يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي

8.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61164

⸱

يناير 29, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نحن وصف طريقة موثوقة لإعداد مستخلصات الخلية كاملة من الخميرة أو الخلايا الأخرى باستخدام مطحنة التجميد المبردة التي تقلل من تدهور وdenaturation البروتينات. مستخلصات الخلايا مناسبة لتنقية مجمعات البروتين الوظيفية، وتحليلات البروتيوم، ودراسات المناعة المشتركة والكشف عن تعديلات البروتين labile.

الملخص

سهولة التلاعب الجيني والحفاظ التطوري القوي للآلات الخلوية eukaryotic في خميرة في مهدها Saccharomyces cerevisiae جعلت من كائن حي النموذج الوراثي البارز. ومع ذلك ، نظرًا لأن عزل البروتين الفعال يعتمد على التعطيل الأمثل للخلايا ، فإن استخدام الخميرة للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتينات الخلوية يعوقه جدار الخلية المكلف بهضم الأنزيمية (باستخدام lyticase أو zymolyase) ، ويصعب تعطيله ميكانيكيًا (باستخدام مضرب حبة تقليدي أو مطبعة فرنسية أو طاحونة قهوة) دون التسبب في تسخين العينات ، مما يسبب بدوره تذوّق البروتينات وتدهورها. على الرغم من أن طحن يدوي من خلايا الخميرة تحت النيتروجين السائل (LN2) باستخدام مدافع الهاون و pestle يتجنب ارتفاع درجة حرارة العينات ، فإنه كثيف العمالة ويخضع للتقلب في تحلل الخلايا بين المشغلين. لسنوات عديدة، ونحن قد تم إعداد بنجاح مقتطفات الخميرة عالية الجودة باستخدام cryogrinding الخلايا في مطحنة التجميد الآلي. درجة حرارة -196 درجة مئوية التي تحققت باستخدام LN2 يحمي المواد البيولوجية من التحلل بواسطة البروتيوسات والنيوكلاسيس، مما يسمح باسترجاع البروتينات السليمة والأحماض النووية والجزيئات الأخرى. هنا وصفنا هذه التقنية بالتفصيل لخلايا الخميرة الناشئة التي تنطوي على تجميد أول تعليق الخلايا في عازلة تحلل من خلال إضافة قطرة في LN2 لتوليد قطرات المجمدة من الخلايا المعروفة باسم "الفشار". ثم يتم سحق هذا الفشار تحت LN2 في مطحنة الفريزر لتوليد استخراج "مسحوق" المجمدة التي يتم إذابتها ببطء وتوضيحها عن طريق الطرد المركزي لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان. المقتطفات الناتجة جاهزة لتطبيقات المصب، مثل تنقية البروتين أو الحمض النووي، أو التحليلات البروتومية، أو دراسات المناعة المشتركة. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لإعداد استخراج الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة والأنسجة النباتية والحيوانية والعينات البحرية بما في ذلك الشعاب المرجانية ، فضلا عن عزل الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي من الطب الشرعي والعينات الأحفورية الدائم التجمد.

المقدمة

الخميرة هي كائن نموذجي شعبي لدراسات البروتين ، كما هو كائن حي بسيط eukaryotic مع وفرة من الأدوات الوراثية والكيميائية الحيوية المتاحة للباحثين1. بسبب جدار الخلية قوي، أحد التحديات التي يواجهها الباحثون هو في lysing بكفاءة الخلايا دون الإضرار محتويات الخلوية. تتوفر طرق مختلفة للحصول على مستخلصات البروتين من خلال تعطيل خلايا الخميرة التي تشمل تحلل انزيمي (zymolyase)2،3، تحلل كيميائي4، تحلل طبيعي عن طريق التجميد ذوبان5، الضغط القائم على (الصحافة الفرنسية)6،7، الميكانيكية (الخرز الزجاجي ، طاحونة القهوة)8،9،10 و 10 ، و11 . يمكن أن تختلف كفاءة تحلل الخلايا وغلة البروتين بشكل كبير اعتمادًا على التقنية المستخدمة ، مما يؤثر على النتيجة النهائية أو ملاءمة التطبيق المطلوب للمصب للlysate. عند دراسة البروتينات غير المستقرة، لديها تعديلات عابرة بعد التراتف، أو حساسة لدرجة الحرارة، من المهم بشكل خاص استخدام طريقة من شأنها تقليل فقدان العينة أو تدهور أثناء التحضير.

