مقالة منهجية

الفحص المباشر للاستزراع السائل لتقييم إنتاج البروتينات غير المتجانسة باستخدام طفرة أوكسوتروفية من Aspergillus oryzae

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61219

⸱

مايو 12, 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

في هذه المقالة

ملخص

تم تطوير طريقة فحص الاستزراع السائل المباشر (DLC) والتي تقلل بشكل كبير من الوقت اللازم لتحويل البروتوبلاست بوساطة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) للفطر الخيطي ، Aspergillus oryzae ، عند استخدامه لتقييم الإنتاج الإفرازي للبروتينات غير المتجانسة. تزيد هذه الطريقة بشكل كبير من إنتاجية بروتوكول التقييم.

الملخص

Aspergillus oryzae ، وهو فطر خيطي ، هو أحد أكثر المضيفين استخداما للتطبيقات الصناعية بما في ذلك إنتاج البروتينات على نطاق واسع. تستخدم طريقة تحويل البروتوبلاست بوساطة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) بشكل عام لإدخال الجينات غير المتجانسة في A. oryzae. تتطلب الطريقة التقليدية عادة ثلاثة أسابيع لفحص المحولات المواتية. هنا ، يتم تقديم تقنية جديدة ، وهي طريقة فحص الثقافة السائلة المباشرة (DLC) ، والتي تقلل من وقت الفحص إلى ستة أيام في شكل قارورة 200 مل أو إلى 10 أيام في شكل صفيحة دقيقة 24 بئرا. تضمن طريقة فحص DLC الحصول على المحولات الإيجابية وتقييم الإنتاج الإفرازي للبروتينات غير المتجانسة في خطوة واحدة ، على عكس طريقة الفحص التقليدية حيث يلزم وجود خطوتين منفصلتين لنفسها. تم وصف بروتوكول تحويل البروتوبلاست بوساطة PEG ل A. oryzae ، والذي يتكون من خمس خطوات: تحضير معلق الأبواغ الطازجة ، والزراعة المسبقة ، وتحضير البروتوبلاست ، وإدخال الحمض النووي ، وفحص DLC. للحصول على نتائج ناجحة في فحص DLC ، من الأهمية بمكان استخدام وسيط غني بالمغذيات مع ضغط تناضحي محسن. يجب أن يزيد البروتوكول من تعميم استخدام A. oryzae كمضيف من الخيارات في الإنتاج الصناعي للبروتينات.

المقدمة

Aspergillus oryzae هو كائن حي دقيق مهم في صناعة الأغذية اليابانية تم استخدامه لأكثر من 1,000 عام في إنتاج الأطعمة المخمرة ، مثل الساكي (نبيذ الأرز) ، وشويو (صلصة الصويا) ، والميسو (معجون فول الصويا)1،2. لديه القدرة على إفراز كمية كبيرة من البروتينات ، مثل البروتياز والأميليز3. معلومات تسلسل الجينوم ل A. oryzae متاحةأيضا 4. علاوة على ذلك ، تم إنشاء تقنيات هندسة وراثية قوية ومفيدة عمليا لهذه الفطريات5،6،7،8،9،10. تم استخدام المحولات المواتية كمضيفين للإنتاج الإفرازي للبروتينات غير المتجانسة11،12،13،14.

التثقيب الكهربائي ، والتحول بوساطة Agrobacterium ، وتحويل البروتوبلاست بوساطة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) هي التقنيات المستخدمة لإدخال الجينات غير المتجانسة في A. oryzae15،16،17. تم استخدام طريقة تحويل البروتوبلاست بوساطة PEG على نطاق واسع منذ أن تم الإبلاغ عنها لأول مرة ل Neurospora crassa في عام 197918. في هذه الطريقة ، يتم تحضير البروتوبلاست وخلطها مع PEG والجين غير المتجانس الذي سيتم إدخاله في الخلايا. تتعرض جدران البروتوبلاست للخطر إنزيميا ، مما يجعل الخلايا عرضة للإجهاد البدني والتغيرات في الضغط الاسموزي19،20. تتضمن طريقة الفحص التقليدية المستخدمة في الإنتاج الإفرازي للبروتينات غير المتجانسة ثلاث خطوات: الحصول على المحولات الإيجابية (على صفيحة أجار ناعمة) ، واختيار المحولات الحقيقية والخاطئة (على لوحة أجار) ، وتقييم الإنتاج الإفرازي للبروتينات غير المتجانسة (في الثقافة السائلة) ؛ تستغرق كل خطوة من هذه الخطوات سبعة أيام (الشكل 1). وبالتالي ، تتطلب الطريقة التقليدية عادة حوالي ثلاثة أسابيع.

الوقت اللازم لفحص خلايا A. oryzae المحولة أطول بكثير من الوقت المطلوب للكائنات الحية الدقيقة الأخرى المستخدمة بشكل شائع في أبحاث التكنولوجيا الحيوية ، مما يجعل العملية أكثر تعقيدا. على سبيل المثال ، عند استخدام الإشريكية القولونية كمضيف ، يستغرق الأمر حوالي يومين من إدخال الحمض النووي إلى تأكيدتأثيره 21.

للتحايل على القيود المرتبطة باستخدام A. oryzae كما هو مذكور أعلاه ، هنا ، يتم تقديم طريقة جديدة لفحص الثقافة السائلة المباشرة (DLC) ، والتي تتيح فحصا أكثر سرعة وبساطة لتقييم الإنتاج الإفرازي للبروتينات غير المتجانسة (الشكل 1). في طريقة DLC ، يتم استخدام متحولة يوريدين أوكسوتروفيك ووسط سائل غني بالمغذيات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن إكمال خطوة الفحص في غضون ستة أيام بعد إدخال الحمض النووي في البروتوبلاست في شكل قارورة 200 مل أو في غضون 10 أيام في شكل صفيحة دقيقة 24 بئرا. علاوة على ذلك ، ليست هناك حاجة إلى التحضير الذي يستغرق وقتا طويلا وشاقا لوسائط لوحة الأجار في هذه الطريقة. هناك ميزة كبيرة في استخدام الطريقة الموصوفة حديثا ، لا سيما بالنظر إلى حقيقة أن الطريقة التقليدية تتطلب وصيفين مختلفين: لوحة الأجار الناعمة للحصول على المحولات الإيجابية ، والتي تتطلب معالجة دقيقة وتحكما في درجة الحرارة ، ولوحة أجار صلبة لاختيار المحولات الحقيقية.

figure-introduction-1
الشكل 1: تخطيطي لتحول البروتوبلاست بوساطة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) للفطر الخيطي ، Aspergillus oryzae.
(اللوحة العلوية) طريقة الفحص التقليدية. (اللوحة السفلية) طريقة فحص الاستزراع السائل المباشر (DLC). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير تعليق الأبواغ الطازجة

  1. تلقيح 20 ميكرولتر من معلق بوغ المخزون (1 × 107 جراثيم / مل) في وسط صفيحة استزراع تحتوي على وسط Czapek-Dox (CD) مع 20 ملي مولار من اليوريدين (تعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، الجدول 1).
  2. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 7 أيام لتعزيز تكوين الأبواغ.
  3. أضف 1.5 مل من محلول Tween 20 بنسبة 0.01٪ (معقم بالتعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) إلى لوحة الاستزراع التي تحتوي على جراثيم الجراثيم عن طريق الكشط باستخدام موزع الخلايا.
  4. اجمع معلق الأبواغ في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل باستخدام ماصة.
  5. قم بتخزين التعليق على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: استخدم تعليق البوغ في الإجراء التالي في غضون أسبوعين. لعمل مخزون للتخزين طويل الأجل ، أضف الجلسرين إلى معلق الأبواغ إلى تركيز نهائي قدره 15٪ وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية.

