إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية (Periplaneta americana)

وقد أثبتت الحيوانات الغنوتوبيوتية لتكون أدوات لا تقدر بثمن^{لدراسات}الميكروبيوم 1^،2،3. سمحت الحيوانات الخالية من الجراثيم والمحددة النباتات باختزال التفاعلات بين المضيف والميكروب ، بما في ذلك الاستجابات المناعية المضيفة ، ونضوج ظهارة الأمعاء ، والتمثيل الغذائي المضيف^1و4و^5و6و7. وقد ساعدت الحيوانات الغنوتوبيوتية تلقيح مع مجتمع مبسط أيضا في فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات الميكروبات والميكروبات في المجتمع الأمعاء، وتحديدا في كشف عبر التغذية والعلاقات العدائية^8،9،10،11. النظام النموذجي المفضل الحالي للدراسات في ميكروبيوم الأمعاء الثديية هو نموذج المورين. وفي حين أن هذا النظام كان حيويا في الاكتشافات المبينة أعلاه، فإن أحد أوجه القصور الرئيسية هو التكلفة التي ينطوي عليها الأمر. 10 - ومن الضروري توفير معدات متخصصة وفنيين مدربين تدريبا عاليا لإنشاء مرفق للكائنات الحية والاحتفاظ به. هذا، في تركيبة مع الرعاية الإضافية التي يجب أن تعطى لكل جانب من جوانب الحفاظ على الحيوانات الغنوتوبيوتك، يسبب الغنوتوبيوتك لتكلفة عشر إلى عشرين مرة أكثر من تربية نموذج حيواني قياسي¹². بسبب ارتفاع التكاليف، قد يكون العديد من الباحثين غير قادرين على تحمل نموذج مورين الغنوتوبيوتك. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن نماذج مورين قد يكون الخيار الأكثر قبولا على نطاق واسع للدراسات التي تتطلع إلى ترجمة إلى صحة الإنسان، لا تزال هناك العديد من الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين أحشاء الإنسان والفأر¹³. من الواضح أنه لا يوجد نموذج فريد يكفي للإجابة على العدد المتزايد من الأسئلة المتعلقة بالجوانب العديدة لميكروبيوم الأمعاء.

نماذج الحشرات هي بديل أرخص بسبب انخفاض تكلفة الصيانة بالمقارنة مع أنواع الثدييات. وقد أدت البحوث الواسعة النطاق الخالية من الجراثيم والكائنات الحية في مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات إلى تطوير نماذج متعددة شائعة الاستخدام. البعوض و Drosophila هي نماذج شائعة للعمل الخالي من الجراثيم نظرا لأهميتها للأمراض العالمية وقابلية المسالك الوراثية^14،15. نظام نموذج آخر الناشئة هو أن نحلة العسل(Apis mellifera)، نظرا لاهميتها في التلقيح والبحوث الاجتماعية¹⁶. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الحشرات شائعة الاستخدام تفتقر إلى التعقيد التصنيفي الذي شوهد في مجتمعات الأمعاء الثديية¹⁷، مما يحد من قدرتها على نمذجة التفاعلات ذات الترتيب الأعلى. ليس فقط التنوع الكلي للميكروبات الموجودة في أمعاء الصراصير الأمريكية أكثر تشابها مع الثدييات ، ولكن العديد من الميكروبات الموجودة في القناة الهضمية للصرصور تنتمي إلى العائلات والفيرلا التي توجد عادة في ميكروبيوتا الأمعاء من الثدييات والبشر¹⁸. كما أن الحشرة الخلفية للصرصور مماثلة وظيفيا للأمعاء الغليظة للثدييات ، لأنها غرفة تخمير مكتظة بالبكتيريا للمساعدة في استخراج العناصر الغذائية^19،20. وأخيرا ، فإن الطبيعة الشاملة للصراصير تسمح بتنوع أنظمة النظام الغذائي التي لن تكون ممكنة مع المتخصصين في النظام الغذائي.

الصراصير الأمريكية يمكن أن تكون نظاما نموذجيا مفيدا لفهم المجتمعات الميكروبية في الأمعاء في الكائنات الحية العليا ، ولكن وضع الصرصور كآفة يجعل هذا النظام مناسبا لمكافحة الآفات^21. تساعد الاستفادة من المعرفة الأساسية لتأثير مجتمع الأمعاء على صحة الصرصور وعلم وظائف الأعضاء في تطوير تقنيات جديدة لإدارة الآفات.