استخراج تقنية إعدادالتفاصيلمزاياعيوبتحليل المصبمرجع
الصحافة الفرنسية: التجانس عالي الضغط (الملقب Microfluidizer) مع المعالجة المسبقة الأنزيمية باستخدام ZymolyaseZymolyase-20T، وهو التجانس Microfluidizer الضغط العالي. ويتكون المعرقل من مضخة ذات ضغط عال تحركها الهواء (نسبة 1:250؛ ضغط الهواء المطلوب 0.6-l-MPa) وغرفة تعطيل خاصة مع وحدة ضغط الظهر إضافية. مطلوب عينة حجم الحد الأدنى من 20 مل للمعالجة.التعطيل النهائي الكلي الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتوكول المشترك اقترب من 100٪ مع 4 تمريرات بضغط 95 MPa ، مقارنة فقط بـ 32 ٪ من التعطيل مع 4 تمريرات في 95 MPa باستخدام التجانس فقط بدون Zymolyase.غير مناسب للتطبيقات الصغيرة الحجم. يمكن الحصول على الإنزيمات باهظة الثمن للمستحضرات على نطاق واسع.تنقية البروتين6
مضرب الخرز: الخلايا المعالجة Zymolyase مع حبات زجاجية في أداة fastprepتقريبا يتم إضافة حجم متساو من الباردة والجافة، وحمض غسلها حبات الزجاج 0.5 ملم إلى حجم معين من بيليه الخلية في العازلة تحلل وتعطلت الخلايا عن طريق التحريض اليدوي قوية.ومن المفيد بشكل خاص عند صنع مقتطفات من العديد من الثقافات الخميرة الصغيرة المختلفة لأغراض فحص بدلا من تنقية البروتين.خلال إجراء حبة الزجاج، يتم التعامل مع البروتينات بقسوة مما تسبب في رغوة واسعة النطاق مما يؤدي إلى denaturation البروتين. كمية من كسر الخلية تختلف, في حين أن تحلل البروتين وكذلك قد تنتج عن تعديل البروتينات من تسخين استخراج فوق 4 درجة مئوية أثناء الكسر الميكانيكية.في الغالب الحمض النووي وتحاليل الحمض النووي الريبي، ولكن أيضا تحليل البروتين عن طريق denaturing electropheoresis هلام، إما مع أو بدون النشاف الغربية.8
علاج Zymolyase تليها تحلل باستخدام مزيج من الصدمة التناضحة والتجانس دونيسبعد الهضم الأنزيمي من جدران الخلايا، يتم lysed رأب البلاست مع 15 إلى 20 السكتات الدماغية من الحشرات ضيق المناسب (إزالة 1 إلى 3 ميكرومتر) في التجانس Dounce.مفيد لاستخدام سلالات protease ناقصة مثل BJ926 أو EJ101. هذه هي ألطف طريقة لكسر خلايا الخميرة وبالتالي هو الأكثر ملاءمة لإعداد مقتطفات التي يمكن أن تقوم بوظائف الأنزيمية المعقدة (على سبيل المثال، الترجمة، النسخ، النسخ المتماثل الحمض النووي) والتي سلامة الهياكل الجزيئية (على سبيل المثال، الريبوسومات، لصقات) يجب الحفاظ عليها. ومن المفيد أيضا لعزل النوى سليمة التي يمكن استخدامها لدراسات الكروماتين (بلوم والكربون، 1982) أو لاستخراج البروتين النووي (لو وكورنبرغ، 1987).