Method Article

تحت إشراف التعلم الآلي من أجل تحديد شبه كمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب الجلوميرولونية

DOI:

10.3791/61180

⸱

June 18th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي خارج الخلية (ecDNA) صدر أثناء موت الخلايا هو proinflammatory ويساهم في التهاب. قياس ecDNA في موقع الإصابة يمكن تحديد فعالية العلاج العلاجي في الجهاز المستهدف. يصف هذا البروتوكول استخدام أداة التعلم الآلي لأتمتة قياس ecDNA في أنسجة الكلى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موت الخلايا الكبيبية هو سمة مرضية من النيولوبيروكسيديز المضادة للعدلات الأجسام المضادة السيتوبلازمية المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (MPO-AAV). يتم تحرير حمض ديوكسيريبونوكليك (ecDNA) خارج الخلية (ecDNA) خلال أشكال مختلفة من موت الخلايا بما في ذلك موت الخلايا، نخر، نخر، العدلات الفخاخ خارج الخلية (NETs) و pyroptosis. قياس موت الخلية هذا يستغرق وقتا طويلا مع العديد من المؤشرات الحيوية المختلفة اللازمة لتحديد الأشكال الكيميائية الحيوية المختلفة لوفيات الخلايا. يتم قياس ecDNA بشكل عام في المصل والبول كبديل للتلف الكلوي ، وليس في الجهاز المستهدف الفعلي حيث تحدث الإصابة المرضية. الصعوبة الحالية في التحقيق ecDNA في الكلى هو عدم وجود طرق لinslyin الأنسجة المضمنة البرافين الثابتة (FFPE) على حد سواء تجريبيا وفي خزعات الكلى البشرية المؤرشفة. هذا البروتوكول يقدم ملخصا للخطوات المطلوبة لطخة ل ecDNA في أنسجة FFPE (كل من الإنسان و murine) ، وإخماد autofluorescence وقياس ecDNA في الصور الناتجة باستخدام أداة التعلم الآلي من المصدر المفتوح المتاح علنا ImageJ المساعد تدريب تجزئة Weka. يتم تطبيق تجزئة Weka القابلة للتدريب على ecDNA داخل الكبيات حيث يتعلم البرنامج تصنيف ecDNA. يتم تطبيق هذا المصنف على صور الكلى المكتسبة اللاحقة ، مما يقلل من الحاجة إلى التعليقات التوضيحية اليدوية لكل صورة على حدة. وقد ثبت أن القدرة على التكيف من تجزئة Weka القابلة للتدريب أكثر في أنسجة الكلى من التهاب الميرين التجريبي المضاد للكبيباتولونية (GN) ، لتحديد NETs وecMPO ، والمساهمين المرضية المشتركة لمكافحة MPO GN. توفر هذه الطريقة تحليلًا موضوعيًا لـ ecDNA في أنسجة الكلى يوضح بوضوح فعالية برنامج تجزئة Weka القابل للتدريب الذي يمكن أن يميز ecDNA بين أنسجة الكلى الطبيعية السليمة وأنسجة الكلى المريضة. ويمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول لتحديد ecDNA، NETs وecMPO في الأجهزة الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myeloperoxidase المضادة للعدلات cytoplasmic الأجسام المضادة المرتبطة بهشاشة الأوعية الدموية (MPO-AAV) هو مرض المناعة الذاتية التي تؤدي إلى الفشل الكلوي من الإصابة الكبيبية المرضية مع موت الخلايا كبيرة وإطلاق حمض ديوكسي تريبونوكلليك (الحمض النووي)1,2. الحمض النووي يمكن تنشيط الجهاز المناعي من خلال العمل كإشارة الخطر. في ظل الظروف الصحية العادية، يوفر الموقع النووي للحمض النووي الحماية من التعرض للجهاز المناعي. الحمض النووي الذاتي الذي يتم تحريره خارج الخلية خلال العمليات المسببة للأمراض أو autoimmunity ينظر إليه من قبل الجهاز المناعي باعتباره الضرر proinflammatory قوية المرتبطة البروتين الذاتي الجزيئي (DAMP)3. يتم تحرير الحمض النووي الخلوي الإضافي (ecDNA) من الخلايا المحتضرة من خلال العديد من الآليات المتميزة التي تحكمها مسارات بيوكيميائية متميزة ، مثل المبرمج ، نخر العدلات العدلات تكوين فخ خارج الخلية (NETs) ، نخر أو pyroptosis4،5،6،,8.8

نحن وصف هنا أساليب لطخة وقياس ecDNA صدر من الخلايا المحتضرة في أقسام من البارافين ثابتة (FFPE) الكليتين من التجريبية المضادة MPO GN وخزعات الكلى من المرضى الذين يعانون من MPO-AAV9,10. توجد طرق متعددة للكشف عن تعميم الحمض النووي المزدوج (DsDNA) ومجمعات الحمض النووي من كل من المصل والبول ومن المختبرات11,12. هذه الطرق، على الرغم من دقة في تحديد كمية ecDNA، لا تحدد أين يتم تحرير ecDNA تشريحيا. هناك طرق تصف قياس محدد من ecDNA مثل موالف ل المبرمج وقياس حطام الخلية13،14. لا توجد طريقة تصف قياس ecDNA بلغت ذروتها من جميع أشكال موت الخلايا في الكلى FFPE حيث يحدث الضرر المرضي. وهذا أمر مهم لتحديد ما إذا كانت العلاجات العلاجية التجريبية وتطهير ecDNA من مواقع الإصابة المرضية في الجهاز المستهدف الفعلي.