الهدف من هذه الطريقة هو تحديد وصف شامل لإنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية(Periplaneta americana)، ولكن يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد حوريات أي صرصور أوفيباروس. وهو يتضمن طريقة لجمع فعالة وغير الباضعة من oothecae ناضجة ، وتقنية غير تدميرية لرصد الحالة الغنوتوبيوتية للحشرات^22،23،24. في حين أن الطرق السابقة لتحقيق وصيانة الصراصير الغنوتوبيوتك تصف جمع ootheca^{23،24،25،26،27}، يتم تفسير نضج ootheca إما من حيث الإشارات الخاصة بالأنواع (في Blattella germanica^22،24،25)، أو لم يتم وصفها صراحة^27،28، مما يجعل التنفيذ صعبا على أولئك غير المألوفين مع النظام. منذ الطريقة الموصوفة هنا يستخدم oothecae انخفض بشكل طبيعي، خطأ إزالة البيض قبل الأوان غائبة. يحتوي هذا البروتوكول على أساليب تعتمد على الثقافة ومستقلة عن الثقافة لمراقبة الجودة ، ولا تتطلب الطريقة المعتمدة على الثقافة التضحية بالحشرات. وأخيرا ، تجمع هذه الطريقة معلومات من دراسات صرصور غنوتبيوتك متعددة لإنشاء بروتوكول شامل واحد مع جميع المعلومات اللازمة لتحقيق الصراصير الغنوتوبيوتية والحفاظ عليها.

