يصف هذا المنشور بروتوكولًا لعزل النوى عن الخلايا الشحمية الناضجة ، والتنقية عن طريق الفرز المُفعّل بالفلور ، و نسخ مستوى الخلية الواحدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل النوى الأنسجة الدهنية لتطبيقات الجينوم وحيد الخلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الدهون البنية والبيج هي الأنسجة الدهنية المتخصصة التي تبدد الطاقة لحرارة الثيرموغين من قبل UCP1 (فك البروتين-1)-تعتمد على مسارات مستقلة. حتى وقت قريب، كانت تعتبر الخلايا الدهنية الحرارية سكانية متجانسة. ومع ذلك، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن هناك أنواع فرعية أو شعَبَة فرعية متعددة تتميز في الأصل التنموي، واستخدام الركيزة، والنصوص. على الرغم من التقدم في الجينوم وحيد الخلية، كان التحلل غير المتحيز للأنسجة الدهنية في الأنواع الفرعية الخلوية تحديا بسبب الطبيعة الهشة للدهون المليئة بالدهون. وقد تم تطوير البروتوكول المقدم للتحايل على هذه العقبات من خلال العزل الفعال للنيات وحيدة من الأنسجة الدهنية لتطبيقات المصب، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن بعد ذلك تحليل التغاير الخلوي عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات المعلوماتية الحيوية.
المقدمة
وقد أظهرت الدراسات أن الأنسجة الدهنية البني (BAT) لديه قدرة ملحوظة لتبديد الطاقة. نوعان من الخلايا الدهنية الحرارية ذات سمات تنموية مميزة موجودة في كل من القوارض والبشر: adipocytes البيج والكلاسيكية البنية الكلاسيكية. بينما توجد الخلايا الدهنية البنية الكلاسيكية في الغالب في مستودعات BAT بين الأغطية، تظهر الخلايا الشحمية البيج بشكل متقطع في الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) استجابة لبعض الإشارات الفسيولوجية، مثل التعرض للبرد المزمن، وهي عملية يشار إليها باسم "براونينغ" أو "beiging". من خلال استخدام التصوير المتقدم ، أصبح من الواضح الآن أن البشر البالغين لديهم مستودعات كبيرة من UCP1+ BAT ، خاصة في المنطقة فوق الاعلى من الاعلى من الاعلى ،,
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء رعاية الحيوانات والتجريب وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها في كلية ألبرت أينشتاين للطب.
1. إعداد هضم الأنسجة والمخازن التحلل
- إعداد العازلة الهضم الأنسجة.
- إعداد ~ 1 مل من العازلة الهضم لكل غرام من الأنسجة الدهنية.
- تزن بها 1.5 U/mL الكولاجين D و 2.4 U/mL dispase الثاني وإضافة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- إعداد احتياطي إعداد النوى (NPB).
- إعداد 10 mM HEPES، 1.5 mM كلوريد المغنيسيوم، 10 mM كلوريد البوتاسيوم، 250 mM السكروز، و 0.1٪ NP-40 في المياه الخالية من النوى. مزيج جيد. قد السكروز يستغرق وقتا أطول للذوبان من المكونات الأخرى. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحتوي النوى الدهنية غير المتنوعة على الحطام والمزدوجة التي تخلق ضوضاء وخلفية عالية في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المصب. وتظهر استراتيجية بوابة FACS التمثيلية في الشكل 1. تم اختيار النوى أولاً بناءً على التشتت الأمامي (FSC) وتشتت الجانب (SSC) (A)، ثم تم اختيار singlets فقط استنادًا إلى الجمع بين العرض والارتفاعات من SSC (B). وأخيراً، تم تحديد الأحداث الإيجابية DAPI فقط وفرزها في مخزن المجموعة المؤقت(C).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم تقديم طريقة واضحة وقوية لعزل النوى واحدة ودراسة عدم تجانس الأنسجة الدهنية. بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأنسجة بأكملها، يوفر هذا العمل وجهة نظر غير متحيزة من عدم تجانس الخلوية وعلامات السكان محددة. هذا أمر مهم ومبتكر من أجل النهوض بالأحياء الشحمية، والتمثيل الغذائي الجزيئي، وبحوث السمنة.
هذا البروتوكول هو الأمثل خاصة لتطبيق المصب من snRNA-seq. إن خطوة "التنظيف" لتحقيق عزل النوى الصحية مع فارز MoFlo XDP عالي السرعة تزيل تماماً الحطام والمجاميع من التعليق الخام مع الحفاظ على سلامة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر ديفيد رينولدز من جوهر ألبرت آينشتاين للجينوم وJinghang تشانغ من تدفق Cytometry الأساسية للدعم التقني. نحن نعترف بالدعم من المعاهد القومية للصحة (DK110426) ومنح تجريبية وجدوى من مركز آينشتاين ماونت سيناي لأبحاث السكري (DK020541)، ومركز نيويورك لبحوث السمنة (DK026687) (جميع إلى K.S.). ونود أيضا أن نشكر مركز ألبرت آينشتاين للسرطان (CA013330) على الدعم الأساسي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول شطف autoMACS | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS مع EDTA ؛ فلتر |
| معقم BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| خلية 100 & mu ؛ م | فلتر | خلية 431752 | |
| 40 مو ؛ م | كورنينج | 431750 | |
| CellTrics (30 & mu; م) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| كولاجيناز دي | روش | 11088866001 | |
| الكونتيسة الثانية FL عداد الخلايا الآلي | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 & micro; م) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | مرشحات قابلة للتكديس |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP فارز الخلايا | بيكمان كولتر | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| حامي RNase مثبط | Roche | 3335402001 | |
| السكروز | فيشر | S5-3 |
المراجع
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