إن الحصول على صور متعددة من عينات الكلى يخلق كمية كبيرة من البيانات التي يتم تحليلها بشكل شائع من قبل مستخدم واحد. هذا كثيف العمالة، تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تخضع لإعادة إنتاج لا يمكن الاعتماد عليها من قبل المستخدمين الآخرين، وذلك بسبب تحيز المستخدم. تجزئة Weka القابلة للتدريب هو برنامج إضافي مفتوح المصدر لـ ImageJ يستخدم أدوات متطورة للمعلومات الحيوية لتصنيف وحدات البكسل باستخدام خوارزميات التعلم الآلي15،16. هذا الأسلوب هو "تدريب" حيث أنه يتعلم من تصنيف المستخدم من شرائح من بكسل وتطبيق التصنيف الجديد المستفادة على الصور الأخرى. تعتمد هذه الطريقة على أدوات التحليل الشائعة ضمن برنامج ImageJ التي تستخدم "لتصنيف" كل بكسل في مقطع على أنه ينتمي إلى "فئة" معينة. بمجرد أن يتعلم البرنامج "المصنفات"، يمكن استخدامها لتحديد شرائح أخرى مصنفة مماثلة داخل نفس الصورة. ثم يتم حفظ هذا النموذج وتطبيقه على مجموعات أخرى من الصور ضمن نفس التجربة.

العقبات الحالية لتحديد ecDNA في الموقع في أقسام الكلى هو ذاتي endfluorescence الذاتية من التثبيت في formalin وتحليل العمالة الكثيفة من الصور. نحن نصف هنا كيفية إخماد هذا autofluorescence، والكشف عن ecDNA، واستخدام التعلم الآلي تحت إشراف لقياس الإنتاجية عالية من ecDNA. لقد سبق أن نشرنا قياس NETs وMPO خارج الخلية (ecMPO) باستخدام ماكرو في ImageJ ، ونحن الآن نبرهن شبه أتمتة هذه الأساليب باستخدام التعلم الآلي تحت إشراف1. نحن نبرهن على قدرة على التكيف مع أداة التعلم الآلي، لتصنيف بقعة بديلة لـ NETs و ecMPO داخل نفس الصورة. ويمكن ترجمة هذه الأساليب تلطيخ المذكورة هنا للكشف عن ecDNA، NETs وecMPO إلى الأجهزة الصلبة الأخرى والأمراض حيث ecDNA, NETS وecMPO يلعب دورا في إدامة المرض مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والذئبة17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الطريقة تمكن من الكشف عن عموم ecDNA من جميع أشكال موت الخلايا. وتستخدم نفس الطريقة والأجسام المضادة لالأنسجة خزعة الكلى البشرية (من الخطوة 4). جميع البشر والحيوانات كان على موافقة الأخلاقيات من جامعة موناش، وموناش الصحة، كلايتون، فيكتوريا، أستراليا.

1. تلطيخ ل ecDNA مع DAPI و β -Actin

  1. حث نموذج 20 يوما من glomerulonephs المضادة للنخاع (المضادة MPO-GN) في 8-10 أسابيع الفئران C57/Bl6 القديمة، مع الضوابط9.
    1. القتل الرحيم الفئران إنسانيا باستخدام غرفة CO2.
    2. إزالة الكلى عن طريق إجراء شق خط الوسط الأمامي من خلال الجلد مع مقص، ومن ثم قطع بعناية الصفاق ودبوس مرة أخرى على لوحة تشريح. باستخدام ملقط جانبا اللفافة الكلوية الأمامية والصاقوم الجداري وقطع الكلى مجانا عن طريق قطع الحالب والأوعية الدموية (الشريان الكلوي والوريد) في الحوض الكلوي. إزالة مع ملقط وقطع الكلى في النصف (الطائرة القوس) مع مشرط حجم 22.
    3. ضع الكلى في التثبيت (4٪ من الـ 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة(RT) إزالة ونقع الكلى الثابتة في 30٪ الإيثانول لمدة 24 ساعة قبل المعالجة.
  2. معالجة الكلى باستخدام دورة قياسية مدتها 6 ساعات:
    70% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    90% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 25 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 20 دقيقة
    إكسيلين لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 40 دقيقة
    الشمع لمدة 30 دقيقة
    الشمع لمدة 35 دقيقة
    الشمع لمدة 40 دقيقة
    ملاحظة: هذا مهم لأن الكلى لا ينبغي أن تتعرض لفترات طويلة التعرض للحرارة في الشمع، كما أنها يمكن أن تدمر المستضدات من الفائدة.
  3. قطع 3 ميكرومتر أقسام على microtome وجبل على الشرائح المجهر الزجاج المتاحة تجاريا المغلفة مع شحنة إيجابية. السماح لتجف بين عشية وضحاها.
  4. وضع الشرائح الزجاجية في رف الشريحة في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: الخطوات 1.3 و 1.4 هامة لضمان المقاطع لا تطفو أثناء خطوة استرداد مستضد.
  5. تزج الشرائح في اثنين من التغييرات من المذيبات (الزيلين أو بديل) لمدة 40 دقيقة لكل منهما، في غطاء محرك الدخان.
  6. شرائح إعادة الترطيب في الإيثانول 100٪ ، 100 ٪ الإيثانول ، 70 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل من. يغسل لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور.
  7. ضع صفيحة ساخنة في غطاء الدخان وحل استرجاع مستضد ما قبل البور (10 mM Tris، 1 mM EDTA pH 9.0) في طنجرة الضغط. بمجرد أن يبدأ حل استرجاع المستضد في الغليان ، ضع الشرائح في الوعاء أفقيًا باستخدام زوج من ملقط وقفل الغطاء. يغلي على ارتفاع (ما يعادل 15 psi أو 103 كيلو باسكال) لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأنها تسترد مستضد الفائدة عن طريق كشف عن epitope المستضد (عبر ربط عبر تثبيت formalin) للسماح epitope الأجسام المضادة محددة الربط تلطيخ اللاحقة لن تعمل بدونه.
  8. إزالة طنجرة الضغط من الحرارة وإزالة الغطاء على الفور عن طريق تشغيل الصنبور البارد على رأس الغطاء في بالوعة. اترك الشرائح لتكواز لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد.
  9. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في 0.01 M الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) (pH 7.4) على شاكر المدارية.
  10. استخدام قلم للماء لرسم دوائر حول أنسجة الكلى مع الحرص على عدم السماح لأي أنسجة تجف في هذا الوقت.
  11. كتلة الأنسجة في 10٪ sera الدجاج في 5٪ البوم مصل البقر (BSA)/PBS (pH 7.4، 0.01 M) لمدة 30 دقيقة، 60 ميكرولتر لكل قسم. لا تغسل بعد هذه الخطوة ولكن بعناية إزالة حل حجب باستخدام ماصة 60 ميكرولتر، لا تدع المقاطع تجف.
  12. تطبيق كوكتيل الأجسام المضادة الأولية لβ-actin المخفف 1/1000 في 1٪ BSA / PBS (درجة الحرارة 7.4، 0.01 م)، 60 ميكرولتر لكل قسم واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة الرطوبة في 4 درجة مئوية.
  13. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  14. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية، الدجاج المضادة الأرنب 488 (1/200)، 60 ميكرولتر لكل قسم المخفف في 1٪ BSA / PBS (pH 7.4، 0.01 M) لمدة 40 دقيقة في RT.
  15. اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في PBS (pH 7.4، 0.01 M) على شاكر مداري.
  16. غمر الشرائح في 0.3٪ أسود السودان في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة في جرة كوبلين.
    ملاحظة: هذه الخطوة الهامة كما quenches الفلوروسينس الناتجة عن تثبيت الشكلية.
  17. غسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة الترسبات ثم تزج في برنامج تلفزيوني (درجة الH 7.4، 0.01 م) لمدة 10 دقائق لمنع مزيد من السودان الأسود العجل من تشكيل.
  18. جبل الشرائح على الأغطية الزجاج confocal باستخدام ثلاث قطرات 60 ميكرولتر من حل تصاعد مع DAPI وختم الأغطية مع طلاء الأظافر عن طريق تطبيق حول محيط الغطاء.
  19. السماح للشرائح لعلاج لمدة 24 ساعة في RT (للسماح للDAPI لاختراق) ومن ثم تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: من المهم أن تبقى في الظلام لمنع تلاشي المسابير الفلورسنت.
  20. شرائح الصورة باستخدام رئيس مسح ليزر confocal تعلق على المجهر. تثير الشرائح مع الليزر 405 لDAPI و488 ليزر للبيتا أكتين. التقاط صورة 1024 x1024 بكسل من المستوى الواحد باستخدام الالتقاط المتسلسل للخط والمتوسط 4 أسطر، وهو أمر ضروري للكشف عن ecDNA. ويستخدم 40x 1.0 ن هدف النفط.
    1. صورة الحد الأدنى من 20 كبيبات لكل عينة. حفظ الصور كملفات ND2.