2. ما قبل الثقافة

  1. أضف 100 مل من وسط البولي بتون دكسترين (PD) (الجدول 2) في قارورة إرلينماير سعة 500 مل ، وقم بتعقيمها عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. بعد التأكد من انخفاض درجة حرارة الوسط ، أضف محلول اليوريدين ، المعقم بالمرور عبر مرشح بحجم مسام 0.22 ميكرومتر ، إلى تركيز نهائي يبلغ 20 مليمتر.
  3. أضف 200 ميكرولتر من معلق الأبواغ (1 × 107 جراثيم / مل) المحضر في الخطوة 1.4 ، واحتضانه عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 36 ساعة.

3. تحضير البروتوبلاست

  1. احصد الكتلة الحيوية الفطرية المحضرة في الخطوة 2.3 على مرشح زجاجي بحجم مسام 30 ميكرومتر (معقمة عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
  2. صب 100 مل من الماء المقطر (DW) (معقمة عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) على الفلتر الزجاجي وحرك عدة مرات باستخدام ملعقة (معقمة عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
  3. بعد الغسيل باستخدام DW ، اسكب 100 مل من محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) (معقم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، الجدول 3) على الفلتر الزجاجي وحرك عدة مرات باستخدام ملعقة.
  4. انقل حوالي 1-2 مل (حجم رطب) من الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل باستخدام ملعقة (معقمة عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
  5. بعد إضافة 15 مل من محلول الإنزيم (معقم بالمرور عبر مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر ، الجدول 4) إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أضف محلول كلوريد الصوديوم حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 30 مل.
  6. أغلق الغطاء وأغلقه بغشاء البارافين. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
  7. قم بتدفق المحلول الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر متصلة بالأنبوب المخروطي سعة 50 مل لإزالة الفطريات غير المتفاعلة.
  8. جهاز طرد مركزي محلول البروتوبلاست في أنبوب مخروطي سعة 50 مل عند 2,150 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  9. تخلص من المادة الطافية برفق لمنع إزاحة الحبيبات. أضف 1 مل من المحلول المعقم المثلج B (المعقم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، الجدول 5) البروتوبلاستات المترسبة برفق عن طريق سحب العينات.
  10. انقل البروتوبلاستيات المعلقة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل.
  11. جهاز طرد مركزي عند 2،220 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية. ثم أضف 1 مل من محلول المثلج البارد B الحبيبات برفق عن طريق سحب العينات.
  12. كرر الخطوة 3.9.
  13. باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بقياس عدد البروتوبلاستات تحت المجهر.
  14. قم بإعداد معلق البروتوبلاست (1-3 × 107 بروتوبلاست / مل) في المحلول B وتخزينه على الثلج حتى الاستخدام.
    ملاحظة: استخدم تعليق البروتوبلاست على الفور في الإجراء التالي.

4. إدخال الحمض النووي لإنتاج البروتين الإفرازي

  1. باستخدام بلازميد يحتوي على كاسيت الحمض النووي لإنتاج البروتين الإفرازي كقالب ، قم بتضخيم جزء الحمض النووي المطلوب لإنتاج الإفرازات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  2. قم بإعداد عينة الحمض النووي لاستخدامها في التحويل عن طريق معالجة منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية PCR.
  3. أضف 1 مل من محلول البروتوبلاست ، و 200 ميكرولتر من المحلول C (معقم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، الجدول 6) ، و 50 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (0.5-1 ميكروغرام / ميكرولتر) في أنبوب مخروطي معقم مبرد مسبقا 15 مل ، واخلط المحلول برفق عن طريق سحب العينات.
    ملاحظة: الحل C شديد اللزوجة ويمكن أن يكون من الصعب التعامل معه. تأكد من الخلط الشامل عن طريق سحب العينات.
  4. احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  5. أضف 1.5 مل من المحلول C ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات ، ثم اترك المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة.

5. الفحص المباشر لثقافة السائل

ملاحظة: حدد نظام الثقافة باستخدام قوارير Erlenmeyer (القسم 5.1) أو الألواح الدقيقة (القسم 5.2).

