مقالة منهجية

مجتمعة في فيفو التشريحية والوظيفية تتبع من محطات الغلوتامات منطقة البطن في قرن آمون

3.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61282

⸱

سبتمبر 9, 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يوضح البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتتبع إسقاطات الغلوتامات للمنطقة البطنية (VTA) إلى قرن آمون. تم الجمع بين التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA مع تسجيل CA1 لإظهار كيفية محطات الغلوتامات VTA تعدل CA1 معدل إطلاق الهرمي المفترض في الجسم الحي.

الملخص

وقد سمح التشكيل البصري للخلايا العصبية الفرعية في الدماغ للباحثين بتشريح الدوائر العصبية في الجسم الحي وفيفو السابق. وهذا يوفر فرضية لتحديد دور أنواع الخلايا العصبية داخل الدائرة العصبية، وأهميتها في ترميز المعلومات بالنسبة للتعلم. وبالمثل، يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار الأهمية الفسيولوجية لاثنين أو أكثر من مناطق الدماغ المتصلة في الحيوانات المستيقظة والمخدرة. توضح الدراسة الحالية كيف تعدل الخلايا العصبية الغلوتامات VTA معدل إطلاق الخلايا العصبية الهرمية المفترضة في CA1 (قرن آمون) من الفئران المخدرة. يستخدم هذا البروتوكول الوسم المرتبط بالفيروسات (AAV) المعتمد على VTA الخلايا العصبية الغلوتامات لتتبع محطات الغلوتامات المبتسرة في طبقات قرن آمون. التعبير عن الأوبسين التي تسيطر عليها الضوء (channelrhodopsin; hChR2) وبروتين الفلورية (eYFP) التي تؤويها ناقلات AAV يسمح تتبع أنتيروزغراد من محطات الغلوتامات VTA, والتشويه الضوئي من VTA الجلوتامات الخلايا العصبية الهيئات (في VTA). تم وضع أقطاب السيليكون الحادة عالية المقاومة في CA1 للكشف عن استجابات متعددة الوحدات ووحدة واحدة للتحوير الضوئي VTA في الجسم الحي. تظهر نتائج هذه الدراسة التوزيع المعتمد على الطبقة لمحطات الغلوتامات VTA المشبكية في قرن آمون (CA1 و CA3 و DG). أيضا، فإن التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA زيادة معدل إطلاق النار وانفجار وحدات هرمية CA1 المفترضة في الجسم الحي.

المقدمة

في العقد الماضي، تم تطوير مجموعة من الأدوات الوراثية لزيادة خصوصية التشكيل من نوع الخلايا العصبية، ورسم خرائط الشبكات العصبية المعقدة1. وتجدر الإشارة إلى أن الفيروسات العصبية ذات القدرة المتأصلة على العدوى والتكاثر في الخلايا العصبية قد تم نشرها للتعبير عن أو إلغاء بروتينات محددة في الأنواع الفرعية من الخلايا العصبية. عند إيواء البروتينات الفلورية أو مؤشرات النشاط المتشابك المشفرة وراثيا ، تسمية ناقلات AAV المصابة وتحديد الشبكات العصبية عبر مناطق الدماغ2،3. اختيار المروج في بناء AAV يوجه التعبير عن المتجه في أنواع الخلايا العصبية مع مستوى معين من خصوصية (التعبيرالمعتمد على المروج). ومع ذلك، من خلال إعادة تركيب Cre-lox، يتم نشر بناء AAV مع خصوصية أكبر لوضع العلامات العصبية4،5 ،6،7. من الجدير بالذكر، يمكن التعبير عن opsins الميكروبية النشطة ضوئيا والبروتينات الفلورية المعبأة في ناقلات AAV في الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا العصبية8،وهي مثالية للتصوير، وتتبع الدوائر من نوع الخلايا العصبية، والتحوير الضوئي9،10.