2. DAPI و β-Actin تحليل

  1. تثبيت ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. تحقق من أن تجزئة Weka القابلة للتدريب متوفرة تحت الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب.
  3. إسقاط الصورة على شريط أدوات ImageJ. انقر على صورة | لون | قنوات الانقسام. صورة واحدة مع DAPI في تلطيخ الأزرق سوف تظهر جميع النوى وصورة 1 مع β-actin باللون الأخضر، الذي يحدد الجلجوميري.
    1. إنشاء ملف مدمج من الصور الفردية لرسم منطقة ذات أهمية (ROI) للglomerulus من خلال النقر على اللون | دمج القنوات. سيطلب مربع منبثق تعيين لون لكل قناة. بعد تعيين كل قناة لون، حدد المربع إنشاء مركب ومربع الاحتفاظ بالصور المصدر وانقر فوق موافق. ستظهر صورة مركبة مدمجة.
    2. باستخدام تلطيخ β-actin كدليل، رسم عائد الاستثمار حول خصلة الكبيات. احتفظ بهذه الصورة جانباً لاستخدام عائد الاستثمار في نهاية هذا البروتوكول.
  4. تنفيذ التمويه الغاوسي على صورة DAPI زرقاء واحدة. انقر على معالجة | مرشحات | ضبابي غاوسي، وضعت في 1-2.00. الصورة سوف تبدو الآن غير واضحة قليلا، ولكن النواة هي الآن على نحو سلس والخلفية خففت.
    ملاحظة: هذه الخطوة هو preformed لإزالة الضوضاء لتنظيف الصورة من artifacts التي قد تمنع الكشف ذات الصلة من سمات الصورة لتحليلها.
  5. انقر على الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب.
  6. باستخدام أداة الخط على شريط الأدوات في ImageJ ، تتبع أولا حول نوات سليمة باستخدام أدوات اليد الحرة (هناك خيارات أداة سطر ، دائري ، ومربع المتاحة للاختيار من بينها) ، ثم إضافة إلى إضافة فئة 1 مربع.
  7. باستخدام أداة الخط على شريط الأدوات في ImageJ تحديد مناطق الخلفية إلى مربع الفئة 2.
  8. انقر فوق تسمية الزر إنشاء فئة جديدة على إطار تجزئة Weka وتسمية "ecDNA". استخدم أداة الخط (من شريط أدوات ImageJ) لتحديد الحمض النووي الإضافي الملطخ بواسطة DAPI.
  9. انقر على زر Train Classifier في قائمة التدريب في نافذة تجزئة Weka القابلة للتدريب.
    ملاحظة: سوف يظهر الزر STOP بدلاً من زر "تصنيف القطار" ويبقى حتى انتهاء التدريب. لا تنقر على هذا الزر أثناء التدريب حيث سيتم مقاطعة العملية.
  10. انقر على زر إنشاء نتيجة لإنشاء صورة مع جميع المكونات المصنفة ، والتي تتكون من نوى سليمة ، والخلفية وecDNA التي تم تحديدها.
  11. انقر على زر الحصول على احتمال. قم بتبديل الماوس لإعطاء صورة بالأبيض والأسود لكافة الفئات مع تمييز كائن التحديد باللون الأبيض.
  12. تكرار هذه الصورة من خلال النقر على صورة | تكرار.
  13. التبديل إلى الشاشة باستخدام زر الماوس الذي يحتوي على ecDNA. تطبيق عتبة للحصول على ما تم تعريفه باسم ecDNA فقط. انقر فوق تطبيق عندما تكون العتبة كافية.
  14. إذا بعد العتبة، هناك المزيد من المناطق من الحمض النووي التي ليست ecDNA، والعودة إلى الصورة الأصلية المدربة، إضافة المزيد من المصنفات، وتكرار الخطوات 2.1-2.13.
  15. انقر على صورة | ضبط الصورة | جعل ثنائي. انسخ عائد الاستثمار الكبوي الذي تم في الخطوة 2.3 وانقر فوق Ctrl+Shift+E. تفعيل نافذة Weka عن طريق تحرير | اختيارات | الاستعادة، التي تعيد التحديد. انقر فوق تحليل الجسيمات، والتي سوف تقيس فقط جزيئات ecDNA داخل الكبيات.
    ملاحظة: يتم حساب ورقة النتائج مع عدد الجسيمات والمساحة ومتوسطات البكسل والنسبة المئوية للكبيبات التي تحتوي على ecDNA. ويمكن تصدير هذه النتائج إلى جدول بيانات وحفظها، لتحليل إحصائي لاحق.
  16. حفظ المصنف كما ecDNA.classifier عن طريق النقر حفظ المصنف من القائمة خيارات في التطبيق ImageJ على سطح المكتب. ثم انقر فوق حفظ البيانات من قائمة الخيارات وحفظ كـ ecDNA.arff في المجلد ImageJ. يجب إضافة عائد الاستثمار يدويًا في كل مرة حيث سيتغير حجم وشكل الكبيات ، ومع ذلك فقد تعلم البرنامج ما هو ecDNA.
  17. لإعادة تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.5 مع صورة جديدة. انقر فوق تحميل المصنف من قائمة الخيار ثم ecDNAmodel.classifier في المجلد ImageJ من الخطوة 2.16. قائمة السجل سوف يطفو على المنبثقة وتشغيل النموذج.
  18. بمجرد تشغيل النموذج، انقر فوق "بيانات التحميل" في قائمة الخيارات وحدد الملف ecDNA.arff المحفوظة في المجلد ImageJ من الخطوة 2.16. انقر على إنشاء نتيجة. إذا كانت الصورة الناتجة قد فشلت في التقاط جميع النوى أو الخلفية أو ecDNA انقر على إعادة تدريب المصنف وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد. أكمل عملية التحليل بتكرار الخطوات 2.9-2.16.
    ملاحظة: يمكن استخدام عدة صور لإنشاء النموذج النهائي المستخدم للكشف عن ecDNA. ويتحقق ذلك عن طريق تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد والبيانات في المجلد ImageJ. يمكن أن يكون هذا مهمًا بشكل خاص عندما تكون العينات المختلفة ذات خلفية أعلى. برنامج تجزئة Weka متوافق أيضا مع لغة الماكرو ImageJ التي تمكن العديد من الأوامر أن تكون ماكرو للتسجيل لأتمتة بعض الخطوات.

3. قياس الفخاخ العدلات خارج الخلية وecMPO

ملاحظة: هذه الطريقة تحدد NETs عن طريق التكلس من الحمض النووي خارج الخلية، Citrullinated Histones peptidyl أرجيناز 4 (PAD4) و MPO.

  1. حث نموذج 20 يوما من glomerulonephs المضادة للنخاع (المضادة MPO-GN) في 8-10 أسابيع الفئران C57/Bl6 القديمة، مع الضوابط9.
    1. القتل الرحيم الفئران إنسانيا باستخدام غرفة CO2.
    2. إزالة الكلى عن طريق إجراء شق خط الوسط الأمامي من خلال الجلد مع مقص، ومن ثم قطع بعناية الصفاق ودبوس مرة أخرى على لوحة تشريح. باستخدام ملقط جانبا اللفافة الكلوية الأمامية والصاقوم الجداري وقطع الكلى مجانا عن طريق قطع الحالب والأوعية الدموية (الشريان الكلوي والوريد) في الحوض الكلوي. إزالة مع ملقط وقطع الكلى في النصف (الطائرة القوس) مع مشرط حجم 22.
    3. ضع الكلى في التثبيت (4٪ من الـ 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة(RT) إزالة ونقع الكلى الثابتة في 30٪ الإيثانول لمدة 24 ساعة قبل المعالجة.
  2. معالجة الكلى باستخدام دورة قياسية مدتها 6 ساعات:
    70% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    90% الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 25 دقيقة
    100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 20 دقيقة
    إكسيلين لمدة 30 دقيقة
    إكسيلين لمدة 40 دقيقة
    الشمع لمدة 30 دقيقة
    الشمع لمدة 35 دقيقة
    الشمع لمدة 40 دقيقة
    ملاحظة: لا ينبغي أن تتعرض الكلى للتعرض لفترات طويلة للحرارة في الشمع، لأنها يمكن أن تدمر المستضدات ذات الأهمية.
  3. قطع 3 ميكرومتر أقسام على microtome وجبل على الشرائح المجهر الزجاج المتاحة تجاريا المغلفة مع شحنة إيجابية. السماح لتجف بين عشية وضحاها
  4. وضع الشرائح الزجاجية في رف الشريحة في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: الخطوات 3.3-3.4 الهامة لضمان المقاطع لا تعويم إيقاف أثناء خطوة استرداد مستضد.
  5. تزج الشرائح في اثنين من التغييرات من المذيبات (الزيلين أو بديل) لمدة 40 دقيقة لكل منهما، في غطاء محرك الدخان.
  6. شرائح إعادة الترطيب في الإيثانول 100٪ ، 100 ٪ الإيثانول ، 70 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل من.
  7. يغسل لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور.
  8. ضع صفيحة ساخنة في غطاء أبخرة وحل استرجاع مستضدات ما قبل البور (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) في طنجرة ضغط. بمجرد أن يبدأ حل استرجاع المستضد في الغليان مكان الشرائح في وعاء أفقيا باستخدام زوج من ملقط وتأمين الغطاء. يغلي على ارتفاع (ما يعادل 15 psi أو 103 كيلو باسكال) لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة باسترداد المستضد من الفائدة عن طريق فك كشف عن epitope المستضد (عبر ربط عبر تثبيت formalin) للسماح epitope الأجسام المضادة محددة ربط تلطيخ اللاحقة لن تعمل دون هذه الخطوة.
  9. إزالة طنجرة الضغط من الحرارة وإزالة الغطاء على الفور عن طريق تشغيل الصنبور البارد على رأس الغطاء في بالوعة. اترك الشرائح لتكواز لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد.
  10. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) (pH 7.4، 0.01 M) على شاكر المدارية.
  11. استخدام قلم للماء لرسم دوائر حول أنسجة الكلى مع الحرص على عدم السماح لأي أنسجة تجف في هذا الوقت.
  12. كتلة الأنسجة في 10٪ sera الدجاج في 5٪ البوم مصل البقر (BSA)/PBS (pH 7.4، 0.01 M) لمدة 30 دقيقة، 60 ميكرولتر لكل قسم. لا تغسل بعد هذه الخطوة ولكن إزالة بعناية حل حجب باستخدام ماصة 60 ميكرولتر. لا تدع المقاطع تجف.
  13. جعل كوكتيل من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ BSA / PBS (pH 7.4، 0.01 م) في 1 أنبوب. تطبيق 60 ميكرولتر لكل أقسام الكلى. تركيز الأجسام المضادة الأولية هي كما يلي:
    أرنب المضادة الإنسان / الماوس H3Cit 1/100
    الماوس المضادة للإنسان / الماوس PAD4 1/50
    الماعز المضادة الإنسان / الماوس MPO 1/200
  14. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة الرطوبة.
  15. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  16. جعل مزيج من الأجسام المضادة الثانوية في 1 أنبوب. يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية في 1٪ BSA / PBS ، 60 ميكرولتر لكل قسم على النحو التالي:
    الدجاج المضادة الأرنب 488 1/200.
    مضاد الماوس الدجاج 647 1/200.
    الدجاج المضادة الماعز 594 1/200.
  17. احتضان في RT لمدة 40 دقيقة.
  18. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  19. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية 1:200 في 1٪ BSA / PBS (pH 7.4، 0.01 م) لمدة 40 دقيقة في RT 60 ميكرولتر لكل قسم.
  20. غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني (pH 7.4، 0.01 م) على شاكر المدارية.
  21. تزج الشرائح في 0.3٪ أسود السودان في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
  22. غسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة الترسبات ثم تزج في برنامج تلفزيوني (درجة الH 7.4، 0.01 م) لمدة 10 دقائق لمنع مزيد من السودان أسود العجل من تشكيل.
  23. جبل الشرائح على أغطية الزجاج confocal باستخدام ثلاث قطرات 60 ميكرولتر من حل التركيب مع DAPI. ختم الأغطية مع طلاء الأظافر عن طريق تطبيق حول محيط الغطاء.
  24. السماح للشرائح لعلاج لمدة 24 ساعة في RT (للسماح للDAPI لاختراق) ومن ثم تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء. إبقاء في الظلام لمنع يتلاشى من تحقيقات الفلورسنت.
  25. شرائح الصورة باستخدام رئيس مسح ليزر confocal تعلق على المجهر. تثير الشرائح مع ليزر 405 لDAPI و488 ليزر لH3Cit، 561 لMPO، و 647 لPAD4. التقاط صورة 1024x1024 بكسل من الطائرة الواحدة باستخدام التقاط خط تسلسلي ومتوسط 4-خط وهو أمر ضروري للكشف عن ecDNA. استخدام 40x 1.0 NA هدف النفط. صورة الحد الأدنى من 20 كبيبات لكل عينة. حفظ الصور كملفات ND2.

4. الفخاخ العدلية خارج الخلية وتحليل ecMPO

  1. تثبيت ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. تحقق من أن تجزئة Weka القابلة للتدريب متوفرة تحت الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب.
  3. إسقاط الصورة في ImageJ. انقر على صورة | لون | قنوات الانقسام. صورة واحدة مع DAPI باللون الأزرق تلطيخ جميع النوى سوف تظهر، صورة واحدة مع H3Cit باللون الأخضر، صورة واحدة مع MPO باللون الأحمر، وصورة واحدة مع PAD4 باللون الأبيض سوف تظهر.
    1. إنشاء ملف مدمج من الصور الفردية لرسم عائد الاستثمار للglomerulus عن طريق النقر على اللون | دمج القنوات. سيطلب مربع منبثق تعيين لون لكل قناة. بعد تعيين كل قناة لون، حدد المربع إنشاء مركب ومربع الاحتفاظ بالصور المصدر وانقر فوق موافق. تظهر صورة مدمجة. على عكس بروتوكول ecDNA سابقا سوف نستخدم صورة مركبة لتنفيذ بقية الخطوات.
  4. تنفيذ طمس غاوسي على الصورة المركبة. وهذا يسمح تنعيم من النوى. انقر على معالجة | مرشحات | ضبابي غاوسي، وضعت في 1.00-2.00. الصورة سوف تبدو الآن غير واضحة قليلا ولكن النواة هي الآن على نحو سلس والخلفية خففت.
    ملاحظة: هذه الخطوة هو preformed لإزالة الضوضاء لتنظيف الصورة من artifacts التي قد تمنع الكشف ذات الصلة من سمات الصورة لتحليلها.
  5. انقر على الإضافات | تجزئة | تجزئة Weka القابلة للتدريب. ستظهر نافذة جديدة بالكامل مع الصورة التي سيتم تحليلها وأدوات القائمة تجزئة Weka.
  6. باستخدام أداة الخط على شريط الأدوات (في ImageJ)، تتبع أولا حول النوى سليمة ليست إيجابية لجميع مكونات NET 4 (MPO، PAD4، DAPI و H3Cit) باستخدام أداة اليد الحرة وثم إضافة إلى إضافة فئة 1 مربع.
  7. باستخدام أداة الخط على شريط أداة ImageJ تحديد مناطق الخلفية إلى المربع الفئة 2.
  8. انقر على تسمية الزر إنشاء فئة جديدة في قائمة التسمية والتسمية "NETs". استخدم أداة الخط لتحديد NETS التي تم تحديدها كـ DAPI (الأزرق) و MPO (الأحمر) و PAD4 (أبيض) و هستونات citrullinated (الأخضر).
  9. انقر على تسمية زر إنشاء فئة جديدة في قائمة التسمية والتسمية "ecMPO". استخدم أداة الخط لتحديد MPO (أحمر) خالٍ من الخلايا.
  10. انقر على زر تصنيف القطار في قائمة التدريب في إطار تجزئة Weka القابلة للتدريب.
    ملاحظة: سوف يظهر الزر STOP بدلاً من زر "تصنيف القطار" ويبقى حتى انتهاء التدريب. لا تنقر على هذا الزر أثناء التدريب وسيتم مقاطعة العملية.
  11. انقر على زر إنشاء نتيجة في قائمة التدريب ويتم إنشاء صورة مع جميع المكونات المصنفة ، والتي تتكون من نوى سليمة ، والخلفية وما تم تحديده على أنه ecMPO.
  12. انقر على زر الحصول على احتمال في القائمة التدريبية. قم بتبديل الماوس لإعطاء صورة بالأبيض والأسود لكافة الفئات مع تمييز كائن التحديد باللون الأبيض.
  13. تكرار كل من صافي احتمال وصورة احتمال ecMPO من خلال النقر على صورة | تكرار.
  14. التبديل إلى الشاشة باستخدام زر الماوس الذي يحتوي على NETs. تطبيق حد لضمان فقط تسليط الضوء على NETs المحددة. على شريط أدوات القائمة ImageJ، انقر على صورة | ضبط | الحد الأدنى. نقل أشرطة تبديل انزلاق حتى يتم تمييز مكونات NET. انقر فوق تطبيق عندما تكون راضية عن الحد الأدنى. كرر نفس الخطوات لecMPO.
  15. إذا بعد عتبة لا تزال هناك اكتشاف مناطق ecmpo أو NETs، والعودة إلى الصورة الأصلية المدربة وإضافة المزيد من المصنفات وإعادة تطبيق الخطوات 4.1-4.14.
  16. انقر على صورة | ضبط الصورة | جعل ثنائي. نسخ العائد على الاستثمار الكبيّة الذي تم في الخطوة 4.3، انقر فوق Ctrl+Shift+E. تفعيل نافذة Weka عن طريق تحرير | اختيارات | الاستعادة، التي تعيد التحديد. انقر فوق تحليل الجسيمات لقياس فقط جزيئات صافي داخل glomerulus.