1. إعداد المواد

1. الحفاظ على ثقافات الصرصور الأسهم
   ملاحظة: هناك العديد من الطرق لتربية هذه الحشرات القوية. ويمكن أن تختلف التفاصيل المتعلقة بتوفير المأوى والماء تبعا للمواد التي يمكن الوصول إليها (أي علب البيض بدلا من أنابيب الورق المقوى). سيعمل بروتوكول التعقيم التالي لأي إعداد خزان مخزون.
   1. انتشار ما يكفي من الفراش الخشب في خزان السمك 37.85 لتر (10 غالون) لتغطية الجزء السفلي من الخزان مع ما يقرب من 1 بوصة من الفراش. إعداد السكن عن طريق قطع الورق المقوى (شقة) إلى 2 في × 4 في القطع. إدراج قطع من الورق المقوى في أنابيب من الورق المقوى (على سبيل المثال، أنابيب ورق التواليت) وأنابيب كومة في نهاية واحدة من الخزان (الشكل 1).
   2. تشويه طبقة رقيقة من هلام البترول على أعلى بوصتين من داخل الخزان لمنع هروب الحشرات.
      ملاحظة: تأكد من معطف بشكل صحيح داخل زوايا الخزان.
   3. أضف الصراصير عن طريق نقل أنابيب الورق المقوى (المحتلة) من خزان مخزون سابق ، وهزها لإطلاق سراح سكانها. لكل عملية نقل، انتقل 100−200 صراصير مختلطة العمر، مختلطة الجنس. أضف طعام البكبي (20−30 قطعة)، وراقب كمية طعام البكبي في الخزان، ثم أعد الملء عند انخفاضه.
   4. إعداد طبق الماء.
      1. ملء حاوية طعام بلاستيكية صغيرة قابلة لإعادة الاستخدام بماء مقطر مزدوج (ddH₂O). قطع الإسفنج السليلوز والثقوب في غطاء حاوية الطعام إلى نفس الحجم تقريبا.
         ملاحظة: تمنع إسفنجات السليلوز الصراصير من الغرق في طبق الماء.
   5. أدخل الإسفنج في ثقوب في الغطاء وضع الغطاء على الحاوية المملوءة. ضع الحاوية في الخزان ثم أعد تعبئتها عند انخفاضها. قم بتغطية الخزان بقطعة قماش قطنية وقم بتأمينه في مكانه بشريط مرن.
   6. عندما تبدأ الخزانات في تجميع كميات مفرطة من الحشرات والحشرات ، قم بإنشاء خزانات جديدة ونقل الصراصير.
      ملاحظة: عادة ما يتم نقل الدبابات كل 6 أشهر. يتم قتل أي صراصير /بيض متبقية في خزانات المخزون المسحوبة من الخدمة عن طريق التجميد عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم يتم نقل محتويات خزان المخزون إلى كيس الأوتوكلاف وتعقيمه تلقائيا (1 ساعة ، دورة الجاذبية) قبل التخلص منه. يتم تعقيم خزانات المخزون مع 2٪ التبييض بين الاستخدامات.
2. تطهير حاوية ثانوية.
   ملاحظة: لا تتضمن هذه الحاوية عامل تصفية، ولكنها تسمح بدلا من ذلك بتبادل الهواء مجانا.
   1. رش داخل كل من الغطاء والسفلي مع تبييض 2٪ والسماح لهم لنقع لمدة 10 دقيقة. مسح التبييض مع منشفة ورقية نظيفة.
   2. رش داخل الغطاء والسفل مع الإيثانول 70٪ ومسح الجافة مع منشفة ورقية نظيفة. استبدل الغطاء حتى الاستخدام.
3. جعل BHI slants وقوارير لاحتضان البيض والحوريات الإسكان.
   1. إعداد BHI وفقا لتعليمات الحزمة، مضيفا 2٪ أجار. غلي محلول BHI-أجار حتى يتضح.
   2. بالنسبة للسلانتس، قم بنقل 5 مل من الأنابيب الزجاجية وغطاء الأنابيب والغطاء إلى 18 مم × 150 مم. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف (وقت التعقيم = 20 دقيقة، دورة السائل). ضع أنابيب معبئة تلقائيا بزاوية 45 درجة لتبرد في مائلة. مرة واحدة صلبة، والتبريد حتى استخدامها لمنع الجفاف.
   3. للقوارير، نقل 10 مل aliquots من محلول BHI-أجار المسلوقة إلى قارورة Erlenmeyer 250 مل لتغطية الجزء السفلي تماما من القارورة. تغطية قارورة مع احباط وتعقيم عن طريق الأوتوكلاف (20 دقيقة، دورة السائل). السماح للقارورات المعبئة تلقائيا بالتبريد والتبريد حتى يتم استخدامها لمنع الجفاف.
      ملاحظة: مطلوب أي عامل تصفية الهواء لهذا الإعداد. غطاء احباط كافية للسماح تبادل الغاز مع منع التلوث من تدفق الهواء الطلق.
4. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف: تشاو الفئران القابلة للاعتراف مقسمة إلى نصف الأحجام (~ 1/2 بوصة قطعة) في كوب مغطى احباط (وقت التعقيم = 1 ساعة، دورة الجاذبية)، ddH₂O في زجاجة توج (وقت التعقيم = 20 دقيقة، دورة السائل)، والملقط في كوب مغطى احباط (وقت التعقيم = 20 دقيقة، دورة الجاذبية).
   ملاحظة: لا تملأ كأس الطعام الفئران. الكريات سوف تنتفخ في الأوتوكلاف.
5. إنشاء خزان "جناح الأمومة".
   ملاحظة: يحتوي هذا الخزان على نفس المواد مثل خزانات المخزون (أنابيب الورق المقوى ، أطباق المياه مع الإسفنج ، طعام الكلب ، فراش الخشب ؛ انظر الشكل 1)ويجب أن يكون فارغا من الصراصير ما لم يتم نقله لجمع oothecae (انظر القسم 2).
6. ترطيب حاضنة عن طريق إعداد كوب كامل من كلوريد الصوديوم المشبعة الفائقة (NaCl) الحل. إعداد هذا الحل عن طريق إضافة 37 غرام من NaCl لكل 100 مل من ddH₂O واثارة حتى يذوب.
   ملاحظة: عادة ما يقوم 500 مل من محلول الملح المشبع بترطيب حاضنة ذات أبعاد غرفة 51 سم × 46 سم × 46 سم (H x W x D) لمدة شهر تقريبا قبل إضافة المزيد من الماء.

2. مجموعة من oothecae

1. نقل الإناث (في أي عدد حسب الاقتضاء للتجارب المخطط لها) تحمل oothecae (الشكل 2) من خزان المخزون إلى "جناح الأمومة" باستخدام ملقط لنقل أنابيب الورق المقوى التي تحتوي على الإناث gravid.
   1. إذا كان أنبوب اللوح يحتوي على حشرات متعددة بالإضافة إلى الأنثى المرقة ، فقم أولا بإزهاق الأنبوب في وعاء بلاستيكي إضافي محاط بهلام البترول ، ثم شجع الحشرة المستهدفة على الصعود مرة أخرى إلى أنبوب الورق المقوى وحده.
2. نقل الإناث مرة أخرى إلى خزان الأوراق المالية مرة واحدة أنها قد انخفض oothecae بهم. استرداد oothecae من القمامة في الخزان مع ملقط.
   ملاحظة: غالبا ما يتم إسقاط Oothecae في غضون 24 ساعة من نقل الأنثى.

3. تنظيف أوثيكاي

1. أضف oothecae إلى أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل يحتوي على 3 مل من كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS). دوامة لمدة 10 s. كرر خطوة غسل ثانية مع أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على SDS الطازجة.
   ملاحظة: يمكن استخدام ما يصل إلى خمسة oothecae لكل 3 مل من SDS.
2. باستخدام مسح مهمة حساسة، فرك بلطف سطح كل ootheca لإزالة أي حطام. يمكن إضافة المزيد من SDS للمساعدة في التنظيف الشامل. مكان تنظيف oothecae في قارب وزن حتى جاهزة للتعقيم.
   ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا، ولكن ترك الأوثيكاي في بيئات الرطوبة المنخفضة لفترات طويلة من الزمن (من أيام إلى أسابيع) سيؤدي إلى جفافه وفقدان قدرته على البقاء.

4. تعقيم واحتضان oothecae

1. Aliquot المياه العقيمة لشطف ما بعد التعقيم. لكل ootheca ليتم تعقيمها، وملء اثنين من أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل مع 1 مل من الماء العقيم.
2. إضافة 10 ميكرولتر من التركيز (32٪) محلول مخزون حمض البيرسيت إلى 3.2 مل من ddH₂O في أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل لإنشاء محلول 0.1٪ للتعقيم. كاب وعكس عدة مرات لخلط.
   تنبيه: حمض البيراستيك ضار عند ملامسة الجلد أو الرئتين. تمييع في غطاء الدخان.
   ملاحظة: يجب أن يتم ذلك في نفس يوم التعقيم. إذا تم تخفيفه مسبقا ، فإن المحلول سيتحلل بسرعة وبالتالي لا يتم تعقيمه بشكل صحيح. قد يتم تعقيم ما يصل إلى خمسة oothecae تنظيفها في 3.2 مل من حمض المخفف.
3. مكان (حتى خمسة) تنظيف oothecae في محلول حمض البيرأستيك 0.1٪ لمدة 5 دقائق. عكس الأنبوب عدة مرات كل 60 s.
4. في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، استخدم ملقط معقمة لنقل كل ootheca إلى أنبوب الطرد المركزي الخاصة بها مع الماء المعقم aliquoted شطف (الخطوة 4.1). عكس عدة مرات لخلط. كرر لشطف الثانية، ثم نقل كل ootheca شطف إلى الميل BHI الخاصة بها باستخدام ملقط معقمة.
5. ضع الميول في الحاوية الثانوية المعقمة. نقل الحاوية إلى الحاضنة المرطبة عند 30 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع حتى تفقس.
   ملاحظة: يمكن أن تعقد Slants تستقيم بواسطة حامل أنبوب اختبار صغير أو كوب متوسط / صغير.
6. تحقق من الميول بانتظام (1−2x في الأسبوع). إذا ظهر نمو المستعمرة الفطرية أو البكتيرية على الأجار ، فإزالة الميل الملوث. عندما تقترب نقطة زمنية 4 أسابيع، تحقق من slants كل يوم.
   ملاحظة: بمجرد فقسها، يمكن للحوريات البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى عدة أسابيع على BHI وحدها ولكنها لن تنمو على النحو الأمثل.

5. الحفاظ على الحوريات الغنوتوبيوتية

1. في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، نقل مطهر بيليه من تشاو الفئران المعقمة إلى قارورة BHI المعدة (من الخطوة 1.3.3) مع ملقط معقمة. وكفحص للعقم، ضع القارورة في الحاوية الثانوية في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ولا تستخدمها إذا ظهر النمو.
2. إضافة حوريات إلى قارورة BHI مع بيليه الطعام العقيم. يهز بها للخروج من الميل BHI والسماح لهم تقع في قارورة في غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
   ملاحظة: لا تحتوي الحوريات على الجر على الجدران الزجاجية للأنبوب الاختباري. هز أنبوب لضرب لهم الخروج من الميل ومن ثم ترجيح الأنبوب للسماح لهم بالانزلاق إلى أسفل الزجاج في القارورة فعالة. في حين يمكن نقل الحوريات باستخدام ملقط، وخطر الإصابة القاتلة عالية.
3. حوريات المياه مع 300 ميكرولتر من المياه العقيمة مرة واحدة في الأسبوع في غطاء محرك السيارة تدفق صفح عن طريق الأنابيب مباشرة على أرضية BHI من القارورة.
4. كما البراز حورية تبدأ لتغطية الكلمة BHI، ونقل إلى قارورة BHI جديدة، مضيفا تشاو الفئران المعقمة 24 ساعة مقدما (للتحقق من العقم) كما هو الحال في الخطوة 5.1.

6. مراقبة الجودة من العقم

1. إزالة حورية واحدة من قارورة BHI للتضحية من أجل التحقق من الجودة المستقلة عن الثقافة للحالة الغنوتوبيوتية عن طريق تعدد الأشكال المقيد بطول الجزء (RFLP). للقيام بذلك، صب حورية في أنبوب الطرد المركزي العقيمة (على غرار نقل الحورية من الخطوة 5.1) أو وضع قضيب خشبي معقم في القارورة وانتظر حورية لبدء تسلقه، ثم نقله إلى أنبوب الطرد المركزي.
2. إضافة 0.5 مل من 1x فوسفات المالحة المخزنة (PBS) إلى حورية في أنبوب الطرد المركزي وتجانس مع ميكروبيستل عقيمة حتى يتم تقسيم جميع القطع الكبيرة. دوامة جيدا.
3. استخراج الحمض النووي من الحورية متجانسة باستخدام عدة استخراج الحمض النووي البكتيرية (جدول المواد) على النحو التالي.
   1. الطرد المركزي حورية متجانسة لمدة 10 دقيقة في 5000 × ز وإزالة supernatant. سخني شاكر حراري إلى 37 درجة مئوية.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من 1x تريس-EDTA، ودوامة لإعادة إنفاق بيليه تماما. إضافة 10 ميكرولتر من اليوزوزيم ومزيج، تليها حضانة 30 دقيقة (لا تهتز) في شاكر الحرارية 37 درجة مئوية مسخن.
   3. إضافة 25 ملغ من الخرز الزجاجي للعينات، ودوامة بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. سخني شاكر الحرارة إلى 55 درجة مئوية.
   4. السماح للخرز لتسوية قبل نقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من البروتين K العازلة و 20 ميكرولتر من البروتين K. دوامة لخلط جيدا.
   5. احتضان، مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة، في 55 درجة مئوية شاكر الحرارية لمدة 60 دقيقة. جهاز طرد مركزي على 10,000 x g لمدة دقيقتين، ونقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل. سخني شاكر الحرارة إلى 65 درجة مئوية. ابدأ في تسخين المخزن المؤقت elution في فرن تهجين 65 درجة مئوية.
   6. إضافة 220 ميكرولتر من الإيثانول 100٪. دوامة بأقصى سرعة ل 20 s. تفريق أي عجل مرئية عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 10x.
   7. أدخل عمود DNA في أنبوب تجميع سعة 2 مل، ثم قم بنقل العينة إلى العمود، بما في ذلك أي عجلة قد تكون تشكلت. جهاز الطرد المركزي في 10،000 × غرام لمدة 1 دقيقة، وتجاهل filtrate من أنبوب جمع، واستبدال أنبوب جمع.
   8. أضف 500 ميكرولتر من العازلة الربط إلى العمود، والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة دقيقة واحدة. تجاهل filtrate من أنبوب جمع واستبدال أنبوب جمع.
   9. أضف 700 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي إلى العمود، والطرد المركزي عند 10,000 × غرام لمدة دقيقة واحدة. تجاهل filtrate من أنبوب جمع واستبدال أنبوب جمع. كرر لخطوة غسل ثانية.
   10. عمود فارغ الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة لتجفيفه، ونقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل بعد ذلك. أضف 50 ميكرولتر من العازلة التسخين المسبق مباشرة إلى مصفوفة عمود الحمض النووي، واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   11. جهاز طرد مركزي عند 10,000 x g لمدة دقيقة واحدة إلى elute. قياس الحمض النووي المستخرج في الخيوط عن طريق قياس الطيف أو قياس الفلوروميتريا.
4. تضخيم وهضم الجين كله 16S. تصور شظايا باستخدام هلام الكهربائي.
   1. استخدام 12.5 ميكرولتر من مزيج رئيسي 2x، 0.5 ميكرولتر من كل التمهيدي 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) و 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)، 5 نانوغرام من الحمض النووي، والمياه الجزيئية الصف لحجم رد فعل إجمالي قدره 25 ميكروغرام.
   2. تشغيل برنامج الترموسيكلر التالي: 94 درجة مئوية لمدة 60 s؛ تليها 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 s، 50 درجة مئوية ل 45 s، 68 °C لمدة 90 s؛ متبوعا ب 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. تنقية البوليميراز سلسلة التفاعل (PCR) المنتج باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي(جدول المواد).
      1. إضافة 120 ميكرولتر من تنقية المخزن المؤقت للمنتج PCR ودوامة لخلط. طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع قطرات داخل الغطاء. أدخل عمود الحمض النووي في أنبوب تجميع سعة 2 مل، ونقل السائل إلى العمود المعد والطرد المركزي عند 13,000 ≥ × غرام لمدة دقيقة واحدة.
      2. تجاهل الخيوط واستبدال أنبوب جمع. أضف 700 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي والطرد المركزي عند 13,000 ≥ × غرام لمدة دقيقة واحدة. تجاهل الخيوط واستبدال أنبوب جمع. كرر لخطوة غسل ثانية.
      3. طرد العمود الفارغ لمدة دقيقتين لتجفيف العمود ونقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. أضف 50 ميكرولتر من العازلة التسخين المسبق مباشرة إلى مصفوفة عمود الحمض النووي، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
      4. جهاز طرد مركزي عند 10,000 x g لمدة دقيقة واحدة إلى elute. قياس الحمض النووي المستخرج في الخيوط عن طريق قياس الطيف أو قياس الفلوروميتريا.
   4. إضافة 1 ميكروغرام من المنتج PCR المنقى إلى 5 ميكرولتر من العازلة الهضم، 10 وحدات RsaI، والمياه الجزيئية الصف لحجم التفاعل الكلي من 50 ميكرولتر.
   5. فصل المنتج المهضوم عن طريق إلكتروفورسيس هلام عن طريق تشغيل 20 ميكرولتر من الحمض النووي هضم على هلام agarose 2٪. تصور الجل لتأكيد الحالة الغنوتوبيوتية.
      ملاحظة: يجب أن تؤدي الحشرات الغنوتوبيوتية فقط إلى نطاقات عند 402 نقطة أساس ، 201 bp ، وتشويه من 163 إلى 148 bp ، استنادا إلى تسلسل rDNA 16S من الإندوسيمبيونت ، Blattabacterium. أي نطاقات إضافية ينظر في هلام تدل على تلويث الأنواع الميكروبية.