  1. نظام الاستزراع باستخدام قارورة إرلينماير سعة 200 مل
    1. أضف 50 مل من وسط PD الذي يحتوي على 0.8 M sorbitol إلى قارورة Erlenmeyer سعة 200 مل ، وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. بعد التأكد من انخفاض درجة حرارة الوسط ، أضف معلق البروتوبلاست المحضر في الخطوة 4.5 إلى التركيز النهائي 1 × 105 بروتوبلاست / مل.
    3. احتضان المزرعة لمدة 6 أيام عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 120 دورة في الدقيقة.
    4. اجمع 1 مل من الوسط واحفظها في أنبوب 1.5 مل عند 4 درجات مئوية. قم بتخزين عينة الثقافة عند -20 درجة مئوية ، إذا لم يتم تحليلها على الفور.
    5. امزج 20 ميكرولتر من عينة المزرعة و 20 ميكرولتر من عينة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) (الجدول 7) في أنبوب 1.5 مل واتركه يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. بعد التبريد على الجليد ، قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة المسلوقة و 5 ميكرولتر من معيار البروتين الملون مسبقا على هلام مسبقة الصب وقم بتحليل الإنتاج الإفرازي للبروتين غير المتجانس المستهدف بواسطة الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) 10.
  2. نظام الاستزراع باستخدام صفيحة دقيقة 24 بئر
    1. أضف معلق البروتوبلاست المحضر في الخطوة 4.5 إلى وسط PD المعقم المحتوي على السوربيتول 0.8 M إلى التركيز النهائي 1 × 105 بروتوبلاستات/مل، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات.
    2. أضف 1 مل من المحلول المحضر في الخطوة 5.2.1 إلى ثلاثة آبار في صفيحة دقيقة سعة 24 بئرا.
    3. ألصق الغطاء واحتضنه عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 175 دورة في الدقيقة لمدة 10 أيام.
    4. اجمع 1 مل من الوسط واحفظها في أنبوب 1.5 مل عند 4 درجات مئوية ، قم بتخزين عينة الثقافة عند -20 درجة مئوية ، إذا لم يتم تحليلها على الفور.
    5. امزج 20 ميكرولتر من عينة الثقافة و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS في أنبوب سعة 1.5 مل واتركه يغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. بعد التبريد على الجليد ، قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة المسلوقة و 5 ميكرولتر من معيار البروتين الملون مسبقا على هلام مسبقة الصب وقم بتحليل الإنتاج الإفرازي للبروتين غير المتجانس المستهدف بواسطة SDS-PAGE10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نتائج إدخال ترميز كاسيت تعبير الحمض النووي ل Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase (CBH: GenBank Accession Number E39854) في uridine auxotroph من A. oryzae سلالة HO422 موصوفة أدناه.

تحضير تعليق البوغ الطازج

كان العائد النهائي لتعليق الأبواغ من صفيحة أجار واحدة 1 مل (1 × 107 جراثيم / مل).