  17. التبديل إلى الشاشة باستخدام زر الماوس الذي يحتوي على ecmpo. تطبيق عتبة لضمان الحصول على ECMPO المحدد فقط. انقر فوق تطبيق عندما تكون راضية عن الحد الأدنى. كرر الخطوة 4.16 أعلاه.
    ملاحظة: يتم حساب ورقة النتائج مع عدد الجسيمات والمساحة ومتوسطات البكسل والنسبة المئوية للكبيبات التي تحتوي على كل من NETs وecMPO. ويمكن بعد ذلك وضع هذه النتائج في جدول البيانات وحفظها، لتحليل إحصائي لاحق.
  18. حفظ المصنف كما NETs.classifier بالنقر فوق حفظ المصنف من قائمة الخيارات وحفظ الملف في التطبيق ImageJ على سطح المكتب (مجلد ImageJ). ثم انقر فوق حفظ البيانات من قائمة الخيارات وحفظ كملف NETs.arff. سيكون من الواجب إضافة عائد الاستثمار الكبيائي يدويًا في كل مرة حيث سيتغير حجم وشكل الكبيات ، ولكن البرنامج قد تعلم ما هي كل من NETs و ecMPO.
  19. لإعادة تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، كرر الخطوات 4.1-4.5 مع صورة جديدة. انقر فوق تحميل المصنف من قائمة الخيارات. انقر على Nets.classifier في المجلد ImageJ. قائمة السجل سوف يطفو على المنبثقة وتشغيل نموذج، وبمجرد تشغيل النموذج انقر على بيانات التحميل في قائمة الخيارات وحدد الملف NETs.arff.
    1. انقر على إنشاء نتيجة. إذا كانت الصورة الناتجة قد فشلت في التقاط جميع النوى أو الخلفية أو ecDNA انقر على إعادة تدريب المصنف وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد. أكمل عملية التحليل بتكرار الخطوات 4.11-4.19.
      ملاحظة: يمكن استخدام عدة صور لإنشاء النموذج النهائي المستخدم للكشف عن ecDNA وecMPO وNETs. ويتحقق ذلك عن طريق تطبيق النموذج على الصور اللاحقة، وإضافة المزيد من المصنفات وحفظ النموذج الجديد والبيانات في المجلد ImageJ. يمكن أن يكون هذا مهمًا بشكل خاص عندما تكون العينات المختلفة ذات خلفية أعلى. يتوافق برنامج تجزئة Weka مع لغة الماكرو ImageJ التي تمكن العديد من الأوامر من أن تكون قابلة للتسجيل ماكرو لأتمتة بعض الخطوات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل هذه الصور الخطوات المتعددة المطلوبة لاستخدام تجزئة Weka القابلة للتدريب بنجاح لتقليل القياس اليدوي كثيف العمالة لـ ecDNA في أنسجة الكلى FFPE الملطخة بالفلور من فأرة مع GN مضادة MPO. وتتلخص هذه الخطوات في الشكل 1 والشكل 2 مع الصور المأخوذة مباشرة من برنامج تجزئة Weka، والتي تحدد كل خطوة في عملية التحليل. ثم تظهر القياسات من هذا التحليل في الشكل 3 مما يدل على قدرة البرنامج على تحديد الكميات المختل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد بروتوكولات متعددة تقيس علامات البروفات في المصل والبول لكل من المرضى ونماذج الماوس من التهاب الكريات. يسمح هذا البروتوكول الموصوف بتحليل منتجات موت الخلايا (ecDNA وNETs وecMPO) داخل الكبيات مباشرة. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعداد الأنسجة والتصوير. العنصر الرئيسي المقيد لاستخدام طريقة تلطيخ الفلورسنت للتحليل هو الأنسجة autofluorescence. الأنسجة البارافين ثابتة formalin يخضع ل المناعةflufluorescence التي يمكن أن تحجب تلطيخ الفلورسنت محددة. الخطوة الأخيرة في طريقة تلطيخ حيث يتم غمر الشرائح في السودان ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا شيء للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف موناش التصوير الصغرى لاستخدام نيكون C1 تستقيم مجهر الليزر confocal ومنصة الهستولوجيا موناش لمعالجة أنسجة الكلى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ألبومين مصل الأبقارSIGMAA21535٪ و 1٪ تتكون المحاليل في PBS ، ويمكن تصنيعها بكميات كبيرة وتجميدها - التخلص منها بمجرد إذابتها.
الجسم المضاد للماعز IgG (H + L) المضاد المتصاص Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468يدور في جهاز طرد مركزي صغير لمدة دقيقة واحدة قبل الاستخدام لتجنب أي اقتران مجاني في كوكتيل الأجسام المضادة
