لا تتطور نماذج ورم خبيث في العظام إلى ورم خبيث بشكل موحد أو بنسبة 100٪. يمكن أن يؤدي الحقن المباشر داخل الخلايا السرطانية العظمية إلى انصمام الرئة. نقدم تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام ، مما يؤدي إلى النقش والنمو القابل للتكرار.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام مع زرع طعم الورم الصلب في العظام
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تؤدي أورام العظام الأولية أو النقائل العظمية الناتجة عن الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة في حالة العظم أو عظمية الأرومات أو مختلطة من العظم / العظم. هذه الآفات تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. ومع ذلك ، تشير الأدلة الحديثة إلى أنه مع وجود العديد من الأورام الصلبة ، قد تكون الخلايا السرطانية التي انتشرت إلى العظام هي المصدر الرئيسي للخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. تتضمن معظم نماذج الفئران الجينية أو xenograft لأورام العظام الأولية الحقن داخل العظم (تقويم العظام) لمعلقات الخلايا السرطانية. تعتمد بعض النماذج الحيوانية للورم الخبيث الهيكلي من الأورام الصلبة أيضا على الحقن المباشر للعظام ، بينما يحاول البعض الآخر تلخيص خطوات إضافية من سلسلة النقيلي العظمي عن طريق حقن الخلايا داخل الأوعية الدموية أو في عضو الورم الرئيسي. ومع ذلك ، لا يصاب أي من هذه النماذج بورم خبيث في العظام بشكل موثوق أو بنسبة 100٪. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الحقن المباشر داخل العظم للخلايا السرطانية يرتبط بانصمام الورم المحتمل في الرئة. هذه الخلايا السرطانية الصمية تنقش ولكنها لا تلخص الشلال النقيلي. أبلغنا عن نموذج فأر للساركوما العظمية حيث يتم زرع شظايا الورم الطازجة أو المحفوظة بالتبريد (تتكون من الخلايا السرطانية بالإضافة إلى السدى) مباشرة في الساق القريبة باستخدام تقنية جراحية طفيفة التوغل. طورت هذه الحيوانات نقشا قابلا للتكرار ، ونموا ، وبمرور الوقت ، انحلال العظام وورم خبيث في الرئة. تتمتع هذه التقنية بتعدد الاستخدامات لاستخدامها في نمذجة ورم خبيث في عظم الورم الصلب ويمكنها بسهولة استخدام الطعوم التي تتكون من نوع واحد أو عدة أنواع من الخلايا ، والخلايا المعدلة وراثيا ، والطعوم الخارجية المشتقة من المريض ، و / أو الخلايا المصنفة التي يمكن تتبعها عن طريق التصوير البصري أو المتقدم. هنا ، نوضح هذه التقنية ، ونمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام باستخدام زرع طعم الورم الصلب في العظام.
المقدمة
أصبحت نماذج الفئران للأمراض البشرية والحيوانية شائعة بشكل متزايد في البحوث الطبية الحيوية. فائدة استخدام الفئران في هذا السياق هي أن تشريحها وعلم وظائف الأعضاء متشابهان جدا مع البشر. لديهم فترة حمل قصيرة نسبيا ووقت في حياة ما بعد الولادة لتحقيق النضج ، ويرتبطون إلى حد كبير بتكلفة منخفضة نسبيا وسهولة السكن ، وإن كانت تكاليف التطوير أو الشراء المتزايدة مرتبطة بدرجات أكبر من التعديل الوراثي و / أو نقص المناعة و / أو إضفاء الطابع الإنساني1. يؤدي استخدام السلالات الفطرية إلى وجود مجموعة موحدة إلى حد كبير قبل إدراج الدراسة. تشير المعرفة الكاملة للجينوم الخاص بهم إلى درجة عالية من التشابه مع البشر. تم تحديد الأهداف الجزيئية المتعامدة للعديد من عمليات المرض في جينوم الفئران وهناك الآن مكتبة واسعة من الكواشف الخاصة بالفئران التي يمكن الحصول عليها بسهولة. لذلك ، فإنها توفر الفرصة للتحليل عالي الإنتاجية نسبيا بطريقة أسرع وأقل تكلفة عند مقارنتها بالنماذج الحيوانية الأكبر1. بالإضافة إلى ذلك ، مع ظهور استراتيجيات التحرير الجيني التي تسمح بالإفراط في التعبير أو حذف جينات معينة إما على مستوى العالم أو بطريقة محددة لنوع الخلية و / أو بشكل تأسيسي أو بطريقة مستحثة ، فإنها تمثل نظاما نموذجيا مفيدا بيولوجيا للغاية للتحقيق في الأمراض البشرية والحيوانية2.
السرطان هو أحد المجالات التي تتمتع فيها نماذج الفئران بفائدة كبيرة. تعتمد نماذج الفئران الجينية للسرطان على تعديل التعبير عن الجينات المسرطنة أو الجينات المثبطة للورم ، بمفردها أو مجتمعة ، حتى تخضع الخلايا للتحول السرطاني. كما يتم حقن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أو الثابتة في الفئران. لا يزال إدخال خطوط الخلايا أو الأنسجة من البشر أو الأنواع الحيوانية الأخرى ، بما في ذلك الفئران ، هو النموذج الأكثر استخداما للسرطان في الجسم الحي. يتم استخدام الخلايا والأنسجة من الأنواع غير المتشابهة (الطعوم الخارجية) في الفئران التي تعاني من نقص المناعةبشكل شائع 2. ومع ذلك ، فإن استخدام خلايا أو أنسجة ورم الطعم الخيفي حيث يكون كل من المضيف والمتلقي من نفس النوع يسمح بالتفاعل مع جهاز مناعي سليم عند دمجه مع نفس سلالة الفأر المضيف في الأنظمة الجينية3.
تؤدي أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة إلى آفات مؤلمة تنحلالية للعظم أو عظمية أو مختلطة / تنحلية عظمية 3,4. هذه الأورام تضر بنية العظام ، وتزيد من خطر الكسر المرضي ، وتترك للمرضى خيارات علاج محدودة. تنتقل أورام العظام الأولية إلى أعضاء بعيدة، مع بعض الأنواع القادرة على الانتشار إلى مواقع الهيكل العظمي الأخرى. في مرضى سرطان الثدي ، العظام هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث الأول والموقع الأول الأكثر شيوعا لعرض المرضالنقيلي 5,6. بالإضافة إلى ذلك ، توجد الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs) في نخاع العظم قبل تشخيص ورم خبيث في الأعضاء الأخرى وتتنبأ بتطوره7. لذلك ، يعتقد أن الخلايا السرطانية الموجودة في العظام هي مصدر الخلايا التي تنتقل في النهاية إلى أنظمة الأعضاء الأخرى. توجد العديد من نماذج الفئران من ورم خبيث الورم الصلب التي تطور ورم خبيث في الغالب في الرئة والغدد الليمفاوية ، واعتمادا على نوع الورم وتقنية الحقن ، من المحتمل أن تكون أنظمة الأعضاء الأخرى3. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران من ورم خبيث العظام تفتقر إلى ذلك بشكل موثوق ، وتنتج بشكل متكرر ورم خبيث هيكلي خاص بالموقع وتطور ورم خبيث في العظام قبل أن تصل الفئران إلى معايير الإزالة المبكرة من عبء الورم الأولي أو ورم خبيث إلى أعضاء أخرى. لقد أبلغنا عن نموذج للساركوما العظمية لورم العظم الأساسي الذي يعتمد على الزرع الجراحي للطعم الخيفي للورم الصلب في الساق القريبة من الفئران8. تشكلت أورام العظام في 100 ٪ من الفئران و 88 ٪ وضعت ورم خبيث رئوي. يتجاوز حدوث ورم خبيث هذا ما يتم الإبلاغ عنه سريريا بشكل شائع في الأشخاص (~ 20-50٪) ، ولكنه ذو أهمية كبيرة لأن الرئة هي الموقع الأكثر شيوعا للورم الخبيث للساركوما العظمية9،10،11. في حين أن هذا النموذج مفيد في نمذجة أورام العظام الأولية ، إلا أنه يتمتع أيضا بفائدة كبيرة في نمذجة ورم خبيث في العظام من أورام صلبة أخرى مثل أورام الثدي والرئة والبروستاتا والغدة الدرقية والكبد والكلى والجهاز الهضمي.
كان الأساس المنطقي لتطوير هذا النموذج هو تطوير بديل للحقن التقليدي داخل العظم عادة في عظم الساق القريب أو عظم الفخذ البعيد لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيثفي العظام 12. كان هدفنا الأساسي هو التخفيف من القيود المعروفة لهذه التقنية ، أي انصمام الورم في الرئة. ينتج عن هذا تطعيم هذه الخلايا السرطانية الصمية و "ورم خبيث اصطناعي" لا يلخص الشلال النقيلي الكامل من ورم عظمي أولي راسخ ينتقل إلى الرئتين 8,13. سيكون هذا هو الوضع أيضا عندما ينتشر ورم خبيث عظمي ثابت إلى موقع بعيد. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير هذه التقنية أيضا لإنتاج نموذج لورم خبيث في العظام من شأنه أن يضمن زيادة حدوث التطعيمات ونمو الأورام في العظام وفي موقع موحد عند مقارنتها بتقنيات الحقن التقويمي أو داخل الأوعية. هذا النموذج له مزايا مميزة على هذه التقنيات الموصوفة. يتضمن هذا النموذج التوصيل المتحكم فيه والمتسق للخلايا السرطانية إلى العظام. كما أنه يتجنب ورم خبيث في الرئة بعد الانصمام الرئوي ويؤسس مجموعة دراسة موحدة أساسية. هناك فائدة من الأورام الخاصة بالموقع مع هذا النموذج دون التعرض لخطر معايير الإزالة المبكرة الناتجة عن الأورام الأولية أو ورم خبيث إلى الأعضاء الأخرى. أخيرا ، هذا النموذج له فائدة كبيرة للتعديل ، بما في ذلك استخدام الطعوم الخارجية المشتقة من المريض.
النموذج المقدم له أوجه تشابه مع الحقن المباشر لتعليق الخلية في العظام باتباع نهج جراحي متبوعا إما بالحقن عبر القشرة أو التسليم في تجويف النخاع بعد إحداث عيب صغير في القشرة (مع أو بدون توسيع تجويف النخاع)8،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن زرع طعم خيفي للورم يجعل هذه التقنية مختلفة بشكل واضح. لذلك ، كان الغرض من هذا التقرير هو إظهار هذا النموذج لأورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام من الأورام الصلبة ، والذي يتغلب على العديد من قيود النماذج الموصوفة سابقا. المجموعات البحثية ذات الخبرة في زراعة الخلايا ، ونماذج الفئران ، وتخدير الفئران وجراحتها ، وتشريح الفئران مجهزة تجهيزا جيدا لإعادة إنتاج تقنيتنا لنمذجة أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في الفئران.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كامبريدج ، كامبريدج ، المملكة المتحدة.
1. إعداد خطوط الخلايا
- تنمو خطوط الخلايا وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا القياسية في المختبر لزراعة الخلايا التقليدية أو الحقن في الفئران. البروتوكولات القياسية المستخدمة هنا هي النمو في وسط النسر المعدل من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، L-glutamine ، والبنسلين / الستربتومايسين (المعروف فيما يلي باسم وسط النمو الكامل).
ملاحظة: في هذه التجربة ، تستخدم خلايا ساركوما أبرامز العظمية في فئران Balb / c Foxn1 nu / nu . لدراسات سرطان الثدي ، يتم استخدام خلايا 4T1 في الفئران Balb / c وخلايا EO771 في الفئران C57BL / 6. - تنمو الخلايا إما في قوارير زراعة الأنسجة المنفوية أو ألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبار عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
- اجتياز خط اهتمام الخلية وإعداد الخلايا للحقن عندما تصل الخلايا إلى التقاء شائع الاستخدام مع حقن هذه الخلايا في الفئران.
2. الحيوانات
- استخدم فئران Balb / c Foxn1 nu / nu على الأقل من عمر 6-8 أسابيع لتوليد الورم تحت الجلد للتأكد من أن الحيوانات تجاوزت مرحلة النمو السريع وحققت مرحلة البلوغ والنضج الهيكلي.
- استخدم إما ذكور أو إناث الفئران. قم بعمل استثناءات عند اختيار خطوط الخلايا المستجيبة للهرمونات (على سبيل المثال ، خلايا سرطان الثدي في إناث الفئران وخلايا سرطان البروستاتا في ذكور الفئران).
- بالنسبة لتجارب xenograft ، استخدم الفئران العارية التي تعاني من نقص المناعة بناء على عدم توافق خط الخلية مع نظام المناعة السليم للفأر في ظل الظروف العادية.
- بالنسبة لتجارب الطعم الخيفي باستخدام خطوط خلايا الفئران ، يوصى بذلك أيضا بناء على خلفيات وراثية ومناعية مختلفة للفئران. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب الجينية ، استخدم الحيوانات من نفس سلالة خط الخلية محل الاهتمام.
- منزلية بكثافة قياسية اعتمادا على سياسات تربية المؤسسة.
3. الأورام تحت الجلد
- حصاد خطوط الخلايا من الثقافة عن طريق التربسين وإعادة تعليقها في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
- تقييم صلاحية الخلية وتحديد كثافة الخلية بطريقة استبعاد التريبان الأزرق. استخدم مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا. يجب استخدام الحد الأدنى من صلاحية الخلية بنسبة 90٪ للحقن في الفئران لإنشاء أورام تحت الجلد.
- اضبط كثافة الخلية لحقن 1-2 × 105 خلايا في حجم نهائي من 0.1 إلى 0.15 مل (100 إلى 150 ميكرولتر) من PBS المعقم. الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى الحقن.
- بدلا من ذلك ، خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في وسط مصفوفة غشاء قاعدي معقم غير مخفف للحصول على 1-2 × 105 خلايا بحجم نهائي من 0.1 إلى 0.15 مل (100 إلى 150 ميكرولتر). الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى استخدام مرة أخرى.
- تخدير الفئران لاستخدامها في نمو الورم تحت الجلد مع إيزوفلوران في تخدير الأكسجين. يجب استخدام جرعة تحريض من 5٪ إيزوفلوران في 2 لتر / دقيقة من الأكسجين وجرعة صيانة من 2-3٪ إيزوفلوران في 2 لتر / دقيقة من الأكسجين. تحقق من عدم وجود ردود فعل وميض أو دواسة قبل المضي قدما.
ملاحظة: إيزوفلوران هو مخدر استنشاقي. استخدم الأيزوفلوران في منطقة جيدة التهوية مع أنظمة الكسح المناسبة وجمع الغاز المجاني. يرجى استشارة الطاقم البيطري المؤسسي لوضع خطة لتحريض التخدير وصيانته ومراقبته، والتأكد من حصول موظفي المختبر على التدريب المناسب في مجال مراقبة التخدير والتعامل مع عوامل التخدير المستنشقة. - إزالة الشعر من المنطقة الظهرية من الصدر أو البطن من الفئران المخدرة مع محلول إزالة الشعر أو مع المقص الكهربائية. يفضل محلول إزالة الشعر لتقليل الصدمات المحتملة للجلد. تخطي هذه الخطوة في حالة استخدام الفئران عارية athymic.
- نظف المنطقة المحضرة بمسحة إيثانول بنسبة 70٪ قبل حقن تعليق الخلية.
- استخدم حقنة 1 مل من السل مع إبرة 27 جم لحقن الخلايا تحت الجلد فوق المنطقة الظهرية للصدر أو البطن ، حتى لا تتأثر بحركة لوحي الكتف. بدلا من ذلك ، حقن الخلايا تحت الجلد كمعلق في مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا.
ملاحظة: الحقن في مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا سيحد من هجرة معلق الخلية في الفضاء تحت الجلد لأن هذه المصفوفات تتصلب في درجة حرارة الغرفة. - استعادة الفئران على وسادة التدفئة في أقفاص فردية حتى الإسعافية. يمكن بعد ذلك وضع الفئران في أقفاصها العادية مع فراش نظيف وجاف.
- مراقبة حجم الورم تحت الجلد الذي يغطي الصدر الظهري أو البطن باستخدام الفرجار وقياس أوزان الجسم أسبوعيا للتأكد من أن الأورام تحت الجلد لا تتقرح أو أن الفئران تفي بمعايير الإزالة المبكرة على النحو الذي حددته لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسات. يوصى بحد أقصى لحجم الورم 15 مم في أي بعد لتقليل خطر تقرح الجلد أو نخر الورم المركزي.
ملاحظة: استشر الإرشادات المحلية لتحديد الحد الأقصى المسموح به لحجم / حجم الورم. - القتل الرحيم للفئران التي تحمل أوراما تحت الجلد بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع عن طريق استنشاق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. اتبع سياسات المؤسسة المقبولة للقتل الرحيم للفئران.
- حصاد الأورام تحت الجلد باستخدام تقنية جراحية معقمة. تعقيم الجلد الذي يغطي الورم كما كان من قبل باستخدام 70٪ من الإيثانول بعد إزالة الشعر (إن وجد). شق من خلال الجلد الذي يغطي الورم بشفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط). تشريح الورم بحدة من الأنسجة الرخوة المرفقة المحيطة مع زوج من مقص جراحي معقمة.
- ضع الورم في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار تحتوي على وسط نمو كامل وقم باللحم المفروم إلى شظايا صغيرة متعددة ذات حجم محدد مسبقا (~ 0.6 مم × 0.6 مم × 0.6 مم - 0.25 مم 3 حتى 1 مم × 1 مم × 1 مم - 1 مم3) بشفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط).
- الحفاظ على شظايا الورم في وسط نمو كامل معقم في درجة حرارة الغرفة حتى وقت زرع داخل الظنبوب. بالنسبة لخطوط الخلايا التي تحمل جينات لوسيفيراز أو جينات مراسل الفلورسنت ، استخدم التصوير الحيوي خارج الجسم الحي أو التصوير الفلوري لتأكيد صلاحية الورم قبل زرع داخل الظنبوب في الفئران.
- للحفظ بالتبريد ، ضع شظايا متعددة في نفس cryovial في وسط نمو كامل مكمل ب 20٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بالتجميد تدريجيا باستخدام نظام الحفظ بالتبريد التجاري عند -80 درجة مئوية وتخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل. الحفاظ على شظايا الورم للتحليل اللاحق ، ولكن ليس للزرع في المستقبل ، عن طريق التجميد المفاجئ باستخدام غمر النيتروجين السائل. قم بتخزين شظايا الورم المجمدة هذه على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: تم الإبلاغ سابقا عن أن الأورام المجمدة المفاجئة لن تنقش وتنمو في الجسم الحي8.
4. الزرع الجراحي لشظايا الورم تحت الجلد
- إحضار شظايا جديدة أو محفوظة بالتبريد من الورم تحت الجلد إلى درجة حرارة الغرفة في وسط نمو كامل قبل الزرع الجراحي.
- تخدير الفئران من سلالة الاهتمام باستخدام الأيزوفلوران في تخدير الأكسجين كما هو موضح في القسم 3. تحقق من عدم وجود ردود فعل دواسة قبل المتابعة. يتم تطبيق البوبرينورفين تحت الجلد بجرعة 0.02-0.05 ملغ/كغ لتوفير التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة. يمكن تكرار ذلك كل 6-8 ساعات في فترة ما بعد الجراحة ، إذا لزم الأمر.
- قم بإزالة الشعر على مفصل الركبة الأيمن والساق القريبة من الطرف الخلفي بمحلول إزالة الشعر لتقليل الصدمة المحتملة للجلد.
- فرك المنطقة المعدة بمطهر جراحي. افرك أولا بمسحة إيثانول بنسبة 70٪ ثم افركه بالتناوب مع الكلورهيكسيدين والمقشر الملحي.
- تصور الظنبوب القريب على أنه المنطقة البعيدة عن مفصل الركبة أثناء ثني المفصل وتمديده.
- قم بإنشاء شق 3-4 مم على مستوى الساق القريبة على الجانب الإنسي من الطرف باستخدام شفرة مشرط # 15 (مع أو بدون مقبض شفرة مشرط). شق من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد لفضح القشرة الإنسية للساق القريبة.
- قم بالضغط برفق بطرف إبرة 25 جم ، مع تدوير الطرف أيضا ، لإنشاء ثقب صغير في القشرة الإنسية للساق القريبة. اجعل هذا الثقب بعيدا حوالي 2 مم عن مفصل الركبة عند نقطة متساوية المسافة بين القشرة الظنبوبية القحفية والذيلية. حدد حجم الإبرة حسب حجم شظايا الورم.
- استخدم ملقط معقم لالتقاط شظايا الورم وإدخالها في التجويف النخاعي للساق القريبة. استخدم إبرة من 27 إلى 30 جم لمعالجة جزء الورم في القناة النخاعية. اعتمادا على حجم شظايا الورم ، قم بزرع ما لا يقل عن 0.5 مم3 من إجمالي حجم الورم في كل ساق. قد يتطلب ذلك زرع 1 أو أكثر من شظايا الورم اعتمادا على حجم شظايا الورم التي تم إنشاؤها.
ملاحظة: التعديلات لمنع أو الحد من إزاحة الكسب غير المشروع خارج العظم هي وضع شمع العظام أو الأسمنت العظمي في عيب العظام أو إما رغوة الهلام أو طعم الدهون تحت الجلد فوق الفتحة الموجودة في العظم. - ضع حواف الجلد بلاصق مناديل سائلة معقمة أو خياطة جلدية واحدة. لا تستخدم مقاطع الجرح في هذا الموقع. توخ الحذر عند استخدام التصوير الفلوري في فترة ما بعد الجراحة ، لأن كل من المواد اللاصقة للأنسجة والخياطة لديها القدرة على التألق.
- استعادة الفئران على وسادة التدفئة في أقفاص فردية حتى الإسعافية.
5. التقييم التسلسلي ونقطة النهاية
- تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران في تخدير الأكسجين كما هو موضح سابقا.
- قم بتقييم نمو ورم الظنبوب بشكل غير جراحي إما عن طريق التصوير الشعاعي الرقمي الأسبوعي أو التلألؤ الحيوي أو التصوير الفلوري (إذا كنت تستخدم خلايا تعبر عن لوسيفيراز أو جين مراسل فلوريسنت). يمكن أيضا إجراء قياسات الفرجار للطرف في موقع الزرع في الفئران المستيقظة.
- بالإضافة إلى المراقبة التقليدية للفئران الحاملة للورم (وزن الجسم ، ومستوى النشاط ، ومعدل التنفس ، والاستمالة ، والموقف ، والعقل ، والسلوك) ، راقب الفئران أسبوعيا بحثا عن علامات عرج الأطراف الخلفية والتورم وعدوى موقع الجراحة.
- راقب الجرح الجراحي الجلدي لأول 10-14 يوما بحثا عن الاحمرار المفرط والتورم والتصريف وتفكك الجرح حتى يلتئم جرح الجلد. بعد 4-5 أسابيع ، قم بتقييم الفئران وفقا لتقييم نتائج الدراسة إما على قيد الحياة أو بعد القتل الرحيم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قد تترافق النتيجة الإيجابية مع تطعيم الورم ونمو الورم التدريجي بمرور الوقت. اعتمادا على نوع الورم ، قد يرتبط نمو الورم داخل العظم بعرج الأطراف الخلفية التدريجي ، لكن العديد من الأورام لا تسبب العرج على الرغم من علامات مرض العظام المصاحب. تم توثيق النقش الناجح بالتصوير المتقدم ، حيث ستكون هناك تغييرات إشعاعية تقدمية أو μCT أو μMRI في الساق القريبة المرتبطة بالنمط الظاهري العظمي لخط اهتمام الخلية (ورم خبيث عظمي ، عظمي الأرومات ، أو ورم خبيث مختلط / عظمي باني) (الشكل 1) 8
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوثق هذا التقرير نموذجنا لإنشاء أورام العظام الأولية أو ورم خبيث في العظام بعد زرع الطعم الخيفي داخل الظنبوب للورم. ونعتقد أن هناك عدة خطوات حاسمة في هذه العملية. يجب إنشاء مستوى مخدر آمن لكل من الحقن تحت الجلد لتعليق الخلايا السرطانية ووضع شظايا الورم الناتجة داخل الظنبوب. يجب أن يكون هناك إعداد معقم للموقع الجراحي لإزالة كل من الطعم الخيفي تحت الجلد ووضع الطعم الخيفي داخل الظنبوب. يجب إنشاء شظايا الطعم الخيفي للورم بشكل موحد للزرع اللاحق داخل الظنبوب. يجب إنشاء عيب بحجم مناسب في الساق القريبة لزرع شظايا الورم. يجب إغلا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تم تمويل الدكتور هيلدريث من قبل المعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة K01OD026527. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بالمساهمة الحاسمة للدكتورة بيث تشافي ، DVM ، دكتوراه ، DACVP في تطوير هذه التقنية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 15 شفرة مشرط | هنري شاين المحدودة. | 75614 | لا توجد |
| ألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبار | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | تستخدم لفرم قطع الورم. يمكن استخدامه أيضا لزراعة الخلايا |
| خط خلايا الساركوما العظمية أبرامز | غير قابل للتطبيق | لا | |
| آلة التخدير مع مبخر الأيزوفلوران وخزان (خزانات) الأكسجين VetEquip | 901805 | لا شيء | |
| وزن | كينت Scientific | SCL- 1015 | لا شيء |
| BALB / c ماوس عاري (nu / nu) | تشارلز ريفر المحدودة. | NA | 6-8 أسابيع من العمر. من الذكور أو الإناث الفئران |
| الأسمنت العظمي | Depuy Synthes | 160504 | استخدام اختياري بدلا من شمع العظام |
| شمع العظام | Ethicon | W31G | اختياري |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N / A | Buprecare 0.3 مجم / مل محلول للحقن للكلاب والقطط |
| محطة القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون | N / A | N | يجب توفيره داخل منشأة حيوانية |
| تم تعيين حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة ؛ C و 5٪ ثاني أكسيد الكربون | Heraeus | مختلف | لا |
| الكلورهيكسيدين فرك جراحي | فيتوكينول | 411412 | لا شيء |
| Cryovials (2 مل) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | اختياري إذا كانت شظايا الورم الحافظة بالتبريد |
| D-luciferin (Firefly) ، ملح البوتاسيوم | Perkin Elmer | 122799 | اختياري إذا كان خط الخلية محل الاهتمام يحتوي على جين مراسل مضيء بيولوجي |
| الفرجار الرقمي | Mitutoyo | 500-181-30 | يمكن أن يكون يدويا |
| خزانة التصوير الشعاعي الرقمي | Faxitron Bioptics، LLC | MX-20 | اختياري لتقييم استجابة العظام لنمو الورم |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | اختياري إذا كانت شظايا الورم الحافظة بالتبريد |
| Dulbecco s النسر المعدل s متوسطة | الحرارة فيشر العلمية | 11965092 | لا شيء |
| من الإيثانول (70٪) | سيجما ألدريتش | 2483 | لا شيء |
| مصل الأبقار | الجنيني ثيرمو فيشر العلمي | 26140079 | لا شيء |
| ملقط ، دومونت | أدوات العلوم الجميلة ، إنك. | 11200-33 | لا يوجد |
| فريزر (– 80 ° ج) | Sanyo | MDF-794C | اختياري في حالة حفظ شظايا الورم بالتبريد أو التجميد المفاجئ مقياس |
| الدم | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | يمكن أيضا استخدام عداد الخلايا الآلي ، إن وجد |
| إبر تحت الجلد (مقياس 27) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | قد تستخدم أيضا إبر 25G (DIS55509) و 30G (كتالوج DIS599) |
| Ice | N / A | N / A | قطع صغيرة مثالية في حاوية لتخزين الحقنة وتعليق الخلية |
| مقص القزحية | Fine Science Tools، Inc. | 14084-08 | لا شيء |
| إيزوفلوران | هنري شاين المحدودة. | 1182098 | لا شيء |
| IVIS Lumina III نظام التصوير الحيوي / التألق | Perkin Elmer | CLS136334 | اختياري إذا كان خط الخلية محل الاهتمام يحتوي على جينات مراسل مضيئة بيولوجية أو فلورية |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| النيتروجين السائل | شركة الأكسجين البريطانية | NA | اختياري إذا كان الحفظ بالتبريد أو التجميد المفاجئ لشظايا الورم |
| ديوار النيتروجين السائل ، 5 لترات | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | اختياري إذا كانت شظايا الورم بالتبريد |
| Matrigel & reg ؛ ماتريكس GFR، خال من LDEV، 5 مل | Corning Life Sciences | 356230 | اختياري. متوفر أيضا بحجم 10 مل (354230) |
| الطرد المركزي | الدقيقة Thermo Fisher Scientific | 75002549 | خلايا الحبيبات عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5-6 دقائق |
| Mr. Frosty المحتوي للتجميد | Fisher | Scientific 10110051 | اختياري إذا كانت شظايا الورم الحافظة بالتبريد |
| NAIR غسول / زيت | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | يمكن بدلا من ذلك استخدام ماكينة قص كهربائية بشفرة دقيقة |
| البنسلين / الستربتومايسين | سيجما-ألدريتش | P4333 | لا يوجد |
| مقبض مشرط ، # 7 أدوات | العلوم الدقيقة القصيرة ، Inc. | 10007-12 | تفضيل المستخدم طالما أنه يقبل # 15 شفرة مشرط |
| وسادة ساخنة للحيوانات الصغيرة | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | لا شيء |
| محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) | 10010023 | Thermo Fisher Scientific | للحقن وأيضا كجزء من المقشر الجراحي ، بالتناوب مع لاصق الأنسجة الكلورهيكسيدين |
| (معقم) | 3M Corporation | 84-1469SB | يمكن بدلا من ذلك استخدام خياطة الجلد غير القابلة للامتصاص (حجم 6-0) |
| تريبان الأزرق | ثيرمو فيشر العلمي | 5250061 | لا شيء |
| 25300054 | Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | استخدم 0.05٪ -0.25٪ |
| حقنة توبركولين (1 مل بتدرجات 0.1 مل) | طرف Becton Dickinson | 309659 | Slip على |
| قوارير زراعة الأنسجة ذات التهوية Luer ، T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | يمكن أيضا استخدام قوارير أصغر أو أكبر ، حسب الحاجة |
المراجع
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230(2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777(2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185(2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982(2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981(2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130(2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
