يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير في الوقت الحقيقي من الهجرة الناجمة عن CCL5 من الخلايا الجذعية الهيكل العظمي البيريوستال في الفئران

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61162

⸱

سبتمبر 16, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Center for Skeletal Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول الكشف عن هجرة الخلايا الجذعية المحيطة بالهيكل العظمي المحيطي بوساطة CCL5 في الوقت الفعلي باستخدام المجهر الحيواني الحي داخل الحتمية.

الملخص

الخلايا الجذعية الهيكلية البيريوستية (P-SSCs) ضرورية لصيانة العظام وإصلاحها مدى الحياة، مما يجعلها محورا مثاليا لتطوير العلاجات لتعزيز شفاء الكسور.  الخلايا البيريوستية تهاجر بسرعة إلى إصابة لتوريد chondrocytes جديدة والعظام للشفاء كسر. تقليديا، فعالية السيتوكين للحث على هجرة الخلايا قد أجريت فقط في المختبر عن طريق إجراء فحص ترانسويل أو الصفر. مع التقدم في المجهر داخلفيتال باستخدام الإثارة متعددة الفوتون، تم اكتشاف مؤخرا أن 1) P-SSCs التعبير عن الجين المهاجر CCR5 و 2) العلاج مع ccR5 ligand المعروفة باسم CCL5 يحسن شفاء الكسور وهجرة أجهزة الكمبيوتر الخاصة استجابة لCCL5. وقد تم التقاط هذه النتائج في الوقت الحقيقي. وصف هنا هو بروتوكول لتصور P-SSC الهجرة من الخلايا الجذعية الهيكل العظمي خياطة الجلجلة (SSC) المتخصصة نحو إصابة بعد العلاج مع CCL5. البروتوكول تفاصيل بناء ضبط النفس الماوس وتركيب التصوير، وإعداد الجراحية من كالفاريا الماوس، تحريض عيب calvaria، والحصول على التصوير الفاصل الزمني.

المقدمة

إصلاح الكسور هو دينامية، عملية متعددة الخلايا التي تختلف عن نمو الهيكل العظمي الجنيني وإعادة عرض. خلال هذه العملية ، يتبع تحريض إشارات الإصابة من الأنسجة التالفة التوظيف السريع ، والانتشار ، والتمايز اللاحق للخلايا الجذعية / السلف الهيكلية ، والتي تعتبر كلها حاسمة للاستقرار العام لتثبيت الكسور1. على وجه الخصوص، المراحل المبكرة من شفاء الكسور تتطلب تشكيل كالوس لينة، والتي تعزى أساسا إلى الخلايا المقيمة في الخلايا الفرجية2. عندما تصاب العظام، تستجيب مجموعة فرعية من الخلايا المحيطة بالخلايا المحيطة بالخلايا بسرعة وتساهم في وسيطات الغضاريف وخلايا العظام المتباينة حديثا داخل callus3، مما يعني وجود مجموعة خلايا جذعية/ذرية متميزة داخل المحيط. لذلك، فإن تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية الهيكل العظمي المقيمين في المحيط (SSCs) تشكل نهجا علاجيا واعدا لأمراض العظام التنكسية وعيوب العظام4.

ويعتقد أن SSCs يقيمون في مواقع متعددة من الأنسجة، بما في ذلك نخاع العظام. وعلى غرار نخاع العظم، تم أيضا تحديد مركبات الكربون الهيدروفلورية/التشوندروجينية في الحضيض 4،5،6.  يمكن تسمية هذه SSCs periosteal (P-SSCs) بعلامات النسب المتوسطة المبكرة (أي Prx1-Cre5 و Ctsk-Cre7 و Axin2-CreER8) أثناء نمو عظم الجنين 4،7،8،9،10. وهناك قيد كبير على هذه النماذج تتبع النسب الوراثي واحد هو أن هناك تغاير كبير داخل مجموعات الخلايا المسمى. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تستطيع التمييز بين الشركات الخاصة السمية وذرتها في الجسم الحي. لمعالجة هذا القيد، قمنا مؤخرا بتطوير ماوس مراسل مزدوج (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) لتصور P-SSCs بوضوح من نخاع العظم SSCs (BM-SSCs)11. مع هذا النموذج، فقد تقرر أن P-SSCs تتميز Mx1 + αSMA + الوسم المزدوج، في حين أن أكثر تمايزا Mx1 + الخلايا الموجودة في نخاع العظام، والأسطح الداخلية والبريوستية، والعظام القشرية والترابية11،12.

