يمكن أن تؤدي الارتفاعات الناجمة عن الإجهاد في مستويات الجلوكوز إلى إرباك تفسير البيانات المستمدة من اختبار تحمل الأنسولين داخل الصفاق الواعي في الفئران. في هذه المقالة ، نصف طريقة لتأقلم الفئران مع المناولة والحقن وأخذ عينات الدم قبل إجراء اختبار تحمل الأنسولين من أجل الحد من ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد.
مقالة منهجية
التأقلم قبل اختبار تحمل الأنسولين داخل الصفاق للتخفيف من ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد في الفئران الواعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يستخدم اختبار تحمل الأنسولين بشكل شائع في دراسات التمثيل الغذائي لتقييم حساسية الأنسولين في الجسم بالكامل في القوارض. إنه اختبار بسيط نسبيا يتضمن قياس مستويات الجلوكوز في الدم بمرور الوقت بعد حقن الأنسولين داخل الصفاق واحد. بالنظر إلى أنه يتم إجراؤه في حالة الوعي وغالبا ما يتم جمع الدم عن طريق قصاصة الذيل ، فإن لديه القدرة على إثارة استجابة الإجهاد من بسبب القلق المرتبط بالمناولة وجمع الدم. على هذا النحو ، يمكن أن يحدث ارتفاع ناتج عن الإجهاد في نسبة الجلوكوز في الدم ، مما يجعل من الصعب اكتشاف وتفسير مقياس نقطة النهاية الأولية ، أي انخفاض نسبة الجلوكوز في الدم بوساطة الأنسولين. وقد لوحظ هذا في العديد من سلالات الفئران ، وهو شائع جدا في الفئران المصابة بالسكري db / db ، حيث يمكن أن تزيد مستويات الجلوكوز ، بدلا من أن تنخفض ، بعد إعطاء الأنسولين. هنا ، نصف طريقة تأقلم الفئران مع المناولة والحقن وأخذ عينات الدم قبل إجراء اختبار تحمل الأنسولين. وجدنا أن هذا يقلل من ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد وينتج عنه بيانات تعكس حساسية الأنسولين في الجسم بالكامل بشكل أكثر دقة.
المقدمة
يتم إجراء اختبارات التمثيل الغذائي في القوارض بشكل روتيني لتقييم المعلمات المختلفة التي تنظم توازن الجلوكوز1. المعيار الذهبي لتقييم عمل الأنسولين لكامل الجسم في الجسم الحي هو المشبك المفرط في الدم والسكر في الدم2. يتضمن هذا الاختبار إعطاء الأنسولين لرفع مستويات الأنسولين المنتشرة بينما يتم حقن الجلوكوز للحفاظ على السكر في الدم. يدل معدل ضخ الجلوكوز المطلوب للحفاظ على نسبة السكر في الدم على عمل الأنسولين. في حين أنها أداة قوية في أبحاث التمثيل الغذائي ، إلا أن تقنية المشبك في الفئران تمثل تحديا تقنيا وتتطلب عمالة مكثفة ، وبالتالي فهي ليست مناسبة تماما كأداة فحص أولية في توصيف النمط الظاهري الأيضي. لهذه الأسباب ، غالبا ما يتم اختيار اختبار تحمل الأنسولين داخل الصفاق (ITT) الأبسط.
يتم إجراء ITT في حالة الوعي بعد فترة الصيام (عادة 4-6 ساعات). يتم إعطاء بلعة الأنسولين داخل الصفاق ، وبعد ذلك يتم مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم على مدى إطار زمني يستمر عادة 60 دقيقة. من المتوقع أن تنخفض مستويات الجلوكوز في الدم بسبب قدرة الأنسولين على تسهيل امتصاص الجلوكوز في الأنسجة الحساسة للأنسولين. تدل درجة حدوث ذلك على عمل الأنسولين في الجسم بالكامل. في بعض الحالات ، ثبت أن مستويات الجلوكوز تزداد ، بدلا من أن تنخفض ، بعد إعطاء الأنسولين. من المحتمل أن تعزى هذه الظاهرة إلى استجابة الإجهاد. يمكن أن تؤدي المناولة والحقن وأخذ عينات الدم إلى الإجهاد3،4،5 ، مما يؤدي إلى تنشيط محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدة الكظرية (HPA) والجهاز العصبي اللاإرادي (ANS) 6،7،8. من المعروف أن كلا من HPA و ANS يسهمان في زيادة مستويات الجلوكوزالمنتشرة 9،10،11. يعد وجود ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد في بداية ITT مشكلة ، لأنه يتداخل مع معدل وحجم انخفاض الجلوكوز عند إعطاء الأنسولين12. هذا يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة فيما يتعلق بوجود مقاومة الأنسولين. وبالتالي ، للتخفيف من التأثير المربك للإجهاد على مستويات الجلوكوز أثناء اختبار TTT ، قمنا بتطوير طريقة لتأقلم الفئران مع المناولة والحقن وأخذ عينات الدم قبل إجراء اختبار ITT.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية المؤسسية واستخدامها في نظام VA Puget Sound للرعاية الصحية.