7. تتبع العقيم للنمو الحورية

1. سجل طول الجسم لتتبع نمو الحوريات عن طريق قياس الحشرات من خلال أرضية BHI الشفافة من القارورة.
   ملاحظة: يمكن وضع الحوريات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإبطاء حركتها، مما يجعل قياسها أسهل.

يتم إعداد خزانات المخزون كما هو موضح في الشكل 1. يتم التعرف على الإناث "الحوامل" من قبل ootheca تعلق على البطن الخلفي، كما هو في الصورة في الشكل 2. حضانة oothecae على أجار BHI يسمح لمراقبة الجودة الغنوتوبيوتية بطريقة غير تدميرية. في بعض الحالات، والتعقيم غير ناجحة، ويظهر النمو حول oothecae كما هو الحال في الشكل 3B. وينبغي إزالة هذه oothecae والتخلص منها. في أيدينا، لوحظ متوسط معدل فشل 10٪ للتعقيم (ن = 51). يفقس oothecae في المتوسط 34 يوما بعد التعقيم دون نمو على المتوسط ، كما رأينا في الشكل 3A. لقد لاحظنا معدلات فقس نموذجية من 41٪ (ن = 46) لتعقيم، غير ملوثة oothecae، بمتوسط 11 حورية لكل ootheca. يتم نقل الحوريات أكبر إلى قوارير BHI مغطاة احباط، كما هو الحال في الشكل 4. احباط يمنع التلوث، والحوريات لديها مساحة للنمو. RFLP من rDNA 16S من حورية متجانسة يستخدم لتأكيد الحالة الغنوتوبيوتية. وقد لوحظ الحوريات الغنوتوبيوتية تنمو بمعدل أبطأ من نظيراتها غير العقيمة، كما هو ممثل الشكل 5. يعرض الشكل 6 نتائج الحشرات الغنوتوبيوتية الناجحة وكذلك الحوريات القياسية (غير النجمية).

وفي حين أن هذا الاختبار لم يحدد التلوث بعد في غياب نتيجة إيجابية للثقافة، فقد تم تنفيذ هذه الخطوة بشكل روتيني خلال التجارب الحرجة لاستبعاد وجود ميكروبات حساسة للأوكسجين أو سريعة الثبات. لوحظ تباطؤ النمو في الصراصير الغنوتوبيوتك بالمقارنة مع الحشرات القياسية / غير النجمية.

الشكل 1: إعداد ثقافة مخزون الصراصير.
ويمكن رؤية أنابيب من الورق المقوى مكدسة في الطرف البعيد من الخزان. الطعام والماء على حد سواء بالقرب من الجزء الأمامي من الخزان. تمت إزالة غطاء من القماش القطني وشريط مرن للرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صرصور أمريكي "حامل".
يشير السهم إلى ootheca. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور الحوريات الغنوتوبيوتية بنجاح فقست وتعقيمها دون جدوى oothecae على الميول BHI.
تم تعقيم Oothecae واحتضانها كما هو موضح في هذا البروتوكول. (أ)عدم وجود نمو ميكروبي على الميل BHI يشير إلى أن الحشرات خالية من الكائنات الحية القابلة للزرع. (ب)Oothecae على slants التي تؤدي إلى تشكيل مستعمرة ينبغي التخلص منها كما الملوثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: جهاز تربية غنوتوبوتيك.
يتم الاحتفاظ بالحشرات في قوارير معقمة مغطاة بغطاء احباط لمنع التلوث. يتم تعقيم الحاوية الثانوية (الغطاء الأخضر) مع تبييض 2٪ يليه الإيثانول بنسبة 70٪. لا يتم تقييد تدفق الهواء في الحاوية الثانوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: بيانات معدل النمو التمثيلي التي تقارن أطوال الجسم من الحوريات الغنوتوبيوتية وغير النجمية. تم تغذية كلتا المجموعتين من الحشرات بنظام غذائي القوارض المكواة تلقائيا. يتم الاحتفاظ الحشرات الغنوتوبيوتية (هنا: ن = 105) على BHI كما هو موضح. تعيش الحشرات غير النجمية (هنا: n = 50) في قوارير مع فراش خشبي معبف تلقائيا مع أطباق صغيرة للمياه. تنمو الحوريات غير النجمية بمعدل متوسط قدره 0.059 مم في اليوم، في حين تنمو الحوريات الغنوتوبيوتية بمعدل 0.028 مم/يوم (p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: صورة هلامية تمثيلية لنتائج RFLP لمراقبة الجودة.
تم هضم أمبليكونات الجينات كاملة 16S مع RsaI. تم استخراج الحمض النووي لPCR من الحوريات المتجانسة في برنامج تلفزيوني 1x. تتوافق ممرات "G nymph" مع الحوريات الغنوتوبيوتية ، في حين تتوافق ممرات "conv nymph" مع نظيراتها التقليدية غير النجمية. استنادا إلى هضم تقييد الظاهري، و endosymbiont (Blattabacterium) ومن المتوقع أن يكون العصابات في أحجام 402 نقطة أساس، 206 نقطة أساس، و 163 نقطة أساس، مع مسحة من العصابات بين 163 نقطة أساس و 148 نقطة أساس. يجب أن تظهر الحشرة الغنوتوبيوتية نمط ربط Blattabacterium فقط. ومن المتوقع أن يكون المجتمع البكتيري المختلط مسحة من العصابات مع أحجام مختلفة، وصفت هنا "شظايا البكتيرية الأخرى 16S". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.