ومن المعروف أن السيتوكينات المتعددة وعوامل النمو لتنظيم إعادة عرض العظام وإصلاحها، وقد تم اختبارها لتعزيز إصلاح الهيكل العظمي في عيوب الجزء الحرج1,13. ومع ذلك ، بسبب التعقيد الخلوي لنماذج الإصابات الناتجة عن تعطيل الحاجز المادي لمقصورة العظام ، فإن الآثار المباشرة لهذه الجزيئات على هجرة P-SSC الذاتية والتنشيط أثناء الشفاء غير واضحة. غالبا ما يتم تقييم الخصائص الوظيفية وديناميكيات الهجرة في مراكز دعم البرامج في المختبر من خلال إجراء فحص عبر أو خدش ، بالإضافة إلى السيتوكينات أو عوامل النمو المعروفة بالحث على الهجرة في مجموعات الخلايا الأخرى. وبالتالي، فإن تفسير نتائج هذه التجارب المختبرية لتطبيقها في نظمها الحية المقابلة له أمر صعب. وفي الوقت الراهن، لا يلاحظ عادة في الوقت الحقيقي في التقييم الحي لهجرة الخلايا الجذعية/السلف الهيكلية؛ بدلا من ذلك، يتم قياسه في النقاط الزمنية الثابتة بعد الكسر5،7،14،15،16.

والقيود المفروضة على هذه الطريقة هي أن الهجرة لا تقيم على مستوى خلية واحدة؛ بل إن الهجرة لا يمكن أن تكون كذلك. بدلا من ذلك، يتم قياسه عن طريق التغيرات في مجموعات الخلايا. بسبب التقدم الأخير في المجهر الحيواني الحي داخل الجسم وتوليد فئران مراسل إضافية ، أصبح تتبع الخلايا الفردية في الجسم الحي ممكنا الآن. باستخدام المجهر الحيواني الحي داخل الفيتية ، لاحظنا الهجرة المتميزة ل P-SSCs من مكان خياطة الجلفاريا إلى إصابة العظام في غضون 24-48 ساعة بعد الإصابة في فئران Mx1/Tomato/αSMA-GFP.

وقد تم مؤخرا تحديد CCL5/CCR5 كآلية تنظيمية تؤثر على التوظيف والتنشيط P-SSCs خلال الاستجابة المبكرة للإصابات. ومن المثير للاهتمام أنه لم يتم الكشف عن هجرة كبيرة من جانب لجنة الطوارئ الخاصة استجابة لإصابة في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فإن علاج الإصابة مع CCL5 ينتج هجرة قوية ومتميزة اتجاهيا ل P-SSCs ، والتي يمكن التقاطها في الوقت الفعلي. ولذلك، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير منهجية مفصلة لتسجيل الهجرة في الجسم الحي من P-SSCs في الوقت الحقيقي بعد العلاج مع CCL5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في كلية بايلور للطب (IACUC).

1. إعداد الماوس

  1. عبر Mx1-Cre17 وRosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (توم)18 الفئران (التي تم شراؤها من مختبر جاكسون) مع الفئران αSMA-GFP (المقدمة هنا من قبل Drs. إيفو Kalajzic وهنري كروننبرغ) لتوليد Mx1 - كري + Rosa26 - الطماطم + α SMA - GFP + (Mx1 / الطماطم / αSMA - GFP) مراسل الفئران (الشكل 2A).
  2. بالنسبة لتحريض Mx1-Cre ، قم بحقن الفئران ب 25 ملغم / كجم pIpC كل يومين لمدة 10 أيام.
  3. تشعيع الفئران مع 9.5 غي 1 قبل يوم من زرع الوريد من 1 × 106 خلايا نقي العظم كله أحادية نووية من الفئران البرية C57BL/6 (WT-BMT)19.
  4. بعد 6 إلى 8 أسابيع من التعافي ، تخضع الفئران للتصوير في الجسم الحي لبروتوكول هجرة الخلايا المحيطة بالخلايا الموصوفة أدناه.
    ملاحظة: الإشعاع وWT-BMT من الفئران Mx1-Cre ضرورية للقضاء على خلايا الدم الذاتية Mx1 المسمى التي قد تستجيب لإصابة. بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من التشعيع ، يبلغ عدد خلايا الورم الدموي للمضيف <5٪ وبالتالي فهو جاهز للتصوير19.

2. ضبط النفس الماوس وتركيب التصوير

  1. إنشاء ضبط النفس الماوس مع أنبوب مخروطي 50 مل (الشكل 1A).
    1. باستخدام مقص مدببة، كزة حفرة من خلال الجزء السفلي من مخروطية. قطع من الحفرة السفلية إلى أعلى مخروطية (الجانب قطع سيكون الجزء العلوي من ضبط النفس).
    2. جعل قطع ما يقرب من 4-5 سم موازية طويلة لقطع السابقة وفي منتصف الطريق إلى أسفل (~ 2 سم) من أعلى ضبط النفس. إزالة هذا القسم من مخروطية وسلسة حواف كانت ضرورية.
  2. بناء أنبوب مخروطي جبل التصوير باستخدام لوحة زاوية قابل للتعديل، وظيفة بصرية 0.5 بوصة، والمشبك الزاوية اليمنى ل0.5 "آخر، 0.1875" هيكس (الشكل 1B وجدول المواد).
    1. ضبط لوحة الزاوية إلى زاوية 35 درجة. على الجانب الأيسر من لوحة الزاوية، المسمار آخر البصرية في الحفرة الثانية من الجزء الخلفي من لوحة.
    2. على الجانب الأيمن من لوحة قابل للتعديل، إدراج الربيع محملة 0.1875 "هيكس قفل 0.25"الإبهام في الحفرة الثانية من الجبهة والثقوب الأخيرة على لوحة. سيتم استخدام المشبك الزاوية اليمنى مع آخر البصرية لتأمين ضبط النفس الماوس مخروطية في مكان.

3. إجراء العمليات الجراحية قبل الجراحة

  1. تخدير الفأر
    1. لإدارة الألم، حقن الماوس تحت الجلد مع البوبرينورفين الإفراج المستمر (1 ملغم / كغ BW) 30-60 دقيقة قبل الجراحة.
    2. تخدير الفئران باستخدام القوارض الثالث CCM الجمع (التحرير والسرد الثالث) التخدير التي تحتوي على 37.5 ملغ / مل الكيتامين, 1.9 ملغ / مل xylazine, و 0.37 ملغ / مل acepromazine. الجرعة المناسبة للفئران هي 0.75-1.50 مل لكل 1 كجم من وزن الجسم. الجرعة سوف تستمر 30-45 دقيقة.
    3. بمجرد تخدير الفأرة، ضعي مرهم العيون على العينين بمسحة قطنية معقمة لمنع جفاف العين.
    4. للتصوير على المدى الطويل (>45 دقيقة)، إدارة التخدير مرة أخرى للحفاظ على عمق مخدر السليم على النحو التالي.
      1. إعداد حقنة 1 مل مع كمية كافية من التحرير والسرد الثالث للحفاظ على التخدير لمدة التصوير المخطط لها (0.75 مل / كجم BW لكل 30 دقيقة من التخدير الإضافي). إرفاق ضخ إبرة فراشة 25 غرام مجموعة مع 12 "أنابيب إلى الحقنة ودفع مخدر من خلال الأنابيب والإبرة.
      2. أدخل إبرة الفراشة intraperitoneally، ثم الشريط الإبرة في مكان.
        ملاحظة: هذه هي الطريقة التي سيتم بها إدارة التحرير والسرد الثالث الإضافي أثناء التصوير بحيث لا تكون هناك حاجة لنقل الحيوان أو تعطيل مستوى الرؤية.
    5. توفير الدعم الحراري مع وسادة التدفئة أبقى في 37 درجة مئوية طوال العملية. للتصوير المطول (>1ساعة) سيكون من الضروري دعم السوائل الإضافية.  يمكن تزويد I.P. سوائل تكميلية مع كومبو III إضافية أثناء التصوير أو 33 مل/ كغ المالحة (0.9 NaCl) تحت الجلد.
  2. ضبط النفس الماوس وإعداد موقع الجراحة
    1. استخدام المقصات لإزالة الشعر قدر الإمكان من أعلى الرأس. ضعي كريم إزالة الشعر على منطقة الحلاقة لإزالة أي شعر متبقي في موقع الجراحة.
    2. تأكد من تخدير الماوس بالكامل بسبب عدم الاستجابة لقرصات إصبع القدم. بعد 15 دقيقة، إذا لم يتم تخدير الماوس بالكامل، يمكنك إعطاء جرعة ثانية أصغر من السرد III (<0.75 مل/كجم BW).
    3. ضع الماوس في ذيل ضبط النفس أولا ، وانزلاقه بعيدا بما فيه الكفاية إلى الوراء بحيث يتدلى الأنف قليلا على حافة المخروطية.
    4. الشريط الكفوف الأمامية إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي باستخدام الشريط الطبي.
    5. ضع أنبوبا مخروطيا مع الماوس على حامل تصوير يتم ضبطه بزاوية 35 درجة وآمن باستخدام المشبك الزاوية اليمنى (الشكل 1C).
    6. مرة واحدة في الماوس هو آمن في جبل التصوير، وتنظيف موقع الجراحية 3X مع الدعك بالتناوب من فرك بيتادين والكحول isopropyl 70٪. مرة أخرى ، تأكد من أن الحيوان مخدر بالكامل.
    7. تحريك الماوس إلى لوحة ماصة نظيفة ووضع الستائر فوق الماوس لإنشاء حقل معقم كبير.

4. إجراء العمليات الجراحية

  1. فتح شق
    1. باستخدام ملقط ذو رؤوس ناعمة، التقط الجلد على الفور إلى الأذن اليمنى. مع مقص microdissection، وقطع الجلد الذي عقد من قبل ملقط.
      ملاحظة: بدء الشق باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه يخلق شق مستديرة التي هي أكثر ملاءمة لخياطة بعد الإجراء.
    2. إجراء شق عرضي بدءا من الشق الأولي نحو الأذن اليسرى (<1 سم).  إجراء شق آخر، بدءا من الشق الأولي، نحو أنف الحيوان (~ 2-3 ملم الماضي العين اليمنى).
    3. فصل الجلد من periosteum باستخدام ملقط ومقص لقطع بلطف من خلال النسيج الضام فصل الجلد من periosteum calvaria.
    4. باستخدام مسحة قطنية معقمة، ضعي بعض مرهم العيون على الجزء العلوي من رفرف الجلد.  التقط رفرف الجلد برفق وأطوه على العين اليسرى. يجب أن يكون تقاطع الغرز القوسية والإكليلية مكشوفا بوضوح (الشكل 1E).
      ملاحظة: يتم استخدام مرهم العيون للحفاظ على رفرف الجلد في مكانه.
    5. قم بغسل السطح المفتوح باستخدام برنامج تلفزيوني معقم لتنظيف المنطقة من أي دم وشعر متبقي.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم ملقط ذو رؤوس دقيقة لإزالة الشعر المتبقي بعد التنظيف، ولكن كن حذرا من إتلاف الغشاء المحيطي.
  2. الكسور الدقيقة
    1. لتوليد الكسور الدقيقة على الجلجلة، قم بإزالة المكبس من حقنة الأنسولين 29 G وقطع النهاية الخلفية للمحقنة، حول علامات 300-400 uL.
      ملاحظة: هذه الخطوة يجعل من السهل على المناورة تحت نطاق تشريح عند إنتاج الإصابة.
    2. ضع طرف شطبة (عرض إبرة إلى اثنين) نحو الأنف من الغرز التاجي وعرض إبرة واحدة إلى اثنتين إلى يمين خياطة القوس (الشكل 1E).
    3. تدوير بلطف حقنة في اتجاه عقارب الساعة، ثم عكس عقارب الساعة عدة مرات.
      ملاحظة: في الفئران الصغيرة، هناك حاجة إلى كمية صغيرة جدا من الضغط النزولي لإنشاء microfracture دائرية. يجب الحرص على عدم السماح الإبرة اختراق الدماغ، لأن هذا سوف يسبب النزيف وتتداخل مع التصوير.
    4. استخدم إبرة 27 G لتوسيع الكسور الدقيقة إلى ~0.4 مم. إذا بقيت شظايا العظام في الكسور الدقيقة، فامسح المنطقة باستخدام برنامج تلفزيوني. إذا كانت شظايا العظام لا تزال باقية في الكسور الدقيقة، فاستخدم إبرة 29 G لاستخراجها برفق.
    5. كرر الخطوات 4.2.1-4.2.4 لإنشاء إصابة على الجانب الأيسر من خياطة القوس.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، هناك خياران: 1) المتابعة الفورية لعلاج CCL5 (القسم 4.3) والتصوير (القسم 5)؛ أو 2) إغلاق موقع الجراحة بعد العمليات الجراحية في القسم 6. في 24 ساعة في وقت لاحق، تخدير الماوس مرة أخرى، وإعادة فتح البصر الجراحي، وعلاج الإصابة مع CCL5 (القسم 4.3)، وإجراء التصوير داخل الفيتية (القسم 5) والرعاية بعد الجراحة (القسم 6).
  3. علاج CCL5
    1. من مخزون RANTES (100 نانوغرام / مل) ، قم بحل 10 نانوغرام / مل باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي (جدول المواد). الحفاظ على هذا الحل على الجليد للحفاظ على مصفوفة في شكل سائل.
    2. علاج كل إصابة مع 2 ميكرولتر من CCL5 (10 نانوغرام / ميكرولتر) باستخدام ماصة 2-20 ميكرولتر (هذا الطرف ماصة له قطر أكبر، وهو أكثر فعالية عند استخدام سائل لزج). السماح للمصفوفة لترسيخ.
    3. بمجرد أن تتوطد المصفوفة ، قم بتغطية الجلجلة بلطف برفرف الجلد لضمان عدم جفاف الأنسجة. حضانة لمدة 1 ساعة قبل التصوير.

5. التصوير داخل الفيتال

  1. إعدادات المجهر
    1. تشغيل الليزر متعدد الفوتون (ليزر التيتانيوم والياقوت femtosecond). تعيين الطول الموجي إلى 880 نانومتر وضبط الطاقة للجيل التوافقي الثاني (SHG) التصوير (440 نانومتر) من العظام.
    2. بدوره على 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر الحالة الصلبة لإثارة GFP- و tdTomato التعبير عن الخلايا, على التوالي.
    3. قم بتشغيل كاشفات PMT (أنبوب فوتوموليلييه) للجيل التوافقي الثاني (الكشف عن 405-455 نانومتر) وإشارات GFP (الكشف عن 505-550 نانومتر). قم بتشغيل كاشف HyD 3 للإشارة إلى الطماطم (الكشف عن 590-620 نانومتر).
  2. تصاعد
    1. قبل تحريك الماوس إلى النطاق، تحقق من المستوى البصري للcalcalaria عن طريق الضغط بلطف على الجزء الخلفي من رأس الماوس. إذا لم يكن مستوى الطائرة، فاضبط الموضع بتدوير ضبط النفس بلطف على اليسار أو اليمين.
      ملاحظة: هذه خطوة هامة لضمان جودة الصورة الكافية.
    2. تطبيق معقمة 2٪ ميثيلسليلوز في الماء (ث / الخامس) لتغطية الكلفاريا كامل ورفرف الجلد ومنع تجفيف الأنسجة.
    3. ضع الماوس على مرحلة المجهر الآلية محور XYZ (الشكل 1G). باستخدام ضوء epifluorescent، محاذاة الماوس بحيث 1) أنها تواجه المجهر و 2) تقاطع الغرز التاجية ومترهل هو النقطة المرجعية مركزة من المرحلة.
    4. ضع الغطاء الزجاجي على منطقة التصوير وتحقق مرتين من المحاذاة (الشكل 1H).
  3. التصوير الفاصل الزمني
    1. استخدام عدسة التكبير منخفضة (25x هدف الغمر المياه مع NA = 0.95) لمسح calvaria. الحصول على صورة مرجعية للتقاطع القوسي والتكشير التاجي.
    2. باستخدام إشارات SHG والفلورسنت من الخلايا، حدد موقع كل مشهد إصابة وسجل إحداثيات XYZ وكذلك المسافات من الغرز القوسية والإكليلية (الشكل 2B).
    3. اختر موقعا على الغرز الإكليلية أو القوسية للتصوير طويل الأمد. خذ صورة مفصلة Z-كومة من هذه المنطقة من المرجع أثناء التصوير.
      ملاحظة: بما أن الغرز تمثل مكانة معروفة ل P-SSC ، فهذا هو المكان الذي ستهاجر منه الخلايا استجابة لإصابة الجلفاريا.
    4. استخدم إعدادات برنامج الفاصل الزمني لتسجيل صورة كل دقيقة واحدة لمدة ساعة واحدة على الأقل. في الوقت بين اللقطات، قارن حقل العرض الحالي بحقل العرض الأولي. إذا كانت مختلفة، استخدم صورة Z-المكدس لتحديد الاتجاه الذي يجب تعديل حقل العرض.

6. رعاية الحيوانات بعد الجراحة

  1. بعد التصوير، شطف الجلجلة المكشوفة مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الميثيلسليلوز.
  2. لإغلاق الشق، ضع رفرف الجلد برفق فوق الجلفاريا. استخدام مسحات القطن المعقمة لإزالة مرهم العيون المتبقية وتجفيف موقع شق.
  3. باستخدام مونوفيليمنت نايلون 5-0 حجم الغرز غير قابلة للابتصاص مع إبرة قطع عكسي C-1 المرفقة، وإغلاق الموقع الجراحي. استخدم مسحة قطنية معقمة لوضع مرهم المضادات الحيوية الثلاثي على الشق المغلق.
    ملاحظة: يتم تقليل تندب مع تقنيات خياطة عالية الجودة والحد الأدنى من النزيف.
  4. ضع الماوس في قفص نظيف على سطح دافئ وتحقق كل 15 دقيقة حتى يتم تحقيق شغل المؤخرة.
  5. إعطاء جرعة ثانية من البوبرينورفين الإفراج المستمر 72 ح بعد الجراحة.
  6. رصد يوميا لسلوك التجمهر، الفراء تكدرت، و / أو عدم وجود التملق حتى تتم إزالة الغرز (~ 1 أسبوع).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد اقترح أن يكون لدى السلف الهيكلية إمكانات للهجرة أو الدورة الدموية 20. في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء فئران مراسل Mx1-Cre +Rosa26-Tomato + α SMA-GFP + (Mx1 / Tomato / αSMA-GFP) ، والتي تم فيها تمييز P-SSCs ب Mx1 + α SMA + وضع العلامات المزدوجة (الشكل 2A ، B). حدثت هجرة كبيرة من Mx1 + α SMA + P-S...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أثناء شفاء العظام، الخلايا المحيطة بالخلايا هي المصدر الرئيسي للخلايا الشوندروسيتية والعظام المتمايزة حديثا داخل كالوس3 الإصابة. وعلى غرار نخاع العظم، تم أيضا تحديد مركبات الكربون الهيدروفلورية/التشوندروجينية في الحضيض 4،5،6. تقييم الخصائص الوظيفية P-SSC الذاتية أمر صعب من الناحية الفنية. وفي كثير من الأحيان، تقيم ديناميات الهجرة في البلدان النامية غير المفلورة في المختبر، مما يجعل تفسير ما يقابلها في الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

L.C.O. وD.P. الكشف عن براءة اختراع معلقة بعنوان "الخلايا الجذعية الهيكل العظمي Periosteal في إصلاح العظام" (BAYM. P0264US. P1). ولا يعلن المؤلفون الباقون عن أي مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة برنامج أمراض العظام في تكساس ، وجائزة صندوق كارولين وز للقانون ، وNIAMS للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز R01 AR072018 ، R21 AG064345 ، R01 CA221946 إلى D.P.  نشكر M.E. Dickinson و T.J. Vadakkan في التصوير البصري BCM وCore المجهر الحيوي ونوى التكنولوجيا المتقدمة BCM بتمويل من المعاهد القومية للصحة (AI036211 وCA125123 وDK056338).

.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
½ ” آخر بصريThorLabsTR2للتصوير جبل
1 مل حقنةBD309659
27G إبرةBD PercisionGlide305111
29G حقنة الأنسولينMcKesson102-SN05C905P
50 مل أنبوب كونيكولFalcon352098لضبط النفس
لوحة زاوية قابلة للتعديلRenishawR-PCA-5023-50-20للتصوير
مناديل الكحول المبللةCoviden6818
البيتادين المقشر الجراحيهنري شين67618-151-16
بوبرينورفين SR-LABZooPharm1 مجم / مل
كومبو الإطلاق المستدام IIIتم الحصول عليه من الطبيب البيطريغير الموجود37.6 مجم / مل كيتامين ؛ 1.9 مجم / مل زيلازين ؛ 0.37 مجم / مل أسيبرونازين
CoverslipFisher12-545-8724 × 40 ممتاز فائق الانزلاق
طرف ناعمFST11254-20
كيتامينكيتافيد50989-161-06100 مجم / مل
Leica TCS SP8MP مع DM6000CFSLeica MicrosystemsN / A
MatrigelR & D Systems344500101
شريط طبيMcKesson1001993 "× 10 ياردة (7.6 سم × 9.1 م) علوم
المجهر الإلكترونيللميثوالسليلوز19560
مقص التشريح المجهريFST1456-12
المرحلة الآليةأتمتة أنهايمN / A
حامل إبرةFST12500-12
خيوط غير قابلة للامتصاصMcKessonS913BXخيوط نايلون أحادية الشعيرات 5-0 خيوط غير قابلة للامتصاص مع إبرة قطع عكسية C-1
مرهم بصريالرجبي0536-1086-91
RANTESBiolegend59420210 & micro ؛ جم / 50 وميكرو ؛ L
المشبك الزاوية اليمنى ل ½ ؛ ” آخر ، 3/16 " HexThorLabsRA90لتركيب التصوير
محمل بنابض 3/16 بوصة قفل سداسي ¼ ؛ ” المسمارThorLabsTS25Hللتصوير
مسحات قطنية معقمةHenry Schen100-9249
معقم DPBS (1x)Corning21-030-CV
ستائر معقمةMcKessen25-517
قفازات جراحيةMcKessen3158VA
مرهم مضاد حيوي ثلاثيTaro Pharmaceuticals U.S.a.، Inc. 51672-2120-2
مجموعة جمع الدم بالمكنسةالكهربائية BDREF 36729825G مجموعة ضخ إبرة الفراشة مع أنابيب مقاس 12 بوصة
مرفقة

المراجع

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
  3. Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
  4. Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
  5. Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773(2018).
  6. Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
  7. Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
  8. Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524(2016).
  9. Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
  10. Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  11. Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
  12. Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909(2018).
  13. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
  14. Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
  15. Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
  16. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  17. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  18. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  19. Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
  20. Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
  21. Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
  22. Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CCL5 Mx1 Tomato Alpha SMA GFP
التصوير في الوقت الحقيقي من الهجرة الناجمة عن CCL5 من الخلايا الجذعية الهيكل العظمي البيريوستال في الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.