مقالة منهجية

توصيف الخلايا المناعية والوسطاء الالتهابيين في البيئة الرئوية

DOI:

10.3791/61359

⸱

يونيو 24, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد التغيرات في تكوين الخلايا المناعية ، وملف تعريف السيتوكين ، وملف تعريف الكيموكين في البيئة الرئوية بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر ، وهو نموذج فئران للسكتة الدماغية الإقفارية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد يتغير توسع الخلايا المناعية وتنشيطها والاتجار بها إلى الرئتين ، والتي يتم التحكم فيها عن طريق التعبير عن السيتوكينات المتعددة والكيموكينات ، بسبب إصابة الدماغ الشديدة. ويتضح ذلك من حقيقة أن الالتهاب الرئوي هو سبب رئيسي للوفيات في المرضى الذين عانوا من السكتة الدماغية الإقفارية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف استخدام التحليل الخلوي للتدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية في رئتي الفئران ، بما في ذلك البلاعم السنخية ، والبلاعم الخلالية ، والخلايا المتغصنة CD103 + أو CD11b + (DCs) ، و DCs البلازما ، والحمضات ، والخلايا الوحيدة / الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية ، والعدلات ، والخلايا التائية والبائية المشتقة من اللمفاوية ، وخلايا NK ، وخلايا NKT ، بعد تحريض السكتة الدماغية الإقفارية عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر. علاوة على ذلك ، نصف تحضير متجانسات الرئة باستخدام طريقة تجانس الخرز ، لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو كيموكينات في وقت واحد بواسطة صفائف خرز متعددة الإرسال إلى جانب التحليل الخلوي للتدفق. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة المناعية الرئوية في بيئات الأمراض الأخرى ، مثل أمراض الرئة المعدية أو أمراض الحساسية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرئتين هي عضو حاجز ، يتعرض للبيئة الخارجية ، وبالتالي ، يتلقى باستمرار تحديات مناعية مثل مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية1. مطلوب تنشيط الخلايا المناعية المقيمة في الرئة وتسلل الخلايا المناعية من المحيط لإزالة مسببات الأمراض من البيئة الرئوية. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ الخلايا المناعية المقيمة في الرئة على التسامح مع البكتيريا المصاحبة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تلعب دورا في إزالة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن1. البلاعم السنخية والخلالية هي من بين الخلايا المناعية الخافرة المقيمة في الرئة التي تستشعر مسببات الأمراض عبر مستقبلات التعرف على الأنماط وتزيل هذه مسببات الأمراض عن طريق البلعمة2. تربط الخلايا المتغصنة المقيمة في الرئة الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية من خلال عرض المستضد3. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج الخلايا المناعية الفطرية المحلية المنشطة السيتوكينات والكيموكينات التي تضخم الاستجابة الالتهابية وتحفز تسلل الخلايا المناعية مثل الخلايا الوحيدة والعدلات والخلايا الليمفاوية إلى الرئتين1. وقد ثبت أن السكتة الدماغية الإقفارية تعدل المناعة الجهازية وتؤدي إلى زيادة القابلية للإصابة بالعدوى الرئوية. ومع ذلك ، فقد قامت دراسات قليلة بتقييم المقصورة الرئوية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، على الرغم من أن بعض الدراسات فحصتها خلال الظروف الالتهابية4،5،6،7،8،9. الهدف من الطرق الموضحة هنا هو تحديد أمراض الرئة وتكوين الخلايا المناعية ومستويات تعبير السيتوكين والكيموكين في الرئتين في وقت واحد لتقييم التغييرات في المقصورة الرئوية وتقييم التغييرات المحتملة في الاستجابة المناعية الرئوية بعد نوبة نقص التروية.

الموصوف هنا هو بروتوكول للحصول على تعليق خلية واحدة من رئتي الفئران لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية. يعتمد هذا البروتوكول على هضم الأنسجة باستخدام الكولاجيناز D دون الحاجة إلى جهاز فصل الأنسجة الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لإعداد متجانسات الأنسجة التي يمكن استخدامها لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو chemokines باستخدام صفائف الخرز متعددة الإرسال القائمة على قياس التدفق الخلوي. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للتحقيق في آثار السكتة الدماغية الإقفارية على المناعة الرئوية ويمكن استخدامه في نماذج الأمراض الأخرى أيضا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات التي تم تنفيذها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة ويست فرجينيا. تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في vivarium في جامعة فرجينيا الغربية.