ملاحظة: قد تختلف المتطلبات المحلية لمراقبة و / أو تدخل التي تعاني من نقص السكر في الدم عن تلك الموضحة هنا.
1. الصيام (ر = -210 دقيقة)
- بعد انتهاء الدورة المظلمة ، انقل الفئران إلى قفص جديد به فراش غير مغذي مثل السليلوز أو الفراش الورقي (وليس فراش الذرة ، مما سيؤثر على نقاط النهاية الأيضية إذا تناولتها الفئران13). تزويد الفئران بإمكانية الوصول إلى الماء طوال فترة الصيام. كن متسقا مع وقت الصيام من اليوم ومدته عبر مجموعات الفئران. بالنسبة للبيانات الموضحة ، تمت إزالة الطعام بين الساعة 0700 و 0800 ، أي بعد 1-2 ساعة من انتهاء الدورة المظلمة.
- نقل الأقفاص (القفص) إلى الموقع الذي سيتم فيه إجراء ITT. يجب أن تكون هذه مساحة هادئة حيث يتم تقليل الضغوطات مثل درجة الحرارة أو الضوضاء أو الضوء أو الحركة.
2. التأقلم (ر = -150 إلى -60 دقيقة)
هام: تعامل مع الفئران بلطف قدر الإمكان. تجنب استخدام جهاز تقييد إن أمكن.
- في -150 دقيقة ، قم بقياس وزن الجسم. سيتم استخدام هذا لحساب حجم الأنسولين الذي سيتم إعطاؤه ل ITT.
- التقط الماوس برفق من الذيل واستقر على سطح سطح طاولة مستو مع الاستمرار في الإمساك بالذيل برفق. استخدم إبرة 20 جم (أو مقص جراحي) لعمل شق صغير في طرف الذيل. يجب أن تبدأ قطرة دم في التكون في الموقع.
- ضع الماوس على سطح صلب أملس وقم بتقييد الماوس برفق من الذيل.
- لتسجيل نسبة الجلوكوز في الدم في هذا الوقت، ضع قطرة دم من طرف الذيل على شريط اختبار جهاز قياس السكر المحمول باليد. إذا لزم الأمر ، قم بتدليك الذيل برفق للحصول على قطرة دم.
- اسحب 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في حقنة الأنسولين. التقط الماوس باستخدام تقشير لطيف وحقنها داخل الصفاق. سجل وقت حقن المحلول الملحي.
- إذا كانت هناك عدة فئران قيد الدراسة ، فقم بحقن الفئران بالمحلول الملحي على فترات 1 دقيقة لإتاحة الوقت للخطوات اللاحقة أدناه.
- بعد 15 دقيقة من حقن المحلول الملحي ، التقط الفأر برفق من الذيل. استخدم الشاش لإخراج أي جلطة دموية على طرف الذيل برفق.
- اختياري: سجل نسبة الجلوكوز في الدم مرة أخرى في هذا الوقت كما هو موضح في الخطوة 2.3.
- بعد 30 دقيقة من حقن المحلول الملحي ، التقط الفأر برفق من الذيل. إذا رغبت في ذلك، احصل على قياس آخر لنسبة الجلوكوز في الدم كما هو موضح في الخطوة 2.3.
- أعد الماوس إلى القفص ، وكرر ذلك للفئران الأخرى حسب الضرورة. اترك الفئران دون إزعاج حتى -90 دقيقة.
