نحن وصف طريقة موثوقة لإعداد مستخلصات الخلية كاملة من الخميرة أو الخلايا الأخرى باستخدام مطحنة التجميد المبردة التي تقلل من تدهور وdenaturation البروتينات. مستخلصات الخلايا مناسبة لتنقية مجمعات البروتين الوظيفية، وتحليلات البروتيوم، ودراسات المناعة المشتركة والكشف عن تعديلات البروتين labile.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سهولة التلاعب الجيني والحفاظ التطوري القوي للآلات الخلوية eukaryotic في خميرة في مهدها Saccharomyces cerevisiae جعلت من كائن حي النموذج الوراثي البارز. ومع ذلك ، نظرًا لأن عزل البروتين الفعال يعتمد على التعطيل الأمثل للخلايا ، فإن استخدام الخميرة للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتينات الخلوية يعوقه جدار الخلية المكلف بهضم الأنزيمية (باستخدام lyticase أو zymolyase) ، ويصعب تعطيله ميكانيكيًا (باستخدام مضرب حبة تقليدي أو مطبعة فرنسية أو طاحونة قهوة) دون التسبب في تسخين العينات ، مما يسبب بدوره تذوّق البروتينات وتدهورها. على الرغم من أن طحن يدوي من خلايا الخميرة تحت النيتروجين السائل (LN2) باستخدام مدافع الهاون و pestle يتجنب ارتفاع درجة حرارة العينات ، فإنه كثيف العمالة ويخضع للتقلب في تحلل الخلايا بين المشغلين. لسنوات عديدة، ونحن قد تم إعداد بنجاح مقتطفات الخميرة عالية الجودة باستخدام cryogrinding الخلايا في مطحنة التجميد الآلي. درجة حرارة -196 درجة مئوية التي تحققت باستخدام LN2 يحمي المواد البيولوجية من التحلل بواسطة البروتيوسات والنيوكلاسيس، مما يسمح باسترجاع البروتينات السليمة والأحماض النووية والجزيئات الأخرى. هنا وصفنا هذه التقنية بالتفصيل لخلايا الخميرة الناشئة التي تنطوي على تجميد أول تعليق الخلايا في عازلة تحلل من خلال إضافة قطرة في LN2 لتوليد قطرات المجمدة من الخلايا المعروفة باسم "الفشار". ثم يتم سحق هذا الفشار تحت LN2 في مطحنة الفريزر لتوليد استخراج "مسحوق" المجمدة التي يتم إذابتها ببطء وتوضيحها عن طريق الطرد المركزي لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان. المقتطفات الناتجة جاهزة لتطبيقات المصب، مثل تنقية البروتين أو الحمض النووي، أو التحليلات البروتومية، أو دراسات المناعة المشتركة. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لإعداد استخراج الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة والأنسجة النباتية والحيوانية والعينات البحرية بما في ذلك الشعاب المرجانية ، فضلا عن عزل الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي من الطب الشرعي والعينات الأحفورية الدائم التجمد.
المقدمة
الخميرة هي كائن نموذجي شعبي لدراسات البروتين ، كما هو كائن حي بسيط eukaryotic مع وفرة من الأدوات الوراثية والكيميائية الحيوية المتاحة للباحثين1. بسبب جدار الخلية قوي، أحد التحديات التي يواجهها الباحثون هو في lysing بكفاءة الخلايا دون الإضرار محتويات الخلوية. تتوفر طرق مختلفة للحصول على مستخلصات البروتين من خلال تعطيل خلايا الخميرة التي تشمل تحلل انزيمي (zymolyase)2،3، تحلل كيميائي4، تحلل طبيعي عن طريق التجميد ذوبان5، الضغط القائم على (الصحافة الفرنسية)6،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الفشار الخميرة
- تنمو خلايا الخميرة في 0.5 لتر من وسائط YPD إلى كثافة 1 × 107 خلايا / مل. عد الخلايا باستخدام كاونتر أو أي وسيلة أخرى.
- خلايا الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2400 غرام و 4 درجة مئوية.
- غسل كل عينة مرة واحدة مع 500 مل من الجليد الباردة deionized 18 ميجا أوم ميلي Q المياه.