1. إعداد الحلول

  1. تحضير المخزن المؤقت للتروية (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS). استخدم ما يقرب من اثنين من الأليكوتات 10 مل من PBS المثلج البارد لكل ماوس.
  2. تحضير وسط خلايا الرئة / المخزن المؤقت FACS. يحتوي مخزن FACS المخزن المؤقت على PBS مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS). الحفاظ على البرد المتوسط طوال عملية استئصال الرئة ونقلها. تحضير ما يقرب من 8 مل لكل عينة رئة. قم بإعداد وسيط جديد / مخزن مؤقت FACS قبل التجارب.
  3. قم بإعداد مخزن مؤقت للتفكك لعزل خلية واحدة. يحتوي المخزن المؤقت على 1 ملغم / مل كولاجيناز D و 200 ميكروغرام / مل DNase I في محلول الملح المخزن مؤقتا من هانك (HBSS). تحضير طازجة من محلول المخزون (100 ملغ / مل كولاجيناز D و 10 ملغ / مل DNase I) قبل التجارب. هناك حاجة إلى حوالي 6 مل لكل عينة رئة. تأكد من وصول المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  4. إعداد المخزن المؤقت للتجانس لتجانس أنسجة الرئة. يحتوي Buffer على PBS و 1x بروتين وكوكتيل مثبط للفوسفاتيز (المخزون = 100x). تحضير طازج قبل التجارب. حافظ على برودة المخزن المؤقت أثناء عملية التجانس بأكملها. ما يقرب من 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت يكفي لتجانس فص أيمن واحد من الرئتين.

2. انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر (tMCAO)

ملاحظة: تم توثيق إجراءات tMCAO عن طريق إدخال خيوط أحادية إلى الشريان الدماغي الأوسط بالتفصيل سابقا10. في هذه التجارب ، تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا ، والتي تزن 25-30 جم.

  1. باختصار ، قم بإعطاء 2 مغ / كغ من الميلوكسيكام تحت الجلد للفئران قبل الجراحة. تخدير الفئران بعمق في غرفة الحث باستخدام 5٪ من الأيزوفلوران. تأكد من التخدير العميق باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم. الحفاظ على التخدير مع 1-2 ٪ من الأيزوفلوران أثناء الجراحة باستخدام مخروط الأنف. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 36.5 - 38 درجة مئوية طوال الإجراء عن طريق وضع بطانية دافئة تحت الفئران. يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية بواسطة الأوتوكلاف قبل يوم من الجراحة.
  2. حلق وتحضير الجلد على الرقبة البطنية باستخدام 70٪ من الإيثانول متبوعا بفرك الكلورهيكسيدين. إدارة تحت الجلد 2 مغ / كغ بوبيفاكايين على منطقة شق قبل إجراء الشق الأول. استخدم مرهم العين لتغطية العينين لمنع الجفاف. قم بعمل شق في خط الوسط في الرقبة. اسحب الأنسجة الرخوة جانبا بلطف حول القصبة الهوائية.
  3. تحديد الشريان السباتي المشترك الأيسر والشريان السباتي الخارجي.
  4. ضع خياطة مؤقتة (بحجم 6/0) على الشريان السباتي المشترك لوقف تدفق الدم. قم بعمل شق في الشريان السباتي الخارجي.
  5. أدخل خيطا أحاديا مغلفا بالمطاط السيليكوني (حجم 6-0) في الشريان السباتي الخارجي ، ثم تقدم الخيوط الأحادية إلى الشريان الدماغي الأوسط. اترك الخيط الأحادي في الشريان الدماغي الأوسط لمدة 60 دقيقة (انسداد).
  6. راقب معدل تدفق الدم باستخدام قياس تدفق دوبلر بالليزر. يشير انخفاض معدل التدفق إلى الشريان الدماغي الأوسط الذي يبلغ > 80٪ إلى نجاح الانسداد.
  7. بعد 60 دقيقة من الانسداد ، قم بإزالة الخيوط الأحادية للسماح بحدوث التروية. أغلق الشق.
  8. في الفئران التي تعمل بالصورية ، قم بتنفيذ الخطوات 2.1-2.6 دون إدخال الخيوط الأحادية. في هذه الفئران ، يجب أن يظل معدل تدفق الدم ثابتا خلال الإجراء بأكمله.
  9. راقب الفئران يوميا وقياس العجز العصبي باستخدام معايير التسجيل القياسية11. 0 – لا يوجد عجز عصبي; 1 – يتراجع عن مقدمة الطرف المقابل عند رفعه بواسطة الذيل ؛ 2- دوائر إلى المقابل عند رفعها بواسطة الذيل ؛ 3- السقوط على النقيض أثناء المشي. 4- لا يمشي تلقائيا أو في غيبوبة. 5- ميت.
  10. توفير الحقن تحت الجلد من محلول ملحي طبيعي ومسكن (ميلوكسيكام، 2 مغ/كغ) كل 24 ساعة لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
  11. اعزل الرئتين 24 و 72 ساعة بعد tMCAO لتحليل المصب.

3. حصاد أنسجة الرئة

  1. تخدير عميق للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p) من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من الزيلازين. تأكد من التخدير العميق باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم.
  2. لأداء تروية الجسم كله عبر القلب12 ، قم بتثبيت الماوس على المنصة الجراحية والفراء الرطب بالإيثانول بنسبة 70٪ لتقليل توزيع الفراء في تجويف الجسم. استخدم مقص التشريح الدقيق لإجراء شق عرضي في البطن الذيلي ثم شق خط الوسط في الصفاق ، والتوقف عند التجويف الصدري قبل ثقب الحجاب الحاجز.
    1. لا تقطع العضلات / تختبئ في التجويف البريتوني ولا تستمر في شق البطن الماضي.
  3. أوقف الشق بمجرد الوصول إلى التجويف الصدري قبل ثقب الحجاب الحاجز. الحرص على عدم إتلاف القلب والرئتين مما قد يضر بجودة التروية أو استعادة الخلايا
  4. باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بعمل شق في خط الوسط للصفاق يتوقف عند التجويف الصدري قبل ثقب الحجاب الحاجز.
  5. أمسك الفأر من الطرف البعيد من القص باستخدام الملقط وارفعه لأعلى أثناء قطع الحجاب الحاجز للتأكد من عدم إتلاف القلب أو الرئتين أو الأوعية الدموية. بمجرد أن تصبح الأعضاء مرئية ، قم بعمل شق عبر القفص الصدري وفصل وتثبيت علبة الضلع بحيث يتعرض القلب والرئتين بالكامل.
  6. قم بعمل شق صغير بعناية في الأذين الأيمن بالقرب من قوس الأبهر. سيكون هذا بمثابة تدفق للتروية.
  7. بعد ذلك مباشرة ، أدخل بلطف إبرة 25 جم × 5/8 متصلة بحقنة مملوءة ب 10 مل من PBS البارد في السطح العلوي البعيد للبطين الأيسر. احرص على عدم إدخال الحاجز البطيني عبر البطين الأيمن. يجب إدخال الإبرة بالكاد في البطين الأيسر.
    ملاحظة: إذا تم ثقب الحاجز البطيني ، فسوف يندفع السائل من أنف الماوس. هذا سوف يقلل من جودة التروية ويؤدي إلى فقدان الخلايا.
  8. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام المشبك لتثبيت الإبرة بشكل آمن في مكانها في البطين الأيسر أثناء التروية.
  9. ادفع بثبات ولكن بلطف 10 مل من PBS البارد إلى القلب. يجب أن تبدأ أنسجة الفأر في التسرب وإزالة الدم عند خروج السائل من الأذين الأيمن.
    1. ادفع أليكوت ثان من 10 مل من PBS حتى يحدث تطهير دم كاف. سيكون للكبد مظهر بني فاتح وستنتقل الرئتين من اللون الوردي المحمر إلى اللون الأبيض في الغالب.
  10. باستخدام الملقط ومقص التشريح الدقيق ، قم بإزالة جميع الأنسجة المحيطة بعناية بما في ذلك القلب والقصبة الهوائية والمريء والغدة الصعترية والنسيج الضام والغدد الليمفاوية والشعب الهوائية الكبيرة.
  11. افصل فصوص الرئة الفردية وضع الفصوص في طبق بتري على الجليد يحتوي على 1-2 مل من وسط خلايا الرئة الباردة.

4. تجانس أنسجة الرئة لمصفوفات الخرز متعددة الإرسال باستخدام مجانس الخرز

  1. قم بتبريد أنبوب غطاء لولبي مخروطي سعة 2 مل يحتوي على 3 حبات زركونيا / سيليكا معقمة مقاس 2.3 مم. أضف 200 ميكرولتر من مخزن التجانس البارد إلى الأنبوب.
  2. وزن الفص ، ونقل الفص إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا يحتوي على الخرز والمخزن المؤقت للتجانس.
    ملاحظة: ما يقرب من 50-100 ملغ من الأنسجة المتجانسة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ستكون كافية للكشف عن تعبير السيتوكين والكيموكين في العينة.
    1. قم بتجانس الفص باستخدام مجانس قائم على الخرز (انظر جدول المواد) عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
    2. تأكد من أن الأنسجة متجانسة تماما. زيادة الوقت إذا لزم الأمر.
  3. بعد التجانس ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي صغير مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) عند 15,870 × g لمدة 3 دقائق.
  4. انقل المواد الفائقة إلى أنبوب دقيق 1.5 مل مبرد مسبقا.
  5. ضع العينة مباشرة على الجليد للاستخدام الفوري أو قم بتخزين العينة عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة.

5. تفكك أنسجة الرئة وعزل خلية واحدة

  1. صب وسط خلايا الرئة ، من فصوص الرئة المتبقية لتجنب تخفيف العازلة للانفصال. ثم ، أدخل بعناية حقنة 1 مل مع إبرة 25G و 5/8 تحتوي على 1 مل من العازل الانفصالي في أنسجة الرئة.
  2. حقن أجزاء صغيرة (حوالي 1/4عشر إلى 1/5ث) من العازلة التفكك في كل فص الرئة وتضخيم بلطف.
    ملاحظة: معظم المخزن المؤقت سوف يندفع بعد فترة وجيزة من النفخ حيث تم استئصال الفص.
  3. كرر حقن المخزن المؤقت للتفكك 1-2x.
  4. احتضن فصوص الرئة باستخدام عازل للتفكك لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بفرم فصوص الرئة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص تشريح ناعم.
  6. انقل قطع الرئة المفرومة باستخدام العازل للتفكك إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.  تكملة مع العازلة تفكك إضافية إلى ما مجموعه 6 مل. دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة.
  7. احتضن العينة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. دوامة بقوة كل 7-8 دقائق.
  8. بعد 45 دقيقة من الحضانة ، دوامة العينة بقوة لمدة 1 دقيقة للحصول على أفضل النتائج.
  9. قم بفصل العينة عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة الأنسجة الضامة المتبقية وغير المرغوب فيها والخلالية.
  10. الطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق في 380 × غرام ، وتجاهل supernatant.
  11. أضف 5 مل من وسط خلايا الرئة الباردة إلى العينة. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق دوامة لطيفة.
  12. الطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق في 380 × غرام ، وتجاهل supernatant.
  13. أضف 1 مل من وسط خلايا الرئة الباردة. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق دوامة لطيفة.
  14. تمر عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، وتحسب الخلايا.

6. تحليل التدفق الخلوي لمكانة الخلايا المناعية الرئوية

  1. البذور 1-2 × 106 خلايا / جسم مضاد مجموعة في 96 لوحة سفلية مستديرة جيدا (3 مجموعات في المجموع). الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  2. أعد تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من PBS البارد الذي يحتوي على بقعة حية / ميتة قابلة للإصلاح. تحضير البقعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  4. أعد تعليق حبيبة الخلية مع 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS الذي يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة المضادة للفأر CD16/32. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  5. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS الذي يحتوي على مجموعات الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1 إلى الخلايا. اخلطيه عن طريق السحب اللطيف.
    ملاحظة: الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت FACS لتلطيخ الأجسام المضادة هو 50 ميكرولتر. لذلك ، عند إعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة في 25 ميكرولتر ، يجب أن يكون تركيز الأجسام المضادة ضعف التركيز النهائي.
  6. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  7. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  8. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. نقل إلى البوليسترين مستديرة القاع 5 مل أنبوب FACS يحتوي على 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACs إضافية. قم بتحليل العينة على الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يسمح تثبيت الخلايا باستخدام الخطوات التالية بتحليل العينات لاحقا.
  9. بعد الخطوة 6.7.، أعد تعليق العينة مع 100 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالديهايد في PBS.
  10. احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  11. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 830 × غرام. تخلص من السوبرناتونات.
  12. أعد تعليق الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد. تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء. تحليل العينة في غضون 72 ساعة.

7. صفائف حبة متعددة الإرسال للكشف عن السيتوكين والكيموكين

ملاحظة: تم استخدام ألواح الكيموكين متعددة الإرسال والتهاب الالتهاب المتاحة تجاريا لتحديد تعبير الكيموكينات والسيتوكينات في الرئتين بعد تحريض tMCAO وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، والذي تم وصفه بالتفصيل13.

  1. باختصار ، قم بإذابة التحليلات على الجليد إذا تم تخزينها عند -80 درجة مئوية بعد تجانس الأنسجة. قم بالطرد المركزي للعينة عند 590 × g لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام لإزالة أي أنسجة متبقية.
  2. قم بإنشاء منحنى قياسي عن طريق التخفيف المتسلسل للكوكتيل القياسي (C7) الذي يكون بتركيز معروف يبلغ 10 نانوغرام / مل إلى 7 معايير (C1-6) مع المعيار الأخير هو المخزن المؤقت للمقايسة وحده (C0).
  3. بمجرد ارتفاع درجة حرارة جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 25 ميكرولتر من كل معيار و 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى لوحة بئر V أسفل 96.
  4. إلى كل عينة بشكل جيد ، أضف 25 ميكرولتر من تجانس الرئة (تحليل) و 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى لوحة بئر V السفلية 96
  5. دوامة الخرز المطلي مسبقا بقوة ، ثم إضافة 25 ميكرولتر من الخرز المطلي مسبقا إلى كل من الآبار القياسية والعينة.
  6. أغلق اللوحة واحميها من الضوء عن طريق تغطيتها بورق القصدير. هز اللوحة عند 110 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 230 × جم لمدة 5 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل عند 1x (محلول المخزون هو 20x ، تمييع إلى 1x بالماء). احتضان لمدة 1 دقيقة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 230 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق المعيار والعينة بأجسام مضادة للكشف عن 25 ميكرولتر.
  9. قم بإغلاق اللوحة وتغطيتها للحماية من الضوء. رج اللوحة عند 110 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. أضف 25 ميكرولتر من الستربتافيدين فيكويريثرين (SA-PE) إلى كل معيار وعينة جيدة.
  11. قم بإغلاق اللوحة وتغطيتها للحماية من الضوء. رجه بسرعة 110 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. قم بتدوير اللوحة على 230 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق المعيار والعينات في مخزن مؤقت للغسيل بمعدل 1x.
  13. انقل إلى أنبوب FACS من البوليسترين ذو القاع الدائري سعة 5 مل المسمى جيدا والذي يحتوي على 150 ميكرولتر إضافية من مخزن مؤقت للغسيل 1x.
  14. تحديد شدة تألق إشارة PE للمعايير والعينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
  15. قم ببناء منحنى قياسي لكل كيموكاين وسيتوكين باستخدام متوسط كثافة التألق (MFI) ل PE مقابل التركيزات المحددة مسبقا.
  16. أوجد تركيز كل كيموكين وسيتوكين باستخدام المنحنى القياسي ومؤشر MFI من كل عينة. توفر لوحة الإرسال المتعدد برنامج تحليل البيانات الذي يمكن استخدامه لتحديد تركيز كل تحليل. يستخدم وزن الفص القمي / العلوي لتحديد تركيز السيتوكينات أو الكيموكين لكل ملليغرام من الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أبلغنا مؤخرا أن تحريض السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران يغير تكوين الخلايا المناعية للرئتين11. على وجه التحديد ، زاد نقص التروية الدماغية العابرة من النسب المئوية للبلاعم السنخية ، والعدلات ، و CD11b + DCs ، مع تقليل النسب المئوية للخلايا التائية CD4 + ، والخلايا التائية CD8 + ، والخلايا البائية ، وخلايا NK ، والحمضات في المقصورة الرئوية. علاوة على ذلك ، يتوافق التغيير الخلوي مع مستويات متناقصة بشكل كبير من الكيموكينات المتعددة في الرئتين. الموصوفة هنا هي طريقة لعزل وتحديد مجموعات الخلايا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح البروتوكولات الموصوفة هنا بتحديد أنواع الخلايا المناعية الرئوية والتعبير عن الكيموكينات أو السيتوكينات في نفس الماوس. إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء دراسة لأمراض الأنسجة ، فيمكن إزالة الفص الفردي وتثبيته لهذا الغرض قبل المتابعة إلى خطوات عزل الخلية الواحدة. أحد القيود على هذه الطريقة هو أن هذا النهج قد لا يكون مناسبا في بعض بيئات المرض إذا كان من المتوقع أن يكون التغيير في تكوين الخلايا المناعية والتعبير عن الكيموكينات و / أو السيتوكينات موزعا بشكل غير متساو بين الفصوص المختلفة للرئتين. على سبيل المثال ، تظهر بعض البك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة P20 GM109098 وبرنامج جائزة الابتكار من Praespero إلى Edwin Wan. تم إجراء تجارب قياس التدفق الخلوي في منشأة WVU Flow Cytometry & Single Cell Core ، والتي تدعمها منح المعاهد الوطنية للصحة S10 OD016165 و U57 GM104942 و P30 GM103488 و P20 GM103434.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
B220-APC ، استنساخ RA3-6B2Biolegend1032121: 200 تخفيف
Beadbug 3 موضع الخالط الخرزةالمعياري ScientificD1030مخالط الأنسجة
CCR2-BV421 ، استنساخ SA203G11Biolegend1506051: 200 تخفيف
CD103-BV421 ، استنساخ 2E7Biolegend1214221: 200 تخفيف
CD11b-PE / Cy7 ، استنساخ M1 / 70Biolegend1012161: 400 تخفيف
CD11c-PE / Cy7 ، استنساخ N418Biolegend1173181: 200 تخفيف
CD11c-Percp / Cy5.5 ، استنساخ N418Biolegend1173281: 200
CD4-BV421 ، استنساخ GK1.5Biolegend1004431: 200
CD45-FITC ، استنساخ 30-F11Biolegend1031081: 200 التخفيف
CD64-APC ، استنساخ X54-5 / 7.1Biolegend1393061: 200 تخفيف
CD8-PE ، استنساخ 53-6.7Biolegend1007081: 800 تخفيف
كولاجيناز Dسيجما ألدريتش11088882001مكون في المخزن المؤقت للتفكك
أنبوب غطاء لولبي مخروطيThermoFisher02-681-344أنبوب لتجانس الأنسجة
DNase ISigma Aldrich10104159001مكون في المخزن المؤقت للتفكك
Fc الجسم المضاد Biolegend1013201: 100 التخفيف
genlteMACS dissociatorMiltenyi Biotec130-093-235هضم الرئة مع أو بدون مفكك ميكانيكي
لطيف أنابيب MACS C MiltenyiBiotec130-093-237أنبوب لتفكك الأنسجة باستخدام dissociator genlteMACS
وقف البروتياز ومثبط الفوسفاتيزThermoFisher78442مكون في عازلة التجانس
مراقب دوبلر بالليزرMoorMOORVMS-LDFمراقبة تدفق الدم أثناء لوحة الكيموكين المسببة للالتهابات من tMCAO
LEGENDplexBiolegend740451مجموعة حبات متعددة
الإرسال LIVE / DEAD قابلة للإصلاح بالقرب من الأشعة تحتThermoFisherL34976استخدم لاستبعاد الخلايا الميتة أثناء تحليل قياس التدفق
الخلوي Ly6C-PE ، استنساخ HK1.4Biolegend1280081: 800 تخفيف
Ly6G-BV510 ، استنساخ 1A8Biolegend1276331: 200
خياطة MCAO L56 قابلة لإعادة الاستخدام 6-0 متوسطةDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510 ، استنساخ M5 / 114.15.2Biolegend107636تخفيف 1: 800
NK1.1-Percp / Cy5.5 ، استنساخ PK136Biolegend1087281: 200 تخفيف
Siglec F-PE ، استنساخ E50-2440BD Biosciences5521261: 200 تخفيف
خيط خياطة الحرير ، مقاس 6/0أدوات العلوم الدقيقة18020-60نظام تخدير tMCAO
SomnoSuiteKent ScientificSS-01تخدير الفأر ل tMCAO
TCRb-BV510 ، استنساخ H57-897Biolegend1092341: 200 تخفيف
حبات الزركونيا / السيليكا ، 2.3 ممBiospec11079125zالخرز لتجانس الأنسجة
تخفيف تخفيف كتلة مقارنة الحمراء تخفيف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777(2018).
  3. Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  4. Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
  5. Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
  6. McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051(2017).
  7. Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
  8. Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853(2019).
  9. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038(2012).
  11. Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440(2017).
  14. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  15. Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779(2019).
  16. Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757(2019).
  17. Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
  18. Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
  19. Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
  20. Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
  21. Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73(2017).
  22. Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
  23. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Immune Cell AnalysisFlow CytometryLung Homogenate PreparationMultiplex Bead ArrayCytokine Chemokine DetectionIschemic Stroke ModelMiddle Cerebral Artery OcclusionAlveolar MacrophagesInterstitial MacrophagesDendritic Cells

مقالات ذات صلة