- في -90 دقيقة ، كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.6 ، بما في ذلك قياس مستويات الجلوكوز في الدم إذا رغبت في ذلك.
- أعد الماوس إلى القفص ، كرر ذلك للفئران الأخرى حسب الضرورة. اترك الفئران دون إزعاج حتى ITT (حيث يتم قياس مستوى الجلوكوز في الدم الأساسي في -5 دقائق).
3. اختبار تحمل الأنسولين (ر = -5 إلى +60 دقيقة)
- تحضير محلول عامل من الأنسولين العادي (CAUTION) في محلول ملحي معقم ، بحيث يمكن حقن الجرعة المطلوبة عند 4 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم.
ملاحظة: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الأنسولين لأن الحقن العرضي يمكن أن يؤدي إلى نقص السكر في الدم. - قم بإعداد محلول سكر العنب بنسبة 25٪ (v / v) في محلول ملحي معقم ليكون في متناول اليد في حالة إصابة الفئران بنقص السكر في الدم الذي يتطلب التدخل.
- في -5 دقائق ، التقط الماوس برفق من الذيل. حدد مستوى الجلوكوز في الدم الأساسي في هذا الوقت ، عن طريق وضع قطرة دم من طرف الذيل على شريط اختبار جهاز قياس السكر المحمول باليد. إذا لزم الأمر ، قم بتدليك الذيل برفق للحصول على قطرة دم.
- ارسم محلول عمل الأنسولين في حقنة الأنسولين (4 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم ، لنطاق جرعة نموذجي يتراوح بين 0.5-2.0 وحدة / كجم). التقط الماوس باستخدام تقشير لطيف وحقنها داخل الصفاق. وقت قياسي لحقن الأنسولين.
- إذا كانت هناك عدة فئران قيد الدراسة ، فقم بحقن الأنسولين للفئران كل 1 دقيقة لإتاحة الوقت لأخذ عينات الدم اللاحقة وتسجيل البيانات أدناه.
- بعد 15 دقيقة من حقن الأنسولين ، التقط الفأر برفق من الذيل. استخدم الشاش لإخراج أي جلطة دموية على طرف الذيل برفق. حدد نسبة الجلوكوز في الدم مرة أخرى في هذا الوقت كما هو موضح في الخطوة 3.3.
- أعد الفأر إلى القفص وراقب علامات نقص السكر في الدم (على سبيل المثال، الخمول المفرط). إذا ظهرت على الفئران أعراض نقص السكر في الدم، فقم بقياس نسبة الجلوكوز في الدم كما هو موضح في الخطوة 5 وقم بإعطاء سكر العنب إذا لزم الأمر. ستتم إزالة الفأر الذي يخضع لتدخل سكر العنب من بروتوكول آي تي تي في هذا الوقت.
- كرر الخطوتين 3.5 و 3.6 بعد 30 دقيقة من حقن الأنسولين.
- كرر الخطوتين 3.5 و 3.6 بعد 45 دقيقة من حقن الأنسولين.
- كرر الخطوتين 3.5 و 3.6 بعد 60 دقيقة من حقن الأنسولين.
- أعد الفئران إلى قفص منزلها ، الذي يحتوي على عدد قليل من كريات الطعام على أرضية القفص للمساعدة في التعافي من ITT. استمر في المراقبة لمدة 30 دقيقة وإذا لم تستعيد الفئران نشاطها / سلوكها الطبيعي ، فاتبع الإجراء الموضح في الخطوة 3.6.