للدجاج المضاد IgG (H + L) الجسم المضاد الممتص للصليب ، Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468تدور في جهاز طرد مركزي صغير لمدة دقيقة واحدة قبل الاستخدام لتجنب أي اقتران مجاني في كوكتيل
الأجسام المضادةالدجاج المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الممتص عبر Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441يدور في جهاز طرد مركزي صغير لمدة دقيقة واحدة قبل الاستخدام لتجنب أي اقتران مجاني في كوكتيل الأجسام المضادة
الخاص بك مصل الدجاجSIGMAC5405مصنوع من 1٪ BSA / PBS
Coverslips 24 × 60 ممAzerscientificES0107222# 1.5 هذا ليس سماكة قياسية - مصممة للاستخدام في الفحص
المجهري متحد البؤرEDTA 10mMSIGMAE6758أضف TRIS و EDTA معا في الماء المقطر ودرجة الحموضة إلى 9 ، لاسترجاع المستضد ، يمكن تكوينه في محلول 10x
الإيثانول 30٪ و 70٪ و 100٪Chem SupplyUN1170يتم توفيره على شكل إيثانول غير مشوه بنسبة 100٪ - مخفف إلى 30٪ و 70٪ باستخدام الماء المقطر
الفورمالديهايد ، 4٪ (10٪ فورمالين محايد مخزن)TRAJANNBF-500يتم وضع الكلى في أنبوب سعة 5 مل يحتوي على 3 مل من الفورمالين لمدة 16 ساعة في RT ، ويجب استخدام الفورمالين في شفاط الدخان
الأنسجة الزجاجية - Ultra Super Frost ، Menzel Glaze ، 25 × 75 × 1.0 ممTRAJANJ3800AM4من الضروري استخدام الشرائح المطلية الموجبة الشحنة. لا نوصي باستخدام بولي إل ليسين لطلاء الشرائح حيث تزيح الأنسجة من الشرائح أثناء خطوة استرجاع المستضد
الماعز المضادة للإنسان / الفأر MPO الأجسام المضادةR & DAF3667Aliquot والتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08تستخدم بشكل أنيق ، في حاويات رف تلطيخ 200 مل ، تستخدم في غطاء الدخان
قلم مسعورVECTOR LabsH-400استخدم لرسم دائرة حول أنسجة الكلى
الفأر المضاد للإنسان / الفأر Peptidyl arginase 4 (PAD4)ABCAMab128086Aliquot والتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول
رأس ليزر المسح الضوئي متحد البؤر من نيكون C1 متصل بميكروسكوب مقلوب نيكون Ti-Eمتماسك علميAliquot وتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول
فوسفات مخزن محلول ملحيSIGMAP381350.01M PB / 0.09٪ كلوريد الصوديوم المكياج 5 لتر في المرة الواحدة
قدر الضغط 6 لتر تيفال سكيور 5 نيو غير القابل للصدأتيفالGSA-P2530738تم شراؤها من متجر الأدوات المنزلية
المحلي Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962ضع القطرات مباشرة على غطاء
الأرنب المضاد للإنسان / الفأر بيتا الأكتين المضادABCAMab8227Aliquot وقم بالتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول
الأرنب المضاد للإنسان / الفأر H3Cit الجسم المضادABCAMab5103Aliquot والتجميد عند 80 درجة تحت الصفر عند الوصول
رف تلطيخ 24 شريحةProScitechH4465يجب أن يكون رف التلوين المختار قادرا على تحمل الغليان تحت الضغط والحضانة في فرن 60 درجة
السودان الأسود BSIGMA1996640.3٪ أضف 3 جم إلى زجاجة سعة 1 لتر في 70٪ إيثانول ، وقم بالتصفية والحماية من الضوء المستقر لمدة 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة
Tris 10mMSIGMAT4661أضف TRIS و EDTA معا في الماء المقطر ودرجة الحموضة إلى 9 ، لاسترجاع المستضد ، يمكن تكوينه في محلول 10x
XyleneTrajanXL005 / 20يجب استخدامه في غطاء الدخان
شرائح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412(2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular DNAGlomerulonephritisTrainable Weka SegmentationFFPE Tissue StainingConfocal MicroscopyImage AnalysisAutofluorescence QuenchingNeutrophil Extracellular TrapsExtracellular MyeloperoxidaseMachine Learning Classification

Related Articles