ما قبل الثقافة

بعد الحضانة لمدة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد طورنا نظاما يسمح بفحص محولات A. oryzae بسرعة أكبر من الطريقة التقليدية ، عن طريق إجراء استزراع سائل للبروتوبلاستات. الجانب الأكثر أهمية في هذه الطريقة هو الضغط الاسموزي للوسط السائل. تم تحسين الضغط الاسموزي المناسب للاستزراع السائل باستخدام السوربيتول. كان نمو A. oryzae سلالة HO4 أكثر نشاطا في وجود 0.8 متر من السوربيتول (الشكل 3 أ). في الطريقة التقليدية باستخدام وسط أجار ناعم ، تم الإبلاغ عن أن الضغط الاسموزي 0.5-1.2 M مناسب ل N. cr...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون ب Rinkei Okano للمساعدة في التجارب. يشكر المؤلفون البروفيسور كاتسويا غومي من جامعة توهوكو والبروفيسور ماسايوكي ماشيدا من معهد كانازاوا للتكنولوجيا على المناقشات القيمة. تم تمويل هذا العمل من قبل معهد هوندا للأبحاث اليابان المحدودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 م NaOHNACALAI TESQUE، INC.37421-05
1 م تريس حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5)فوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن318-90225
1 م تريس حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8)فوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن كوربوريشن2106-100
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيAS ONE Corporation1-1600-03
15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيبيكتون وديكنسون وشركاه352196
2- مختبرات ميركابتو إيثانولبيو راد ، إنك.1610710
24 بئر صفيحةAGC TECHNO GLASS CO.، LTD.3820-024
50-مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيبيكتون, ديكنسون وشركاه352070
70-µ م مصفاة الخليةبيكتون وديكنسون وشركاه352350
أجارفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن010-15815
الأوتوكلافتومي سيكو المحدودة.LSX-700
بروموفينول أزرقفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن021-02911
CaCl2< / sub>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
حمض الكاسامينوفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن كوربوريشن393-02145
سيلولاز R-10كوزمو بيو المحدودة16419
دكسترين هيدراتفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T / R1020Lتستخدم للهلام الجاهز في
جهاز الرحلان الكهربائيATTO CORPORATIONWSE-1150المستخدمة في SDS-PAGE
FeSO4· 7H2< / sub>OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
فلتر زجاجي 17G3طوكيو Garasu Kikai المحدودة0000094147
الجلسرينفوجيفيلم واكو بيور كيماويات كوربوريشن070-04941
مقياس الدمفوناكوشي المحدودة521-10
أجهزة طرد مركزي مبردة عاليةKUBOTA CORPORATION7780تستخدم للطرد المركزي للعينات في أنابيب الطرد المركزي المخروطية سعة 50 مل
حاضنةTAITEC CORPORATION.G & middot ؛ BR-200تستخدم لزراعة القارورة السائلة وإعداد حاضنة البروتوبلاست
TAITEC CORPORATION.BR-43FLتستخدم لزراعة السوائل الدقيقة وزراعة الألواح
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2< / sub>PO4< / sub>NACALAI TESQUE، INC.28721-55
إنزيم التحللSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4< / sub>· 7H2< / sub>OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
أجهزة الطرد المركزي المبردةKUBOTA CORPORATION3740تستخدم للطرد المركزي للعينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل المجهر
Leica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3< / sub>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company، IncPM-996
PCR Purification KitQIAGEN KK28104
طبق بتريSumitomo Bakelite Co.، Ltd.MS-11900تستخدم كلوحة ثقافة
البولي إيثيلين جلايكولسيجما-ألدريتشP3640-500G
بولي بيبتون ببتونبيكتون وديكنسون وشركاه211910
سلالم البروتينمختبرات Bio-Rad ، Inc.161-0377تستخدم كعلامة للوزن الجزيئي في SDS-PAGE
Sodium Dodecyl sulfateBio-Rad Laboratories، Inc.1610301
مرشح معقمMerck KGaASLGP033RB
السكروزNACALAI TESQUE، INC.30404-45
توين 20طوكيو للصناعات الكيميائية المحدودةT0543
UridineSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.تي 017
الدقيق SDS-PAGE السرعة الدقيقة