ملاحظة: يلخص الشكل 1 إجراء التأقلم وتكنولوجيا المعلومات أعلاه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 2 أ والشكل 3 أ عبارة عن بيانات تمثيلية (بيانات فردية ومتوسطة ، على التوالي) تظهر ارتفاعا متناقضا في مستويات الجلوكوز في الدم في الفئران المصابة بداء السكري ديسيبل / ديسيبل في 15 دقيقة بعد إعطاء الأنسولين ، بما يتفق مع ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد. لاحظ أنه لم يكن هناك ارتفاع في نسبة الجلوكوز في الدم في زملاء القمامة غير المصابين بالسكري (ديسيبل / + أو +/+) الذين خضعوا لنفس الإجراء. لتحديد ما إذا كان التأقلم مع إجراء ITT فعالا في التخفيف من هذه ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعتبر المشبك المفرط في السلمون والسكر في الدم هو المعيار الذهبي لتقييم عمل الأنسولين في الجسم الحي. أدت التعديلات التي تم إجراؤها على منهجية أداء المشبك إلى إجراء هذه التقنية في الفئران الواعية وغير المقيدة2 التي تم قسطرتها مسبقا باستخدام نظام قسطرتين14 لتمكين أخذ عينات الدم عبر الشريان السباتي والحقن عبر الوريد الوداجي. هذا يحد من الحاجة إلى التعامل مع الفئران أو تقييدها أثناء الإجراء ، وبالتالي تقليل استجابات الإجهاد2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة P30 DK-017047 (مركز أبحاث السكري بجامعة واشنطن ، مركز تحليل وظائف الخلية) ، ووزارة شؤون المحاربين القدامى بالولايات المتحدة ، ونظام VA Puget Sound للرعاية الصحية (سياتل ، واشنطن). لا تمثل محتويات هذه المخطوطة وجهات نظر وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية أو حكومة الولايات المتحدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| سكر العنب 50 | فايزر الحقن | 00409-6648-16 | للاستخدام إذا كان الفأر يعاني من نقص السكر في الدم. |
| منصات الشاش | فيشر Scientific | 22037907 | لإخراج جلطة دموية على طرف الذيل. |
| جهاز قياس الجلوكوز | أكيوتشيك | M001_us | لقياس نسبة الجلوكوز في الدم. |
| مقياس | لقياس وزن الجسم. | ||
| الأنسولين (نوفولين R) | نوفو نورديسك | 0169-1833-11 | للحقن. |
| محاقن الأنسولين | VWR | BD-329461 | للحقن. |
| مؤقت | |||
| معقم 20 جرام إبرة | VWR | BD-305175 | لقصاصة الذيل. |
| 1261699 | الملح المعقم | Lifeshield | للحقن. |
| مقص جراحي | أدوات العلوم | الدقيقة 14088-10 | لقصاصة الذيل. |
| شرائط اختبار | أكيوتشيك | 06908217001_us | لقياس نسبة الجلوكوز في الدم. |
المراجع
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Tabata, H., Kitamura, T., Nagamatsu, N. Comparison of effects of restraint, cage transportation, anaesthesia and repeated bleeding on plasma glucose levels between mice and rats. Lab Animal. 32 (2), 143-148 (1998).
- Olfe, J., Domanska, G., Schuett, C., Kiank, C. Different stress-related phenotypes of BALB/c mice from in-house or vendor: alterations of the sympathetic and HPA axis responsiveness. BMC Physiology. 10, 2(2010).
- Ghalami, J., Zardooz, H., Rostamkhani, F., Farrokhi, B., Hedayati, M. Glucose-stimulated insulin secretion: Effects of high-fat diet and acute stress. Journal of Endocrinological Investigation. 36 (10), 835-842 (2013).
- Thorens, B. Brain glucose sensing and neural regulation of insulin and glucagon secretion. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13, Suppl 1 82-88 (2011).
- Pekow, C. Defining, measuring, and interpreting stress in laboratory animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 41-45 (2005).
- Chan, O., Inouye, K., Riddell, M. C., Vranic, M., Matthews, S. G. Diabetes and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis. Minerva Endocrinol. 28 (2), 87-102 (2003).
- Rosmond, R. Role of stress in the pathogenesis of the metabolic syndrome. Psychoneuroendocrinology. 30 (1), 1-10 (2005).
- Nonogaki, K. New insights into sympathetic regulation of glucose and fat metabolism. Diabetologia. 43 (5), 533-549 (2000).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Zahorsky-Reeves, J., LW, C. Housing mice on corncob bedding versus hardwood chip may confound research models. American Association for Laboratory Animal Science. , AALAS Scientific Session (10 October) (2010).
- Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. Journal of Biological Chemistry. 272 (36), 22570-22575 (1997).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Barrett, A. M., Stockham, M. A. The effect of housing conditions and simple experimental procedures upon the corticosterone level in the plasma of rats. Journal of Endocrinology. 26, 97-105 (1963).
- Heinrichs, S. C. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 34 (5), 808-815 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذنالوسوم
