسط مخفض، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 6.7 μg plasmid من pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) إلى جميع العينات.
      ملاحظة: يتم سرد كافة المتجهات في الجدول 1.
    5. جعل الحل B عن طريق خلط 10.1 ميكرولتر من الكواشف عبر I و II، على التوالي في 335 ميكرولتر انخفاض مصل المتوسطة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: خطوة اختيارية هي إضافة فقط 40.2 ميكرولتر مكشاف لمعالجة المعادن III (البولي ايثيلينمين [PEI]؛ 1.0 ملغ /مليلتر) في الحل B أو إضافة 40.2 ميكرولتر مكشاف 3 بالإضافة إلى كاشفات transfection I و II في الحل B(جدول المواد).
    6. مزيج الحلول A و B معا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    7. بعد غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة خليط من الحلول A و B (أي، الحمض النووي الدهون المعقدة) مباشرة إلى كل من الفردية 10 سم طبق زراعة الأنسجة التي لديها 3.35 مل μL انخفاض مصل المتوسطة.
      ملاحظة: التركيز النهائي هو 1.67 ميكروغرام / مل من البلازميد.
    8. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل4.5 h. بعد 4.5 ساعة، قم بتغيير متوسط إلى عالي الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بينسلين-ستريبتوميسين.
    9. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل 48 ساعة بعد transfection. جمع الخلايا لإعداد الخلية lysates.
  2. إعداد البروتين الخرز ملزمة مع الأجسام المضادة للجسم العالمي.
    1. خذ 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من البروتين A حبات لتفاعل واحد مناعي (IP). غسل مع A1 العازلة (جدول المواد)على الأقل 3x لإزالة EtOH، وجعل 50% حل مع A1 العازلة (20 mM تريس-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; كاملة EDTA خالية من مثبطات البروتياز كاشف).
    2. إضافة 2.0 μL من الأجسام المضادة لـ GFP (Anti#76: الأجسام المضادة محلية الصنع) إلى الخرزات المعدة أعلاه وإضافة 10x حجم A1 العازلة مقارنة مع صافي حجم الخرز.
    3. أداء تناوب من نهاية إلى نهاية في 4 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة. يجب تحديد الوقت الأمثل لدوران من نهاية إلى نهاية على أساس تجريبي على أساس كفاءة مناعي.
    4. الطرد المركزي الخرز في 100 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة غير منضم فائقة. إضافة A1 العازلة لإعادة جعل 50٪ (الخامس / الخامس) حل من الخرز. استخدم 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من هذا الحل لتفاعل واحد من IP.
  3. مناعي (IP) باستخدام البروتين خرزات sepharose ملزمة بالأجسام المضادة لـ GFP.
    1. الخلايا الLyse التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.9 في A1 العازلة بواسطة sonication وتجميد ذوبان العملية.
    2. قياس تركيزات البروتين وتطبيع كميات البروتين بين عينات IP مختلفة. إزالة 5٪ من العينة من كل أنبوب لتشغيل عينة إدخال 5٪ في SDS-PAGE.
      ملاحظة: يمكن تجميد عينة الإدخال بنسبة 5٪ في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية، إذا لم يتم تحميلها في غضون يوم واحد.
    3. مزيج بقية 95٪ lysate مع 25 ميكرولتر (50٪ v/v) من البروتين A حبات ملزمة للأجسام المضادة للجسم المضاد لـ GFP التي تم إعدادها في الخطوة 5.2. أداء تناوب من نهاية إلى نهاية في 4 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة.
      ملاحظة: يجب تحديد طول الوقت الأمثل لتناوب نهاية إلى نهاية تجريبياً.
    4. بروتين الطرد المركزي حبات مع البروتين ملزمة به (أي، مناعي) مع 100 × ز لمدة 1 دقيقة، وإزالة نابيرانت. اغسل cipcipitates المناعية مع العازلة A1 عن طريق الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 1 دقيقة.
    5. مزيج من 5٪ المدخلات وبقية 95٪ من cippreitates المناعي مع 2x و 4x SDS-PAGE تحميل العازلة14، على التوالي. يغلي هاتان العينتان لمدة 5 دقائق ثم قم بتحميلها على 10.0% denaturing SDS-polyacrylamide هلام لكهربية في الممرات المختلفة. استخدم جل SDS-PAGE أكبر (على سبيل المثال، 17 سم × 15 سم) للكهربية. إذا كانت العينات تعمل في هلام أصغر، قد لا يكون من الممكن مراقبة نطاقات واضحة /واضحة في كل مكان.
    6. إجراء تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في القسم 4 باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها في التقرير السابق8. وتظهر النتيجة في الشكل 2A.
    7. استخدام لطخة الغربية تجريد العازلة لتجريد من الأجسام المضادة قبل المحتضنة من غشاء PVDF و reblot مع الأجسام المضادة المختلفة للجولة المقبلة من تحليل البقعة الغربية.

6. قياس الطيف الشامل لتحديد موقع في كل مكان من EYFP - CENP - K124R متحولة

  1. نقل لتحاليل قياس الطيف الكتلي باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. بذور CENP-A-/F RPE-1 الخلايا في طبق ثقافة الأنسجة 10 سم. تحقق من أن كثافة الخلية هي 36.2 × 105 خلايا لكل طبق. الخلايا في علم الثقافة في DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-الستريبتوميسين. إعداد ما لا يقل عن 20 أطباق لعينة واحدة مناعية (IP)، للحصول على ما لا يقل عن 10 ملغ من البروتين الكلي (انظر 5.3).
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، تحديد تجريبيا كثافة الخلية لاستخدامها في البذر.
    2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 18 ح. إعداد الكواشف transfection ~ 23 ساعة بعد انتشار (24 نقطة ساعة هو 0 نقطة ح من transfection).
    3. في 17 ساعة بعد البذر، وإعداد الكواشف transfection وخلايا transfect كما (4.1.3). الخلايا المصابة pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) وpQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO2 ل 48 ساعة بعد transfection. جمع الخلايا لخلايا الخلايا.
    5. خلايا اللاي في A1 العازلة وإجراء المناعة كما (5.2) و (5.3). تشغيل هذين من lysitation المناعي كما يلي (6.1.6) و (6.1.7).
      ملاحظة: في (6.1.6) ، تشغيل العينة في المواد الهلامية تريس الجليسين القياسية. في (6.1.7) ، تشغيل العينة في 4 ٪ - 12 ٪ المتاحة تجاريا بروتين الهلام Bis-Tris. انظر أيضا المناقشة.
    6. احتفظ بعينة واحدة لـ 10% من إجمالي المثبطات المناعية لتأكيد EYFP-CENP-A في كل مكان ولتحديد موضع EYFP-CENP-A في كل مكان على وجه التحديد كما هو موضح في القسم 5. تشغيل هذه العينة في المواد الهلامية تريس-جليكين القياسية. تم تنفيذ SDS-PAGE ولطخة غربية كـ (5.3).
    7. احتفظ بعينة أخرى لـ 90% من إجمالي المثبطات المناعية لتحليل قياس الطيف الكتلي. تشغيل هذه العينة داخل اثنين من الآبار المتاحة تجاريا 4٪ -12٪ الهلام البروتين Bis-Tris. أداء Coomassie الأزرق تلطيخ باستخدام حل Coomassie الأزرق. مكوس وقطع منطقة هلام من 50-70 كيلوDa (المفترض أحادية UB-EYFP-CENP-A K124R المنطقة). استخدام هذه المنطقة هلام لتحليل الطيف الشامل.
  2. تحليل قياس الطيف الكتلي باستخدام الهضم في الجل.
    1. الزهر كل شريحة هلام من الفائدة في قطع صغيرة (1 مم2) ووضعها في 0.5 مل من أنابيب البروتين ملزمة منخفضة.
    2. غسل مع 100 μL 50٪ (الخامس / الخامس) الأسيتريتريل في 25 mM NH4HCO3، دوامة 10-15 دقيقة ، تدور أسفل ، والتخلص من افرنح ، كرر 3x.
    3. تركيز العينة باستخدام مقاعد البدلاء فراغ المكثف لمدة 30 دقيقة لتجفيف القطع هلام.
    4. إضافة 10 μL من 10 نانوغرام / μL تسلسل التربسين الصف والسماح لقطع هلام لإعادة الترطيب لمدة 5 دقائق.
    5. إضافة 25 mM NH4HCO3 فقط بما يكفي لتغطية القطع هلام، digest في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. نقل هضّب هضّب إلى أنبوب سيليكوني نظيف 0.65 مل. إضافة 50٪ (v/v) الأسيتونيتريل/5٪ (الخامس / الخامس) حمض الفليك (30 ميكرولتر أو ما يكفي لتغطية)، دوامة 10 دقيقة، تدور ونقلها إلى نفس أنبوب الاستخراج. كرر 3x.
    7. إضافة 10 ميكرولتر الأسيتونيتريل إلى القطع هلام, دوامة 5 دقيقة, وتدور إلى أسفل. نقل المُنَاَع إلى نفس الأنبوب.
    8. تركيز العينات باستخدام تركيز فراغ benchtop إلى 2 ميكرولتر، إضافة 8 ميكرولتر 3٪ (الخامس / الخامس) الأسيتونتريل /2٪ (v/v) حمض الفليك إلى العينة، دوامة لمدة 15 دقيقة، وتدور في 16،000 س ز لمدة 30 دقيقة. العينات جاهزة لتحليل الطيف الشامل.
    9. إجراء عملية الحصول على بيانات MS باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل(جدول المواد)بالإضافة إلى أداة قياس الطيف الكتلي (جدول المواد).
    10. حقن 8 ميكرولتر من عينة المعاد تشكيلها على مسار لوني السائل المرحلة العكسية (RPLC) العمود.
    11. فصل الببتيدات مع 2-80% التدرج من المذيب B في 60 دقيقة. تأكد من أن التدرج يتكون من نسبة متزايدة من المذيب B من 2٪ إلى 22٪ في 40 دقيقة، 22٪ إلى 35٪ المذيب B في 12 دقيقة، ثم الصعود إلى 80٪ المذيب B في 4 دقائق، وأخيرا عقد في 80٪ المذيب B لآخر 4 دقائق.
      ملاحظة: المذيب A يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك و 2٪ الأسيتونيتريل، المذيب B يحتوي على 0.1٪ حمض فورميك و 98٪ الأسيتريتريل. وتظهر جميع التركيزات على أنها وحدة تخزين/حجم.
    12. جمع بيانات قياس الطيف الكتلي باستخدام وضع الاكتساب المعتمد على البيانات. باختصار، جمع أطياف التصلب العصبي المتعدد في 350-1500 م / z ل250 مللي ثانية حدد أعلى 50 السلائف المكثفة مع تهمة 2-5 لمزيد من التفتت. جمع أطياف MS /MS في 100-2000 م / z ل 100 مللي ثانية، استبعاد الأيونات السلائف من إعادة اختيار لمدة 15 ثانية.
    13. للبحث عن قاعدة البيانات، افتح البرنامج التجاري (راجع جدول المواد)لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي على سطح المكتب.
    14. لإجراء بحث جديد، انقر على زر"LC"في القائمة العلوية. ثم انقر فوق "إضافة" زر لتحميل الأصلي MS ملفات البيانات الخام.
    15. حدد "معرف البروتين البشري" في " طريقةالمثل" كأسلوب البحث في قاعدة البيانات. البحث في ملفات البيانات الأولية MS الأصلي مقابل قاعدة بيانات UniProt Homo Sapiens (التي تحتوي على 160,566 تسلسل, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. تعيين المعلمات البحث على النحو التالي: حدد التربسين كما انزيم الهضم، والسماح لما يصل إلى 3 الانقسامات المفقودة، 4 تعديلات و 2-5 التهم لكل الببتيد. تعيين خطأ الكتلة تصل إلى 20 جزء في المليون للبحث الأول، و 0.02 Da للأيونات المجزأة. تحديد عتبات معدل اكتشاف زائف (FDR) للبروتين والببتيد ومواقع التعديل أقل من 1٪. تعيين كافة المعلمات الأخرى في البرنامج إلى القيم الافتراضية (انظر الشكل 3 لتحليل قياس الطيف الشامل).
    17. انقر على الزر "حفظ باسم" على يمين القائمة العلوية، وحدد مجلدا لتخزين نتائج البحث، وأدخل اسم البحث وانقر على "حفظ" زر.
    18. انقر على الزر "معالجة" على يمين القائمة العلوية لبدء البحث. بعد انتهاء البحث، سيتم تخزين البيانات التي تحتوي على اسم البحث الذي تم إدخاله تلقائيًا في المجلد المحدد. يمكن فتح البيانات بسهولة بواسطة برنامج F.
    19. للحصول على أطياف MS/MS لأي ببتيد معين، انقر نقراً مزدوجاً فوق نتائج البحث لفتحه بواسطة Software F. أولا، انقر فوق البروتين في قائمة البروتين في الجزء العلوي من القائمة، ثم انقر فوق الببتيد في منتصف القائمة. يتم عرض MS / MS من هذا الببتيد في الجزء السفلي من القائمة.
    20. لتصدير وحفظ أطياف MS/MS، انقر بزر الماوس الأيمن فوق أطياف MS/MS في أسفل القائمة، وحدد نسخة ثم لصقها في ملف مناسب مثل تنسيق PPT أو doc.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

EYFP-CENP-A K124 متحولة يظهر في كل مكان، والتفاعل مع HJURP، وليس هناك عيوب في توطين centromere لا الفتك الخلية. هنا تم إعادة تشكيل النظام الذي أبلغ عنه Fachinetti et al. (2017)6: في خلايا الإنسان diploid (RPE-1) التي تحمل واحدة تعطلت وواحدة ''floxed'' CENP-A أليل(CENP-A-/F),تم التعبير عن EYFP-CENP-A من ناقل الفيروس الرجعي pBabe-FP. في هذا النظام، يمكن أن تتعطل التعبير عن CENP-A الذاتية من CENP-A-/F أليل من قبل إعادة الكومبينيز

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا وصفنا طرق تحليل القياس الطيفي الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن وضع العلامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. في نتائجنا، نجحنا في تحديد في كل مكان على lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R، وهذا هو المقابلة لايزين 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل قياس الطيف الشامل. تحليل قياس الطيف الشامل الموصوف هنا هو أسلوب تقليد كما سبق لنا تحديد lysine 124 (K124) موقع في كل مكان من CENP-A WT-العلم12. لذلك، ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر تشاو جون لي في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، جامعة نانجينغ لتحليل القياس الطيفي الكتلي. نشكر يانميني دلال، وتاتسو فوكاغاوا، والباحثين الحاليين في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، وجامعة نانجينغ ومعهد أبحاث سرطان الأطفال في غريهي على مناقشتهم المفيدة، والتوجيه التجريبي، والكواشف. نشكر دون و. كليفلاند، دانييلي فاشينيتي، يانميني دلال، مينه بوي، غوستافو دبليو ليون، جون طومسون، لورانس س. كيرشنر، عمروتا أشتيكار، بن إي بلاك، غلينيس أ. لوجسدون، كينجي تاغو، وداون س. تشاندلر على هداياهم السخية من الكواشف. وقد تم دعم Y.N. من قبل مقاطعة جيانغسو 'مزدوجة - من الدرجة الأولى' صندوق البناء ، صندوق العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (SBK2019021248)، ومقاطعة جيانغسو 16th ستة صندوق قمم المواهب الكبرى (TD-SWYY-001)، مقاطعة جيانغسو "برنامج المواهب مائة الخبراء الأجانب" صندوق (SBK2019010048)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970665). وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل NCI منحة R21 CA205659.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > موازين / أدوات < / قوي > 0.5
مل بروتين أنابيب ربطمنخفضة Eppendorf022431064لتحليل قياس الطيف الكتلي
طبق ثقافة الخلايا 10 سمBIOFIL / JET ، الصين700224طبق زراعة الأنسجة 10 سم (مختبر Yohei ، PN63)
6 مجموعة ثقافة خلايا الآبارفيشر / كورنينج إنكوربوريتد07-200-83ثقافة 6 آبار لوحة
CentriVapLABCONCO-Benchtopمكثف فراغ للببتيدات الجافة الفراغية لتحليل قياس الطيف الكتلي
ChromXP C18CL ، 120A ، 15 سم × 75 & mEksigent Technologies805-00120عمود الكروماتوغرافيا السائلة (RPLC) لتحليل قياس الطيف الكتلي
HCX PL APO 100x عدسة غمر الزيتLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X عدسة غمر الزيت
HCX PL APO 63x عدسة غمر الزيتLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X عدسة غمر الزيت
Immobilon-FL PVDF غشاء نقلEMD MilliporeIPVH00010للبقعة الغربية
Leica DM IRE2 مجهر مضان بمحركاتLeicaمضان
Leica EL6000 مصدر ضوء مدمجLeicaمصدر ضوء خارجي لإثارة الفلورسنت
الغطاء الصغير (22 مم × 22 مم)زجاج الغطاء الجراحي105(22 مم × 22 مم)
موديل V16-2 جهاز الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميدApogee Electrophorese / CORE Life Sciences31071010جهاز الرحلان الكهربائي للهلام I لتطبيق نظام
كروماتوغرافيا سائلnanoLC.2DEksigent Technologiesلتحليل
NuPAGE 4٪ -12٪ Bis-Tris ProteinGels Thermo FisherNP0335BOXالمواد الهلامية البروتينية Bis-Tris المتوفرة تجاريا بنسبة 4٪ -12٪ لتحليل
قياس الطيف الكتليأوليمبوس FLUOVIEW FV3000 مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرأوليمبوسمجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (تنزيلات https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ / # !dlOpen = ٪ 23 detail847250519)
CCD ORCA-R2 DegitalCCD HamamatsuC10600-10BCCD
PAP PenBinding SiteAD100.1لحاجز طارد للماء في أنسجة تلطيخ الفلورسنت المناعي
أطباق الثقافة 10 سمVWR25382-166طبق زراعة الأنسجة 10 سم
الرحلان الكهربائي العمودي لتشغيل الجل (حجم كبير)Junyi ، الصينJY-SCZ6 +جهاز الرحلان الكهربائي II لتطبيق جل SDS-PAGE أكبر (مختبر Yohei ، PE23)
VWR Micro Slides ، FrostedVWR International48312-013شرائح صغيرة
<قوية > الأجسام المضادة الأولية < / قوية>
الأجسام المضادة المضادة CENP-AStressgen / Enzo Life SciencesKAM-CC006الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر
المضاد للجسم المضاد CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01Pالجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر
المضاد ل GAPDHABCAMab37168الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة
المضادة GAPDHInvitrogenPA1987الأرانب الأجسام
المضادة متعددة النسيلةالأجسام المضادة المضادة ل GFPANTI # 76 (الجسم المضاد محلي الصنع)الأرانب متعدد النسيلة الجسم
المضاد ل HA (3F10)Roche11815016001الجرذ الأجسام المضادة أحادية النسيلة
المضادة HJURPProteintech Group15283 & ndash ؛ 1-APالأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة
المضادة ليوبيكويتينبيثيل مختبراتA300-317A-1الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة
<قوية > الكواشف < / قوية >
Bio-Rad فحص البروتينBio-Rad500-0006كاشف فحص البروتين التجاري الأول لقياس تركيز البروتين (متوافق مع 0.1٪ SDS)
برانسون سونيفاير 450سونيكاتور
برانسون الموجات فوق الصوتية سونيكاتور Microtip خطوة ، صلبة ، مترابطة 9.5 ممVWR Scientific Products Inc.33995-325بوق الاضطراب للصوتنة
برانسون الموجات فوق الصوتية سونيكتور Microtip مدبب 6.5 ممVWR المنتجات العلمية Inc.33996-185Microtip
للصوتنة عازلة A1-20 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ؛ 50 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 0.5٪ Nonidet P-40 ؛ 0.5٪ ديوكسيكولات ؛ 0.5٪ SDS ؛ 1 ملي مولار EDTA ؛ كاشف مثبط البروتياز الخالي
EDTA كامل كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche11-873-580-001كاشف مثبط البروتياز الخالي من EDTA الكامل للمخزن المؤقت A1
Coomassie أزرق لامع R-250BBI علومالحياةCAS 6104-59-2محلول Coomassie الأزرق لتحليل قياس الطيف الكتلي
محلول بنفسجي بلوري (2.3٪ بنفسجي بلوري ، 0.1٪ أوكسلات أمونيوم ، 20٪ إيثانول)SigmaI-AldrichHT90132-1Lلتلوين المستعمرة
DAPISIGMA-SLDRICHD9542للتلوين النووي
DMEM: F12 متوسطATCC30-2006DMEM: مصل الأبقار الجنيني المتوسط F12
، معتمد ، الحرارة معطل ، من أصلأمريكي Life Technologies / Gibco10082FBS (مصل الأبقار الجنينية)
DMEM عالي الجلوكوز (Dulbecco' s النسر المعدل s متوسط)تقنيات الحياة / BioWhittaker12-604عالية الجلوكوز DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies / كاشف التعداء InvitrogenL3000I للتعداء الكيميائي
Lipofectamin 3000 ، حل P3000Life Technologies / كاشف التعداء InvitrogenL3000II لتثبيت
الميثانولفيشرA412-4
مجفف خالي من الدسم (بديل معتمد للحليب المجفف بالقرنفل)NC9255871 فيشر العلمي(إعادة الطلب رقم 190915; Lot # 90629)الحليب الخالي من الدسم
Opti-MEM ILife Technologies / Invitrogen31985وسائط مصل مخفضة
p-phenylenediamineSIGMA-SLDRICHP6001لتركيب البنسلين المتوسط
، الستربتومايسين ؛ سائلفيشر / جيبكو15-140البنسلين ستربتومايسين
بولي إل ليسين محلولسيجما سلدريتشص 8920بولي إل ليسين ، 0.1 ٪ وزن / حجم ، في الماء
البولي إيثيلين إيثيلين [جزيرة الأمير إدوارد] ؛ 1.0 مجم / ملبولي ساينس23966 & - نيويورك ؛ 2كاشف التعداء III للتعداء الكيميائي
البروتين A سيفاروز CL-4B حباتGE Healthcare / Amersham17-0963-03حبات البروتين A سيفاروز CL-4B لمقايسات الانتشار في الجسم الحي باستخدام pQCXIP-EYFP-CENP-A
استعادة اللطخة الغربية تجريد العازلةالحرارية العلميةPI21059لطخة الغربية العازلة I
تسلسل درجة التربسينPromegaV5111لتحليل قياس الطيف الكتلي
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo34095ركيزة فائقة الحساسية المعززة للكيمياء (ECL)
UltraPure DistilledWater Life Technologies / Invitrogen / Gibco10977زراعة الأنسجة المعقمة درجة المياه
Western Blot Stripping Buffer II ((50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 6.85 ؛ 2٪ SDS ؛ 50 ملي مولار DTT ؛ 100 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول)--Western Blot Stripping Buffer II
قوي > الأجسام المضادة الثانوية < / قوي>
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgGLife Technologies / InvitrogenA11008المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب) Alexa
Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies / InvitrogenA11005الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور (الجسم المضاد الثانوي المنقى بالتقارب)
<قوي>البرامج< القوي>
برنامج FV31S-SWأوليمبوس-سوفيرC1 (تنزيلات https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ / # !dlOpen = ٪ 23detail847250519)
برنامج تحليل FV31S-DTأوليمبوس-Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ تنزيلات / #!dlOpen = ٪ 23detail847250519)
برنامج cellSens Dimension الإصدار 1. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ برنامج / cellenss /)
برنامج تحليل استوديو الصور الإصدار 4.0LI-COR Biosciences-SoftwareD
التصوير الجزيئي Versadoc MP4000 نظامBio-Rad-جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي للكشف عن اللطخة المناعية
نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey CLx نظام التصوير بالأشعة تحتLI-COR Biosciences-نظامالتصوير بالأشعة تحت الحمراء للكشف عن اللطخة المناعية
OpenCFU saftware-لعد المستعمرات (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab الإصدار 5.5.2. برنامج التصوير العلميعدم توفير / PerkinElmer-SoftwareA
ProteinPilot الإصدار 4.5AB SCIEX-SoftwareF لتحليل قياس الطيف الكتلي
الكمية برنامج تحليل واحد 1-DBio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-MassSpectrometry
Volocity الإصدار 6.3 برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد (اكتساب Volocity)برنامج PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity الإصدار 6.3 برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد (القياس الكمي للحجم)PerkinElmer-SoftwareB2
مجهر زجاج SDS-PAGE قياس الطيف الكتلي كاميرا كاميرا من حليب < الجسم الاستحواذ على الحمراء

المراجع

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحديد عملية اليوبيكويتينبروتوكول الترسيب المناعيتحليل LC-MS/MSطريقة استئصال الهلامالهضم بالتريبسينحبيبات البروتين Aجسم مضاد لـ GFPهوية السنترومير
تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.