AAVs يبني حقن مجسمة في منطقة الدماغ (أو نواة) يدفع التعبير عن البروتين مراسل في سوما، dendrite، ومحطات المحاور. التعبير العصبي للAV إيواء الجينات مراسل (eYFP) يسهل وضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية وتتبع التشريحية من التوقعات من وإلى مناطق الدماغ الأخرى11,12,13,14. AAV-eYFP يبني تحمل opsin الضوء التي تسيطر عليها (على سبيل المثال، hChR2)، يمكن نشرها كأداة للتصوير6،15 والتحفيز القائم على تتبع الفسيولوجية من التوقعات العصبية لاستهداف مناطق الدماغ في الجسم الحي16. اعتمادا على النمط المصلي AAV، قد يكون اتجاه وضع العلامات العصبية قبل التحلل أوالرجعية 11،12. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن AAV5 يسافر anterogradely في الخلايا العصبية12. وهكذا، فإن التحفيز الضوئي لأجسام الخلايا التي تعبر عن hChR2 ينتج تأثيرات متبصرة في مكان آخر في الدماغ (الهدف)17.

هنا، تم استخدام AAV (النمط المصلي 5) مع المروج CaMKIIα للتعبير عن eYFP (مراسل) وhChR2 (opsin) في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA والتوقعات المحورية. تظهر نتائج هذه الدراسة التوزيع المعتمد على الطبقة لمحطات VTA-glutamate presynaptic في مناطق CA1 و CA3 و DG فرس النهر. أيضا، زيادة التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA CA1 متعددة وحدة ووحدة واحدة معدلات إطلاق النار في الجسم الحي بالمقارنة مع القيم الأساسية. يستخدم هذا البروتوكول أدوات ميسورة التكلفة وبرامج متاحة تجاريا يمكن أن تزيد من جودة البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب تتبع الدوائر العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية والتعامل مع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة لكلية الطب البيطري بجامعة ولاية لويزيانا.

1. الحيوان التجريبي

  1. استخدام الفئران 5-6 أسابيع من العمر.
  2. منزل 3-5 الحيوانات في قفص في ظل ظروف قياسية من 12 ساعة بالتناوب الضوء ودورة الظلام. وينبغي توفير الغذاء والماء ل libitum الإعلانية.

2. استئصال القحف وإعداد الحيوان

ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراءات قبل و peri-operative لعملية استئصال القرنية الماوس. استخدام جهاز مجسم القياسية والإحداثيات المناسبة (أنتيروبوستيريور: AP, Mediolateral: ML, ودورسوفنترال: DV). الرجوع إلى أطلس دماغ الماوس لتحديد الإحداثيات لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام.

  1. تخدير الفئران عن طريق الكيتامين داخل الصفاق (100 ملغم /كجم) / xylazine (10 ملغ / كجم) حقن كوكتيل. إجراء اختبار قرصة إصبع القدم لضمان عدم وجود إحساس قبل بدء الجراحة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام التخدير Isoflurane مع غرفة الأنف المناسبة لهذه الخطوة.
  2. إصلاح بلطف رأس الحيوان على جهاز ستيريوتاكسيك.
    ملاحظة: من المهم التعامل مع الحيوانات بحذر أثناء هذه العملية. أيضا، تحقق من معدل التنفس والحيوية الأخرى قبل الشروع في الجراحة. السماح للحيوان للراحة لمدة ~ 7 دقائق للحد من التوتر.
    1. ضع وسادة تدفئة على الإطار المجسم بحيث يرقد جسم الحيوان عليه. وهذا سوف يساعد على الحفاظ على درجة حرارة الجسم والحفاظ على الحيوان دافئة على الرغم من خارج الإجراء. احتفظ بوسادة التدفئة للرعاية بعد الجراحة والتعافي.
  3. استخدم مقصا لإزالة الشعر فوق فروة الرأس وتنظيف البشرة بمحلول اليود.
    1. تطبيق الليدوكائين الموضعي لمنع الإحساس على فروة الرأس.
    2. استخدم مشرطا لإجراء شق فروة رأس متوسط يمتد من الجبهة إلى المنطقة القذالية.
    3. تنظيف منطقة شق مع محلول اليود، ثم فضح الجلفاريا.
      ملاحظة: يمكن تطبيق كمية صغيرة من محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لإزالة البيريوستيوم من الجلفاريا. وهذا سيزيد من رؤية المعالم (البريغما وال لامدا) والغرز.
    4. باستخدام أطلس مجسمة الدماغ الماوس، وتحديد AP وML إحداثيات نسبة إلى bregma.
    5. لحقن VTA، ضع حقنة إبرة حادة الدقة (على سبيل المثال، حقنة الأعصاب) في الإحداثيات AP: -3.08 مم/مل: 0.5 مم نسبة إلى البريغما.
    6. استخدم أداة حفر لحفر ثقب 1 مم (استئصال القحف) في الجمجمة عند تنسيق AP/ML المميز.
      ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مستوى كبير من الحذر. وينبغي تطبيق الحد الأدنى من الضغط أثناء الحفر لمنع بت الحفر من سحق أنسجة الدماغ. في الدراسة الحالية، كان بت الحفر 0.8 ملم وتم تعيين سرعة الحفر إلى 15،000 دورة في الدقيقة.
      تنبيه: إذا تم استخدام بيروكسيد الهيدروجين في تنظيف الشق أو الجلجلة، فتأكد من الإزالة الكاملة للمحلول أو اسمح بالجفاف الكامل قبل الحفر.

3. AAV كوكتيل حقن

ملاحظة: يصف هذا القسم عملية حقن AAV في VTA للفئران C57BL/6 البالغة (23-27 جرام). يمكن استخدام الطريقة الموصوفة لحقن AAV في أي منطقة من مناطق الدماغ باستخدام جهاز مجسم قياسي وإحداثيات مناسبة. لإثبات هذا البروتوكول، تم التعبير عن eYFP و hChR2 في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA باستخدام العدوى AAV5 بوساطة تحت المروج CaMKIIα (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام إعادة تركيب Cre-lox لهذه الخطوة.

  1. تركيب حقنة مع إبرة حادة فائقة الدقة (32 G; 5 قدرة μL مع دقة 100 nL) على حاقن. إصلاح حامل الحقنة على ميكرومانيبولاتور.
    ملاحظة: لهذا الإجراء، تم استخدام حامل حقنة يدوية، مع معايرة 1.6 nL. ويمكن أيضا استخدام حاقن الآلي.
  2. ملء الحقنة بالماء المقطر مزدوجة لتنظيف واختبار تدفق السوائل.
  3. تذوب aliquots من AAV (النمط المصلي 5) كوكتيل على الجليد. يتم تخزين أفضل AAVs في -80 درجة مئوية للحفاظ على التيتر الفيروسي للتعبير الجيد.
  4. املأ المحاقن المركبة ب 1000 nL من محلول AAV (10 mM في محلول ملحي عازل بالفوسفات (PBS)، درجة الحموضة 7.4). الاستغناء عن 10 nL من محلول AAV لتأكيد تدفق السائل قبل خفض الإبرة في موقع الحقن.
  5. استخدام micromanipulator لخفض الإبرة مجسمة في العمق المطلوب (DV تنسيق). بعد خفض الإبرة إلى العمق المطلوب، اسمح للمحقنة بالبقاء في مكانها لمدة 10 دقائق قبل الحقن.
    ملاحظة: لهذا الإجراء، تم تخفيض الإبرة في VTA على عمق (DV) من 4.5 مم من سطح الظنس في الدماغ. بالنسبة لمناطق الدماغ الأخرى، استخدم التنسيق الظهري المناسب (راجع أطلس دماغ الماوس).
  6. حقن 600-800 nL من AAV في VTA. يمكن تعديل حجم الحقن اعتمادا على حجم الموقع المستهدف.
    1. تقديم حل AAV بمعدل 60 nL/min (فاصل زمني 3 دقائق).
    2. للتعبير عن eYFP و hChR2 في الخلايا العصبية الغلوتامات VTA والتوقعات، حقن AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طريقة إعادة التركيب Cre-lox اعتمادا على هدف التجربة.
    3. السماح للإبرة أن تبقى في مكانها لمدة 15 دقيقة بعد حقن AAV. وهذا من شأنه أن يقلل من الانتشار والتدفق الخلفي.
  7. سحب إبرة الحقنة، ومن ثم خياطة شق لإغلاق الجرح.
  8. إعطاء المضادات الحيوية والتسكين كجزء من الرعاية بعد الجراحة. ضع الماوس على منصات مبطنة دافئة وراقب الحيوان حتى يستيقظ.
    ملاحظة: بعد 3 أسابيع من الحقن، يمكن ملاحظة تعبير AAV عن طريق الكشف الفلوري عن بروتين المراسل (eYFP) في أقسام دماغ الماوس. أيضا، يمكن إجراء تجارب التحفيز الضوئي بعد 3 أسابيع(الشكل 2).

4. إعداد التسجيلات العصبية في الجسم الحي مع optogenetics

ملاحظة: يصف هذا القسم خطوات التسجيل العصبي الحاد مع التتبع البصري لدائرة الدماغ (إسقاط الخلايا العصبية الغلوتامات VTA إلى CA1). إذا لزم الأمر، تحقق من النظام (مكبر للصوت والاتصالات) للضوضاء الكهربائية وقضايا التأريض قبل البدء في هذه الخطوة. يمكن أن يساعد تنفيذ هذه الخطوة في قفص فاراداي في القضاء على الضوضاء الكهربائية في التسجيل.

  1. في 3 أسابيع بعد حقن AAV، تخدير الفئران عن طريق حقن يوريثان داخل الصفاق (0.2 ملغم /كجم).
    تنبيه: يوريثان مسرطن ويجب التعامل معه بحذر أثناء ارتداء معدات الحماية. أيضا, إعطاء التخدير يوريثان في هذا التركيز هو عدم البقاء على قيد الحياة.
  2. لصق رأس الحيوان على إطار مجسم كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.2، الشكل 3A). إجراء عملية استئصال القحف لفضح دورا (الشكل 3A). استخدم أداة الحفر (حجم البت: 0.8 مم، السرعة: 15000 دورة في الدقيقة) لإزالة جزء من العظم الجداري.
    1. يجب أن يكون طول القحف حوالي 3 مم × 4 مم. ضعي قطرات السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) فوق هذه المنطقة لمنع الجفاف.
  3. تحت المجهر تشريح (الرقمية) ، واستخدام طرف إبرة عازمة (27 غرام) لاستئصال دورا المكشوفة. يجب الحرص على عدم سحب بعيدا غطاء الظنس الحساس والأنسجة القشرية في هذا المجال.
  4. تحمل ثقبا في عظم القذالي (حجم بت: 0.8 ملم، والسرعة: 10،000 دورة في الدقيقة) لعقد المسمار الأرض (عموم رئيس فيليبس المسمار؛ M0.6 × 2.0 مم).
  5. قم بتوصيل سلك أرضي من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أنواع أخرى من الأسلاك(الشكل 3ب).
  6. للتحفيم الضوئي المشترك (VTA) والتسجيل العصبي (CA1)، استخدم جهازا ستيريوتاكويك متعدد السكك الحديدية مزودا بأجهزة دقيقة فائقة الدقة (10 ميكرومتر أو 1 ميكرومتر). تركيب الألياف البصرية وتسجيل المسبار العصبي على نطاق 10 ميكرومتر و 1 ميكرومانيبواتور 1 ميكرومتر، على التوالي.
    1. إذا لزم الأمر، استخدم محول مسبار مرحلة الرأس(الشكل 3c).
      ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم تركيب مرحلة رأس 32 قناة مع محول لعقد قطب تسجيل 4 قنوات(الشكل 3D). تم لحام السلك الأرضي الفولاذ المقاوم للصدأ إلى منفذ الاتصال الأرضي للمحول.
  7. في تنسق AP: -3.08 ملم مل: 0.5 ملم، وانخفاض الألياف البصرية قطرها 400 ميكرومتر في VTA.
    1. قبل خفض الألياف البصرية، قم بتوصيل النمس بكابل ألياف بصرية (مع الفولاذ المقاوم للصدأ أو الحديد الخزفي) المرتبط بمصدر LED مقترن بالألياف.
      ملاحظة: تأكد من تعيين كثافة الضوء والتركيز على النحو المطلوب. اختيار مصدر ضوء LED يجب أن تتوافق مع opsins يجري استهدافها. هنا، تم استخدام 470 نانومتر (الضوء الأزرق) سائق الصمام لhChR2 الضوئي(الشكل 4a).
    2. لمزامنة نبض الضوء مع التسجيل العصبي، قم بتوصيل برنامج تشغيل LED ومنفذ وحدة التحكم الرقمية IN بمنفذ ترانزستور ترانزستور (TTL) نبض(الشكل 4ب). ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مقسم BNC.
      ملاحظة: يوفر استخدام نبضات TTL مرونة ضبط تردد ومدة قطار النبض المطلوبين رقميا. في البروتوكول الحالي، تم تشغيل نبضات الضوء 10 مللي ثانية في 50 هرتز18. للتحكم TTL من برنامج تشغيل LED، قم بتبديل برنامج التشغيل إلى "المشغل". في هذا الوضع، يمكن تنظيم كثافة الضوء عن طريق تحويل "مقبض الباب". ويمكن تعديل تردد التحفيز لاستيعاب المتغيرات التجريبية ويمكن أن يتراوح من 1 إلى 100 هرتز. لتتبع الدائرة العصبية، ينصح بتردد تحفيزي >20 هرتز.
    3. ضبط مقبض لتحديد كثافة فعالة يمكن أن تولد استجابة دون إنتاج التحف الكهروضوئية. إذا لزم الأمر، وإعادة وضع الألياف البصرية للقضاء على القطع الأثرية19.
      ملاحظة: ينتج برنامج تشغيل LED المستخدم للبروتوكول الحالي طاقة خفيفة بقوة ~21.8 ميجاوات.

5. تسجيل العصبية

  1. استخدم مسبارا عصبيا حادا مع ساق سمكه 15-50 ميكرومترا، يبلغ طوله 5 ملم على الأقل.
    ملاحظة: التسجيل من هياكل الدماغ العميقة سيتطلب تحقيقات عصبية مع ساق أطول. في الدراسة الحالية، تم استخدام مسبار بطول ساق 20 ملم.
  2. قم بتوصيل مرحلة رأس ما قبل مكبر الصوت بوحدة التحكم في التسجيل عبر كابل واجهة طرفية تسلسلية (SPI). تحقق من إضاءة ألوان المصابيح على منافذ وحدة تحكم التسجيل. تشير المصابيح الخضراء والصفراء إلى الجهد المناسب على لوحة مكبر الصوت المتصلة. يشير أحمر LED إلى عنصر تحكم مرحلة رأس البرنامج العامل(الشكل 5ب).
  3. باستخدام المتلاعب الدقيق، ضع مواقع الاتصال بالقطب الكهربائي في طبقة الخلية الهرمية للCA1 (AP: -1.94 مم، ML: +1.0 مم، DV: +1.1 إلى 1.2 مم).
    ملاحظة: يمكن وضع الألياف البصرية والقطب الكهربائي في مناطق الدماغ الأخرى المرغوبة للتحفيم الضوئي والتسجيل.

6. إعدادات مكبر الصوت والمرشح

  1. قم بتوصيل نظام مكبر صوت وحدة تحكم التسجيل بجهاز كمبيوتر من خلال منفذ USB 3.0. قم بتوصيل مرحلة الرأس بالمكبر باستخدام كابل SPI. تشغيل برنامج وحدة التحكم. إذا لم يتم توصيله بشكل صحيح، سيعرض النظام رسالة "لم يتم العثور على الجهاز".
  2. انقر فوق تشغيل لعرض النشاط على القنوات. يتم رسم كل شكل موجي كجهد (محور ص) مقابل الوقت (المحور س). اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام، قم بضبط مقياس الجهد والوقت لضبط العرض الموجي.
  3. إذا كانت قنوات قليلة فقط نشطة، قم بتعطيل القنوات غير المستخدمة لتقليل حجم الملف على قرص التخزين.
  4. تعيين معدل أخذ العينات وترددات القطع عن طريق تحرير معلمات عرض النطاق الترددي على برنامج الاستحواذ. لتسجيل وحدة واحدة، تعيين الترددات قطع العلوي والسفلي إلى 300 هرتز و 5000 هرتز على التوالي. تغيير معدل أخذ العينات مكبر للصوت إلى 30 kS/s.
    ملاحظة: سيؤدي اختيار معدل أخذ عينات عالي إلى إنتاج حجم ملف أكبر.
  5. قبل التسجيل، تحقق من سلامة قنوات القطب الكهربائي عن طريق قياس المعاوقة عند 1000 هرتز. ويمكن القيام بذلك عن طريق إطلاق وظيفة في واجهة المستخدم (برنامج وحدة تحكم). يجب أن يكون لقناة العمل قيمة مقاومة تتراوح من 0.1 إلى 5 MΩ.
  6. إذا كان إخراج الصوت (مكبر الصوت) متصلا بمنفذ تناظري OUT، فاضبط المكسب والكاتم للحصول على صوت الارتفاع الأمثل.
  7. لعرض علامة قطار نبض TTL في تسجيل الارتفاع، قم بتمكين الشاشة لعلامة DIGITAL IN. لتسجيل الطابع الزمني قطار النبض تمكين عرض قناة DIGITAL IN قبل التجربة الرئيسية.
    ملاحظة: عادة ما يكون هناك أكثر من قناة "DIGITAL IN" (1 أو 2). تأكد من توصيل كبل BNC من جهاز نبض TTL بمنفذ "DIGITAL IN" المحدد للعرض في برنامج وحدة تحكم التسجيل.
  8. لعرض الموجي ارتفاع في الوقت الحقيقي، افتح إطار نطاق spike وتعيين عتبة باستخدام النقر بالماوس.
  9. فحص مستوى الضوضاء من خلال رصد الجذر متوسط مربع (RMS في μV). لتسجيل ارتفاع نظيفة، فمن المفضل أن عتبة ارتفاع العصبية هو على الأقل 5x RMS.
  10. بمجرد اكتمال الإعداد، حدد تنسيق إخراج الملف.
    ملاحظة: هنا، تم تسجيل ارتفاع CA1 العصبية في شكل .rhd. يمكن أيضا تحديد تنسيقات الملفات الأخرى (.rhs و .dat) لمطابقة تنسيقات الملفات المسموح بها بواسطة برنامج التحليل.

7. في تسجيل فيفو البصرية والإعدادات

  1. افتح برنامج التحكم في النبض (TTL) الذي يعرض معلمات نبض قابلة للتعديل. حدد منفذ COM المناسب على البرنامج. تعيين معلمات النبض عن طريق ضبط إعدادات القطار والمجموعة.
    ملاحظة: يجب تحديد حالة النبض من خلال النظر في المتغيرات التجريبية والتصميم.
  2. على برنامج وحدة تحكم مكبر للصوت، انقر فوق تشغيل للكشف عن المسامير العصبية في قرن آمون أو منطقة الدماغ المطلوبة. إذا لزم الأمر، ضبط عمق القطب للكشف عن الخلايا العصبية قابلة للحياة ونشطة.
  3. بمجرد اكتشاف نشاط الجهد خارج الخلية ، لاحظ طفرات خط الأساس لمدة 15 دقيقة وراقب حيوية الحيوان. أيضا، اختبار نبض الضوء للكشف عن الخلايا العصبية استجابة داخل CA1 أو المنطقة المستهدفة التشريحية المطلوبة.
    ملاحظة: تحقق من وجود قطع أثرية كهربائية ضوئية والقضاء عليها عن طريق ضبط كثافة الضوء أو موضع الألياف البصرية.
  4. سجل النشاط الأساسي ل ~ 10 دقيقة قبل تشغيل نبض الضوء في التردد المطلوب(الشكل 5a، b). وهذا سيسمح للمقارنة بين معدلات إطلاق النار أو انفجار مع وبدون إضاءة.
    ملاحظة: في الدراسة الحالية، تم تسجيل النشاط الأساسي لمدة 10 دقائق دون إضاءة، تليها الإضاءة في 50 هرتز(فيلم 1).

8. تحليل

  1. تحويل الملف.rhd إلى تنسيق الإخراج Nex5.
  2. اسم ملف العملية. Nex5 ملف في برنامج الفرز حاليا للكشف عن وحدة واحدة القطارات النقطية وأشكال الموجات(الشكل 5أ ب).
    1. حدد القناة المطلوبة من النافذة المنسدلة.
      ملاحظة: يمكن عرض بيانات spike المسجلة باستمرار على إطار منفصل من OFSS. ويمكن أيضا تعديل المقياس الزمني. إذا تم استخدام tetrode، يمكن تعيين OFSS لفرز القنوات 4 ك tetrode.
    2. تعيين مستوى الجهد لاستخراج عتبة عبور الموجي.
      تنبيه: استخدم الحد الأدنى من 5x RMS للكشف عن المسامير المناسبة.
    3. الكشف عن الأشكال الموجية، ثم إجراء فرز ارتفاع باستخدام وادي تسعى (التلقائي) أو K-يعني (شبه التلقائي) الأسلوب. عند الضرورة، دمج الوحدات التي تشغل مناطق مشابهة من مساحة تحليل المكونات الأساسية ثلاثية الأبعاد (PCA).
    4. تصدير مفروز . Nex5 ملفات لمزيد من التحليل (الشكل 5ج د).
      ملاحظة: يمكن تصدير نتائج التحليل للفاصل الزمني بين البينية ومعدل الإطلاق ومعدل الاندفاع إلى منصات تحليل أخرى.

9. الكشف عن الفلورية للتعبير AAV

  1. بعد التسجيل، قتل الحيوان في غرفة isoflurane.
  2. أداء التغلغل عبر القلب مع 10 MM PBS (~ 10 مل)، تليها 4٪ الفوسفات العازلة paraformaldehyde (PB-PFA، ~ 10 مل).
  3. إزالة الدماغ كله سليمة وإصلاحه في 4٪ PB-PFA لمدة 48 ساعة.
  4. نقل الدماغ الثابت إلى 4٪ PB-PFA تحتوي على 30٪ سكروز لحفظ التبريد عند 4 درجة مئوية. بعد 72 ساعة، قسم الدماغ في cryostat وجبل شرائح على شريحة مغلفة الجيلاتين.
    ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم اختيار المقاطع التي تحتوي على الجزء المغلق من الحصين (rostral) لإظهار المحطات الطرفية المسماة AAV في DG وCA3 وCA1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تتبع أنتيروغراد

تم التحقق من التعبير AAV عن طريق التصوير immunofluorescence من البروتين مراسل (eYFP) في VTA من C57BL/6 الفئران 21 يوما بعد الحقن (الشكل 2). كما تم التحقق من وضع علامات سابقة للتحلل الناجح لتوقعات الغلوتامات VTA presynaptic في قرن آمون من خلال الكشف عن eYFP في طبقات من DG، CA3، وCA1 (الشكل 6a-d; فيلم 2 و 3).

توقعات الغلوتامات VTA إلى الحصين تعدل نشاط ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في العقد الماضي ، تقدم تصميم بنى AAV بشكل كبير. على هذا النحو، تم دمج المزيد من المروجين الخلايا العصبية محددة في مجموعة من الأنماط المصلية AAV لتحسين خصوصية العدوى14. من خلال الجمع بين الجينات للبروتينات الفلورية، والنقل، والمستقبلات، والقنوات الأيونية، توجد الآن مكتبات AAV للتصوير، والتشكيل العصبي، والكشف عن النشاط متشابك. في البنى AAV المتاحة تجاريا ، يسمح مزيج من الفلوروفور المشفر وراثيا والقنوات الأيونية (opsin) بتتبع الأعصاب والفيزيولوجيا الكهربية المشتركة للدوائر العصبية14...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

يتم تمويل هذا العمل من قبل CBS بريدجينج غرانت الممنوحة ل OOM. قام OOM و PAA و AS بتصميم الدراسة وإجراء التجارب. AS وPAA تحليل النتائج. أعد أوم وPAA المخطوطة. نشكر الدكتور كارل ديسروث (جامعة ستانفورد) على إتاحة AAV لاستخدامنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3٪ بيروكسيد الهيدروجينفيشر الكيميائيةH312
AAV-CaMKII &alpha ؛ -ChR2-eGYPAddgenePlasmid # 26969
BNC كابلAmazon
BNC Splitter
Ceramic Split Colling Sleeve ل Ø ؛ حلقات 1.25 مم.ThorlabsADAL1-5
DrillDremelLR 39098
شرائح مغلفة بالجيلاتينفيشر العلميةOBSLD01CS
حقنة هاميلتون (Neuros)WPI Inc.06H
محول مرحلة الرأسNeuronexusAdpt-Q4-OM32
مسبار السيليكون عالي المقاومةNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch وحدة التحكم في التسجيلINTANRHD2000
محلول اليودDynarex1425
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
KetamineSpectrumK1068
LED DriverThorlabsLEDD1B
مصدر ضوء LED (470 نانومتر) - ضوء أزرقThorlabsM470F3
MicromanipulatorNarishigeM0-203
الألياف البصريةThorlabsCFMLC14L05
برغي فيليبس برأس عموم (M0.6 × 2 مم)AmazonM0.6 X 2 مم
مسرح رأس مكبر للصوت المسبق (32 قناة)INTANC3314
إطار تجسيميKopf1530
TTL نابضPrizmatix4031
UrethaneSigmaU2500
XylazineAlfa AesarJ61430
SoftwareCompany< / strong> <قوي>الإصدار
Graphpad PrismGraphPadالإصدار 8
وحدة التحكم في التسجيلIntantechالإصدار 2.07
NeuroexplorerNex Technologiesالإصدار 5.215
Plexon Offline Spike SorterPlexon Incالإصدار 4.5
ACSF التكوين:
مؤكسج مع 95٪ أكسجين / 5٪ CO2< / sub > يتم فقاعات باستمرار من خلال ACSF (ACSF ؛ في mM 125 NaCl ، 25 NaHCO3< / sub> ، 3 KCl ، 1.25 NaH 2< / sub>PO 4< / sub> ، 1 MgCl 2< / sub> ، 2 CaCl 2< / sub> و 25 Glucose).
Amazon برنامج

المراجع

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10(2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251(2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269(2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528(2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87(2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697(2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CA1 AAV

مقالات ذات صلة