- الكريات ريسوسيبند في 15 مل من الجليد الباردة Lysis العازلة [20 mM HEPES-KOH pH 7.5، 110 mM KCl، 0.1٪ توين، 10٪ الجلسرين، مع عامل خفض المضافة حديثا 10 mM β-mercaptoethanol، كوكتيل مثبطات البروتياز، مثبطات 10 ميكرومتر بروتياسوم MG-132، 1 mM deacetylase مثبطات الصوديوم ومثبطات فوسفاتاز (1 mM الصوديوم فاناداتي، 50 mM فلوريد الصوديوم، 5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قارنا طريقتين مختلفتين لتحلل الخلايا الخميرة، وهما طحن حبة الزجاج في 4 °C وطريقة التبريد الآلي في -196 درجة مئوية، لتقييم بروتينات الانتعاش النسبي في مستخلصات الخلايا المعدة مع كلا الطريقتين. لهذه الدراسة، اخترنا لاستخدام سلالة الخميرة الناشئة YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3،-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB229] [pUB221])16 تحمل بلازميد نسخة عالية تعبر عن ترادف HIS-MYC الموسومة Ubiquitin (HIS-MYC-Ub) حتى نتم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وهناك قيد من دراسة البروتينات المحلية من الخميرة هو تحلل غير فعال من خلايا الخميرة بسبب جدار الخلايا صعبة. على الرغم من أن عدة طرق قد وضعت، الأسلوب الأكثر اتساقا وكفاءة في أيدينا هو cryogrinding من خلايا الخميرة فلاش المجمدة كما الفشار. هذه الطريقة تسمح لإعداد موثوق من مقتطفات الخلية كاملة عالية الجودة من الخميرة في مهدها مقارنة مع أساليب تحلل أخرى. وأظهرت النتائج التمثيلية أن cryogrinding متفوقة على طريقة ميكانيكية شعبية لتحلل الخميرة التي توظف طحن الخرز في 4 درجة مئوية(الشكل 3A و 3.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يتم دعم الأبحاث في مختبر غونجان بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم ووزارة الصحة في فلوريدا. نشكر الطالب الجامعي جون باركر على المساعدة التقنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 50 مل أنابيب البولي كربونات مع أغطية لولبية | الطرد المركزي | بيكمان | 357002 |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | الخميرة YPD مكون الوسائط |
| BD Bacto مستخلص الخميرة | BD Biosiences | 212750 | الخميرة YPD مكون الوسائط |
| بيكمان أفانتي جهاز طرد | بيكمان | B38624 | جهاز طرد مركزي عالي السرعة |
| بيكمان JLA-9.1000 | بيكمان | 366754 | الدوار |
| D- (+) - سكر العنب MP اللامائي | الطب الحيوي | 901521 | الخميرة YPD مكون |
| الوسائط Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | دلو متأرجح |
| جهاز طرد مركزي مبرد Eppendorf 5810 R | Eppendorf | 22625101 | جهاز طرد مركزي مبرد |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | مستبعد الحجم والتبريد |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 الجسم المضاد | Novagen | 70796 | الجسم المضاد ل HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | ملح للحفاظ على القوة الأيونية |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | مثبط البروتيازوم |
| كوكتيل مثبط الفوسفاتيز | ThermoFisher كوكتيل مثبط الفوسفاتيز العلمي | A32957 | |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | كوكتيل مثبط البروتياز البقعة |
| ThermoFisher Scientific | A32963 | كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني | |
| الدوار JLA 25.500 | بيكمان | JLA 25.500 | الدوار |
| الزدافة الصوديوم | EM Science | BX2165-1 | مثبط هيستون ديستيلاز |
| فلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | S6521 | مثبط الفوسفاتيز |
| الصوديوم فاناديت | MP الطب الحيوي | 159664 | مثبط الفوسفاتيز |
| الصوديوم بيتا ؛ - جليسيروفوسفات | ألفا إيسار | 13408-09-8 | مثبط الفوسفاتيز |
| Spex Certiprep 6850 مطحنة التجميد | SPEX عينة الإعدادية | 6850 | مطحنة الفريزر |
| TALON Metal Affinity راتنج | BD Biosiences | 635502 | لسحب البروتينات الموسومة HIS |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | المنظفات غير الأيونية |
| بيتا - Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | عامل اختزال |
المراجع
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