العيوب الرئيسية لإجراء تجميل اللواء هي أنها مملة نسبيا ومكلفة، وخاصة بالنسبة للمستحضرات على نطاق واسع (>10 لتر)، وفترات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤدي إلى تحلل البروتين أو تعديل البروتين.  بالنسبة لمستحضرات الكروماتين ، يبدو أنها ذات جودة متفاوتة أو أقل من تلك التي تنتجها التفاضلية الطرد المركزي (على أساس سلامة سلم النيوكلوزومات).عزل نوى سليمة لدراسات الكروماتين، مقتطفات التي يمكن أن تقوم بها وظائف الأنزيمية المعقدة، مقتطفات تتطلب سلامة
هياكل الجزيئات، مستخلصات البروتين النووي.		2
تعطيل الخلية من الخلايا المجمدة فلاش عن طريق طحن في النيتروجين السائل باستخدام هاون / الحشرات أو خلاطيتم تجميد الخلايا على الفور في النيتروجين السائل ثم طحنها يدويا في هاون باستخدام الحشرات، أو باستخدام خلاط وارينغ في وجود النيتروجين السائل.البروتوكول سريع وسهل. ويمكن أن تستوعب كميات مختلفة من خلايا الخميرة بما في ذلك الثقافات الكبيرة جدا. وتتمثل ميزتها الرئيسية في أن الخلايا تؤخذ مباشرة من الحالة المتنامية بنشاط إلى النيتروجين السائل (−196 درجة مئوية)، مما يقلل من أنشطة الإنزيمات التحللية مثل البروتياسات والنوى وكذلك الأنشطة التي تعدل البروتينات (مثل الفوشطات وال كيناس). وهي مناسبة بشكل خاص لصنع مستخلصات الخلية الكاملة من ثقافة خميرة واحدة لتنقية البروتين على نطاق واسع.فوضوي بعض الشيء ويحتمل أن يكون خطيرا على المحقق الإهمال. عينات صغيرة (أي، 10-إلى 100-مل الثقافات الخميرة) لا تتم معالجتها بسهولة لأنه لا توجد كتلة كافية من كتل الخلايا المجمدة لكسر فعال في الخلاط. ومن تستغرق وقتا طويلا لمعالجة عينات فردية وتنظيف المعدات بين الاستخدامات.مقتطفات الخلية الكاملة من ثقافة الخميرة واحدة لتنقية البروتين على نطاق واسع.2
التحلل التلقائي، مطحنة الخرزدرجة حُكّة 5.0، 50 درجة مئوية، 24 ساعة، 200 دورة في الدقيقة / Ø 0.5 مم، 5 × 3 دقائق/3 دقيقةسريعة وفعالة تحلل، وخاصة بالنسبة لإعداد استخراج على نطاق صغيريؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. معدات الضرب حبة المطلوبة.تحليلات صغيرة الحجم.10
التحلل التلقائي، سونيكيشندرجة الحرارة 5.0، 50 درجة مئوية، 24 ساعة، 200 دورة في الدقيقة، 4 × 5 دقيقة/2 دقيقة، نبض 80٪، قوة 80٪معدات سونيكيشن عادة ما تكون متاحة في معظم المؤسسات.يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات. معدات سونيكيشن المطلوبة. يمكن أن يستغرق التحلل البطيء أكثر من 24 ساعة.الخميرة خلية الجدار الاستعدادات.
عملية الغليان والتجميدلا توجد معدات متخصصة تحتاج سوى الفريزر القياسية وكتلة التدفئة أو حمام الماء الساخن.كفاءة، قابلة للاستنساخ، بسيطة وغير مكلفة.يؤدي توليد الحرارة إلى التآكل وتدهور الجزيئات الجزيئات.تحليل الحمض النووي من قبل PCR.5

الجدول 1: مقارنة الأساليب المتاحة لإعداد مستخلصات الخميرة.

يستخدم التبريد (الملقب طحن المبردة / طحن المبردة) عادة لاسترداد الأحماض النووية والبروتينات أو المواد الكيميائية من عينات حساسة لدرجة الحرارة بطريقة موثوقة للتحليلات الكمية أو النوعية. وقد تم استخدامه بنجاح لتطبيقات متعددة في مجالات متنوعة بما في ذلك التكنولوجيا الحيوية، وعلم السموم، وعلم الطب الشرعي12،13، والعلوم البيئية، والبيولوجيا النباتية14 وعلوم الغذاء. عادة ما تعتمد عزل الجزيئات الحيوية البيولوجية السليمة بشكل حاسم على درجة الحرارة. تضمن درجات الحرارة المنخفضة للغاية بقاء البروتياز والنيات غير نشطة ، مما يؤدي إلى عزل موثوق به للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الأخرى للتحليلات اللاحقة. في الواقع، يحافظ مطحنة الفريزر عادة على درجة حرارة العينة من -196 درجة مئوية (نقطة غليان LN2)، وبالتالي تقليل الحمض النووي/الحمض النووي الريبي أو التآكل البروتيني والتحلل.

طاحونة الفريزر توظف غرفة طحن الكهرومغناطيسية التي تتحرك بسرعة شريط معدني صلب أو اسطوانة ذهابا وإيابا داخل قارورة تحتوي على عينة ليتم سحقها بين سدادات نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ. الأداة يخلق وعكس بسرعة حقل مغناطيسي داخل غرفة طحن. كما يتحول المجال المغناطيسي ذهابا وإيابا، والمغناطيس يسحق العينة ضد المقابس وبالتالي تحقيق 'cryogrinding' والسحق من الفشار. تحل طاحونة الفريزر محل الملاط و المهاترات وتسمح بالتجهيـز التسلسلي لعينات متعددة (أو ما يصل إلى 4 عينات أصغر في نفس الوقت) مع قابلية عالية للتكرار وتتجنب التقلبات من المستخدم إلى المستخدم المرتبطة بالطحن اليدوي. بمجرد معالجة العينات، يمكن استخدام مستخلصات الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات المتلقية للمعلومات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الفشار الخميرة

  1. تنمو خلايا الخميرة في 0.5 لتر من وسائط YPD إلى كثافة 1 × 107 خلايا / مل. عد الخلايا باستخدام كاونتر أو أي وسيلة أخرى.
  2. خلايا الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2400 غرام و 4 درجة مئوية.
  3. غسل كل عينة مرة واحدة مع 500 مل من الجليد الباردة deionized 18 ميجا أوم ميلي Q المياه.
  4. الكريات ريسوسيبند في 15 مل من الجليد الباردة Lysis العازلة [20 mM HEPES-KOH pH 7.5، 110 mM KCl، 0.1٪ توين، 10٪ الجلسرين، مع عامل خفض المضافة حديثا 10 mM β-mercaptoethanol، كوكتيل مثبطات البروتياز، مثبطات 10 ميكرومتر بروتياسوم MG-132، 1 mM deacetylase مثبطات الصوديوم ومثبطات فوسفاتاز (1 mM الصوديوم فاناداتي، 50 mM فلوريد الصوديوم، 50 mM الصوديوم β-الجليسيروفوفات)]. راجع جدول المواد لمزيد من التفاصيل. إبقاء الخلايا resuspended على الجليد حتى العينات جاهزة للخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة واسعة من مخازن التحلل التي تحتوي على عدد من المنظفات غير الأيونية مع العينات والمثبطات المحددة المدرجة فيه على أساس تطبيق المصب. إن إدراج مثبطات البروتياز والبروتياسومية أمر بالغ الأهمية لمنع تدهور البروتين، خاصة عندما تذوب المستخلصات.
  5. جعل المفاجئة المجمدة الخميرة الفشار عن طريق إضافة ببطء تعليق الخلية قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة ما قبل المبردة المصلية في واحد أو أكثر من أنابيب الطرد المركزي 50 مل أبقى على الجليد الجاف ومليئة LN2 حتى أسفل الحافة. أعلى حتى النيتروجين السائل في الأنبوب في كثير من الأحيان للتعويض عن خسارته بسبب التبخر السريع. العمل في منطقة جيدة التهوية لتجنب المخاطر المرتبطة باختناق النيتروجين.
    1. بدلا من أنبوب 50 مل، واستخدام أنابيب متعددة 50 مل تعادل معا (أو أي حاوية مع فم كبير، مثل زجاجة كبيرة من البلاستيك الطرد المركزي التي يمكن أن تتسامح مع درجات الحرارة المبردة) لإعداد الذرة البوب(الشكل 1A). أكبر الحاوية وفتحها، وأسهل هو إعداد الفشار لأن هذا يمنع تكتل الفشار لتشكيل مجاميع كبيرة. مجموعة حجم 0.3-0.5 سم للشارخ مثالية لتحقيق السليم طحن / الطحن باستخدام مطحنة الفريزر (الشكل 1B).
    2. تأكد من أن LN2 قد تبخرت تماما من الأنابيب التي تحتوي على الفشار قبل تخزينها في -80 درجة مئوية. فمن الممكن أن تتوقف بعد إعداد الفشار الخميرة كما أنها مستقرة لعدة سنوات عندما أبقى في -80 درجة مئوية.

figure-protocol-1
الشكل 1: إعداد الفشار الخميرة. (أ) الخميرة "الفشار" هو الذي أدلى به من خلال تجميد dropwise من تعليق الخلية في LN2. نستخدم 1-3 أنابيب 50 مل عقد جنبا إلى جنب مع شريط مطاطي ووضعها في دلو الجليد مليئة الجليد الجاف. تمتلئ الأنابيب مع LN2 حتى أقل بقليل من الحافات وتصدرت مع النيتروجين السائل في كثير من الأحيان للحفاظ عليها كامل تقريبا حتى تم إجراء كل تعليق الخلية في الفشار (B) حجم الفشار هو عامل مهم من كفاءة طحن الأمثل. يجب أن يتراوح حجم الفشار بين 0.3 و 0.5 سم في القطر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2- الكريوغريند

  1. للبدء، تأكد من أن هناك ما يكفي من LN2 المتاحة للاسترخاء مطحنة الفريزر، طحن قوارير، والإمدادات وتشغيل الجهاز لجميع العينات. وينبغي أن تكفي 30-35 لتراً من LN2 لأقل من خمس عينات. املأ غرفة مطحنة الفريزر مع LN2 حتى خط التعبئة.
    تحذير:يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على LN2 في منطقة جيدة التهوية وطاحونة الفريزر نفسها يجب أن تكون موجودة في مثل هذه المنطقة لتجنب خطر الاختناق. ارتداء معدات الحماية الشخصية بما في ذلك الأحذية المناسبة، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة، وطبقة قاعدة من قفازات النيتريل، ثم القفازات الحرارية، تليها زوج آخر من قفازات نيتريل. استخدام أقصى درجات الحذر عند التعامل مع LN2.
  2. أغلق غطاء مطحنة الفريزر ببطء، وتجنب رشة LN2 واسمح لبضع دقائق للآلة أن تبرد. قد يكون من الضروري إعادة ملء الغرفة بـLN 2 للتعويض عن الخسارة الناجمة عن التبخر قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: إعادة تعبئة LN2 حسب الحاجة فقط حتى خط التعبئة. لا املأ الغرفة لأن هذا يمكن أن يكون خطرا وضارة على حد سواء إلى الجهاز. تتوفر أنظمة إعادة التعبئة الآلية لمطحنة التجميد التي يمكنها تجديد LN2 المتبخرة حسب الحاجة مباشرة من خزان تخزين متصل بمطحن التجميد.
  3. قبل قشعريرة قوارير طحن كبيرة وشريط المؤثر المغناطيسي عن طريق الغمر لهم في LN2 أبقى في ديوار صغيرة منفصلة. Decant كل LN2 عندما توقف LN2 محتدما. ثم إضافة الفشار عينة / الخميرة إلى قارورة طحن وختم بإحكام مع اثنين من المقابس نهاية الفولاذ المقاوم للصدأ.
    1. لا تملأ أكثر من ثلث قارورة طحن مع العينة كما أن ذلك يمكن أن يقلل من كفاءة طحن. بدلاً من ذلك، يمكن معالجة عينات أكبر بتقسيمها إلى قاريتين أو أكثر وطحنها بشكل متسلسل. يمكن استخدام قارورة طحن أصغر لعينات أصغر (حتى 3 مل).
  4. ضع قارورة الطحن في غرفة مطحنة الفريزر وأقفلها في مكانها. أغلق الغطاء.
  5. بالنسبة إلى الخميرة الناشئة، طحن العينات لما مجموعه ثلاث دورات لمدة 2 دقيقة/دورة (مع 2 دقيقة من الراحة للتبريد بين الدورات) بمعدل ساحق قدره 14. عندما يتوقف الجهاز بعد الانتهاء من الدورات، فتح غطاء مطحنة الفريزر ببطء وبعناية فتح القارورة مع خلية مسحوق المجمدة lysate وإزالتها من مطحنة الفريزر. إذا تم استخدام قارورة صغيرة متعددة، والعمل بسرعة لإزالة قارورة واحدة في وقت واحد ووضعها في الجليد الجاف.
    ملاحظة: عادة ما لا تكون هناك حاجة لضبط المعلمات طحن عند استخدام قوارير من أحجام مختلفة مع نفس النوع من العينة. ومع ذلك ، فإن المعلمات طحن مثل عدد الدورات ومعدل طحن تحتاج إلى أن تكون محددة تجريبيا لأنواع مختلفة من العينات ، اعتمادا على السهولة التي lyse. معظم خلايا الثدييات والأنسجة الرخوة سوف ينعم في 1-2 دورات بمعدل ساحق من 10. من الصعب أن عينات مثل البكتيريا والخميرة ويرقات الذباب تطير وذباب الفاكهة الكبار تتطلب 3-6 دورات في المعدل الأقصى ، في حين أن الأنسجة الصلبة مثل العظام والأسنان ، وما إلى ذلك قد تتطلب ما يصل إلى 10 دورات. يمكن رؤية aliquot صغيرة من العينة المذابة تحت المجهر قبل وبعد الطحن لحساب عدد الخلايا السليمة وغير المُهدَّبة لتحديد كفاءة التحلل. وقد نشرت في السابق تحليل ممتاز لتأثير المعلمات cryogrinding على الإفراج عن البروتينات والحمض النووي من الخميرة في مهدها15.
  6. تعمل بسرعة حتى لا تسمح للعينة أن تذوب ، فك بعناية واحدة من القطع النهائية (اختيار واحد يبدو أنه أصبح فضفاضة إلى حد ما خلال طحن) باستخدام أداة الافتتاح. ثم، استخدم زوج من ملقط طويلة (التي هي مبردة مسبقا في دلو مع الثلج الجاف) لإزالة شريط الأثر. جمع العينة المسحوقة عن طريق عكس والاستفادة من القارورة طحن على البوليسترين وزنها طبق مبردة مسبقا مع LN2 وأبقى على الجليد الجاف.
  7. مرة واحدة وقد تم استرداد كل من lysate خلية المجمدة مسحوق من قارورة طحن، صب مساحيق من طبق وزنها مرة أخرى إلى أنبوب 50 مل والمضي قدما على الفور إلى خطوة ذوبان بطيئة وصفها بعد ذلك للحصول على أفضل النتائج. بدلا من ذلك، تخزين مسحوق المجمدة lysate بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية، على الرغم من أن هذا قد يؤدي إلى بعض التدهور.
  8. إعداد دلو الثلج مع الطين 50٪ من الجليد والماء ووضعها على لوحة ضجة مع محرك المغناطيسي. غمر رف سلك أو رف آخر مناسب في الطين الجليدي لعقد العينات.
    1. ثم، ذوبان العينات ببطء على حمام الطين الجليد مع التحريض المستمر من الطين باستخدام مُحرك مغناطيسي. إضافة المزيد من الثلج لتحل محل ذوبان الجليد (قد تحتاج بعض المياه إلى التخلص منها لمنع دلو الثلج من الفيض). منذ العديد من مثبطات قصيرة نصف حياة في المخازن المؤقتة مائي، إضافة كوكتيل مثبطات البروتياز إضافية (انظر جدول المواد)و 10 μM مثبطات بروتيام MG-132 إلى lysate مرة واحدة تبدأ العينات ذوبان الجليد (بعد حوالي 30 دقيقة).
    2. إزالة الجليد التي تشكلت على السطح الخارجي للأنابيب كل 5 دقائق لتسريع عملية الذوبان. لاحظ أن الذوبان السريع للعينات في درجة حرارة الغرفة أو أعلى يمكن أن يؤدي إلى تدهور كبير.
  9. بعد أن تذوب العينات تماما (قد يستغرق أكثر من ساعة اعتمادا على كمية العينة)، والطرد المركزي في 3220 ~ غرام لمدة 20 دقيقة في جهاز طرد مركزي مُبرد على 4 درجة مئوية لإزالة الجزء الأكبر من حطام الخلية من اللوى.
  10. نقل فائقة إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي البولي التي تم تبريدها مسبقا على الجليد والطرد المركزي العينات في 16000 غرام لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
  11. نقل فقط supernatant واضحة تتكون من استخراج الخلية كاملة أوضح من وسط العمود السائل في أنبوب ببطء شديد وبعناية، دون إزعاج طبقة الدهون غائم (الشكل 2)، في أنبوب 15 مل المبردة باستخدام ماصات ما قبل المبردة المصلية. تجنب إزالة كل من lysate في أنبوب الطرد المركزي لمنع ترحيل الدهون والحطام. يمكن طرد بقايا الأنبوب في جهاز الطرد المركزي عدة مرات لاستعادة كميات صغيرة من استخراج بعد كل تدور.
    ملاحظة: الدهون جنبا إلى جنب مع أي البروتينات المشوهة تظهر غائم / حليبي وتقع في الجزء العلوي من واجهة السائل / الهواء، وأحيانا فوق بيليه نفسها التي تتكون من الحطام الخلوي غير قابلة للذوبان(الشكل 2).

figure-protocol-2
الشكل 2: استخراج طبقات في أنبوب الطرد المركزي. يشار إلى السمات الرئيسية المرئية لاستخراج الخلية بأكملها في أنبوب بعد الطرد المركزي في 16،000 غرام لمدة 20 دقيقة. تعتمد الوفرة النسبية لكل ميزة على نوع العينة ، ومرحلة نمو الخلايا (الأسية مقابل الثابتة) ، ومقدار العازلة التحلل المستخدمة في خلايا إعادة الإنفاق وكفاءة التحلل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الطرد المركزي أي lysate المتبقية لمدة 5 دقائق لاسترداد المزيد من استخراج. كرر هذا 5 دقيقة الطرد المركزي عدة مرات إذا لزم الأمر لاسترداد أكبر قدر من استخراج واضحة قدر الإمكان. تجاهل lysate غائما تحتوي على الدهون على مقربة من الجزء السفلي من أنبوب بالقرب من بيليه.
  2. استخدم هذه المقتطفات لتطبيقات المصب مثل تنقية البروتين المعقدة، والمناعة، وتحليل البروتيوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قارنا طريقتين مختلفتين لتحلل الخلايا الخميرة، وهما طحن حبة الزجاج في 4 °C وطريقة التبريد الآلي في -196 درجة مئوية، لتقييم بروتينات الانتعاش النسبي في مستخلصات الخلايا المعدة مع كلا الطريقتين. لهذه الدراسة، اخترنا لاستخدام سلالة الخميرة الناشئة YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3،-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB229] [pUB221])16 تحمل بلازميد نسخة عالية تعبر عن ترادف HIS-MYC الموسومة Ubiquitin (HIS-MYC-Ub) حتى نتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وهناك قيد من دراسة البروتينات المحلية من الخميرة هو تحلل غير فعال من خلايا الخميرة بسبب جدار الخلايا صعبة. على الرغم من أن عدة طرق قد وضعت، الأسلوب الأكثر اتساقا وكفاءة في أيدينا هو cryogrinding من خلايا الخميرة فلاش المجمدة كما الفشار. هذه الطريقة تسمح لإعداد موثوق من مقتطفات الخلية كاملة عالية الجودة من الخميرة في مهدها مقارنة مع أساليب تحلل أخرى. وأظهرت النتائج التمثيلية أن cryogrinding متفوقة على طريقة ميكانيكية شعبية لتحلل الخميرة التي توظف طحن الخرز في 4 درجة مئوية(الشكل 3A و 3...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يتم دعم الأبحاث في مختبر غونجان بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم ووزارة الصحة في فلوريدا. نشكر الطالب الجامعي جون باركر على المساعدة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
50 مل أنابيب البولي كربونات مع أغطية لولبيةالطرد المركزيبيكمان357002
BD Bacto PeptoneBD Biosiences211677الخميرة YPD مكون الوسائط
BD Bacto مستخلص الخميرةBD Biosiences212750الخميرة YPD مكون الوسائط
بيكمان أفانتي جهاز طردبيكمانB38624جهاز طرد مركزي عالي السرعة
بيكمان JLA-9.1000بيكمان366754الدوار
D- (+) - سكر العنب MP اللامائيالطب الحيوي901521الخميرة YPD مكون
الوسائط Eppendorf A-4-44Eppendorf22637461دلو متأرجح
جهاز طرد مركزي مبرد Eppendorf 5810 REppendorf22625101جهاز طرد مركزي مبرد
GlycerolSIGMA-ALDRICHG5150-1GAمستبعد الحجم والتبريد
HEPESFisherBiotechBP310-100Buffer
HIS6 الجسم المضادNovagen70796الجسم المضاد ل HIS tag
KClSIGMA-ALDRICHP9541-1KGملح للحفاظ على القوة الأيونية
MG-132CALBIOCHEM474790مثبط البروتيازوم
كوكتيل مثبط الفوسفاتيزThermoFisher كوكتيل مثبط الفوسفاتيز العلميA32957
Ponceau SSIGMAP7170-1Lكوكتيل مثبط البروتياز البقعة
ThermoFisher ScientificA32963كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني
الدوار JLA 25.500بيكمانJLA 25.500الدوار
الزدافة الصوديومEM ScienceBX2165-1مثبط هيستون ديستيلاز
فلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS6521مثبط الفوسفاتيز
الصوديوم فاناديتMP الطب الحيوي159664مثبط الفوسفاتيز
الصوديوم بيتا ؛ - جليسيروفوسفاتألفا إيسار13408-09-8مثبط الفوسفاتيز
Spex Certiprep 6850 مطحنة التجميدSPEX عينة الإعدادية6850مطحنة الفريزر
TALON Metal Affinity راتنجBD Biosiences635502لسحب البروتينات الموسومة HIS
Tween 20VWR InternationalVW1521-07المنظفات غير الأيونية
بيتا - MercaptoethanolAMRESCOM131-250MLعامل اختزال
أنابيب مركزي دوار

المراجع

  1. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  2. Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
  3. Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
  4. Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
  5. Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
  6. Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
  9. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  10. Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  12. Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
  13. Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
  14. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).
  15. Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
  16. Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
  17. Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
  18. Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295(2012).
  19. Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
  20. Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
  21. Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
  22. Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).
  23. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101(2014).
  24. Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
  25. Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
  26. Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
  27. Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
  28. da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
  29. Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
  30. Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
  31. Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إعداد مقتطفات الخلية من قبل Cryogrinding في مطحنة التجميد الآلي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.