المراجع

  1. Tsuboi, H., et al. Improvement of the Aspergillus oryzae enolase promoter (P-enoA) by the introduction of cis-element repeats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 69, 206-208 (2005).
  2. Nemoto, T., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Contribution ratios of amyA, amyB, amyC genes to high-level α-amylase expression in Aspergillus oryzae. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 76, 1477-1483 (2012).
  3. Shinkawa, S., Mitsuzawa, S. Feasibility study of on-site solid-state enzyme production by Aspergillus oryzae. Biotechnology for Biofuels. 13, 31(2020).
  4. Machida, M., et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature. 438 (7071), 1157-1161 (2005).
  5. Veenstra, A. E., van Solingen, P., Bovenberg, R. A. L., vander Voort, L. H. M. Strain improvement of Penicillium chrysogenum by recombinant DNA techniques. Journal of Biotechnology. 17 (1), 81-90 (1991).
  6. Takahashi, T., Masuda, T., Koyama, Y. Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genetics and Genomics. 275 (5), 460-470 (2006).
  7. Mizutani, O., et al. A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology. 45 (6), 878-889 (2008).
  8. Bergès, T., Barreau, C. Isolation of uridine auxotrophs from Trichoderma reesei and efficient transformation with the cloned ura3 and ura5 genes. Current Genetics. 19 (5), 359-365 (1991).
  9. Takeno, S., et al. Cloning and sequencing of the ura3 and ura5 genes, and isolation and characterization of uracil auxotrophs of the fungus Mortierella alpina 1S-4. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (2), 277-285 (2004).
  10. Ji, Y. W., et al. Application of membrane filtration method to isolate uninuclei conidium in Aspergillus oryzae transformation system based on the pyrG marker. Food Science and Biotechnology. 22 (1), 93-97 (2013).
  11. Mitsuzawa, S., Fukuura, M., Shinkawa, S., Kimura, K., Furuta, T. Alanine substitution in cellobiohydrolase provides new insights into substrate threading. Scientific Reports. 7 (1), 16320(2017).
  12. Fleissner, A., Dersch, P. Expression and export: recombinant protein production systems for Aspergillus. Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 1255-1270 (2010).
  13. Yoon, J., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 89, 747-759 (2011).
  14. Lin, H., et al. Engineering Aspergillus oryzae A-4 through the chromosomal insertion of foreign cellulase expression cassette to improve conversion of cellulosic biomass into lipids. PLoS One. 9, 108442(2014).
  15. Chakraborty, B. N., Patterson, N. A., Kapoor, M. An electroporation-based system for high-efficiency transformation of germinated conidia of filamentous fungi. Canadian Journal of Microbiology. 37 (11), 858-863 (1991).
  16. Sun, Y., et al. A dual selection marker transformation system using Agrobacterium tumefaciens for the industrial Aspergillus oryzae 3.042. Journal of Microbiology and Biotechnology. 29 (2), 230-234 (2019).
  17. Gomi, K., Iimura, Y., Hara, S. Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB Gene. Agricultural and Biological Chemistry. 51 (9), 2549-2555 (1987).
  18. Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R., Giles, N. H. Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (10), 5259-5263 (1979).
  19. Lim, F. Y., Sanchez, J. F., Wang, C. C., Keller, N. P. Toward awakening cryptic secondary metabolite gene clusters in filamentous fungi. Methods in Enzymology. 517, 303-324 (2012).
  20. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (1), 168(2017).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (7), 2172-2175 (1989).
  22. Shinkawa, S., et al. Base sequence for protein expression and method for producing protein using same. U.S. Patent. , 15/745,030 Application No. 15/745,030. Minato-Ku, Tokyo, Japan (2018).
  23. Tamano, K., et al. The β-1, 3-exoglucanase gene exgA (exg1) of Aspergillus oryzae is required to catabolize extracellular glucan, and is induced in growth on a solid surface. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 71 (4), 926-934 (2007).
  24. Endo, Y., et al. Novel promoter sequence required for inductive expression of the Aspergillus nidulans endoglucanase gene eglA. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (2), 312-320 (2008).
  25. Kubodera, T., Yamashita, N., Nishimura, A. Pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae: cloning, characterization and application as a dominant selectable marker for transformation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (7), 1416-1421 (2000).
  26. Yamada, O., Lee, B. R., Gomi, K. Transformation system for Aspergillus oryzae with double auxotrophic mutations, niaD and sC. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 61 (8), 1367-1369 (1997).
  27. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS One. 10 (7), 0133085(2015).
  28. Shi, T. Q., et al. CRISPR/Cas9-based genome editing of the filamentous fungi: the state of the art. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (20), 7435-7443 (2017).
  29. Katayama, T., et al. Forced recycling of an AMA1-based genome-editing plasmid allows for efficient multiple gene deletion/integration in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Applied Environmental Microbiology. 85 (3), 01896-01918 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة