توصيف الخلايا المناعية والوسطاء الالتهابيين في البيئة الرئوية

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد التغيرات في تكوين الخلايا المناعية ، وملف تعريف السيتوكين ، وملف تعريف الكيموكين في البيئة الرئوية بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر ، وهو نموذج فئران للسكتة الدماغية الإقفارية.

Abstract

قد يتغير توسع الخلايا المناعية وتنشيطها والاتجار بها إلى الرئتين ، والتي يتم التحكم فيها عن طريق التعبير عن السيتوكينات المتعددة والكيموكينات ، بسبب إصابة الدماغ الشديدة. ويتضح ذلك من حقيقة أن الالتهاب الرئوي هو سبب رئيسي للوفيات في المرضى الذين عانوا من السكتة الدماغية الإقفارية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف استخدام التحليل الخلوي للتدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية في رئتي الفئران ، بما في ذلك البلاعم السنخية ، والبلاعم الخلالية ، والخلايا المتغصنة CD103 + أو CD11b + (DCs) ، و DCs البلازما ، والحمضات ، والخلايا الوحيدة / الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية ، والعدلات ، والخلايا التائية والبائية المشتقة من اللمفاوية ، وخلايا NK ، وخلايا NKT ، بعد تحريض السكتة الدماغية الإقفارية عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر. علاوة على ذلك ، نصف تحضير متجانسات الرئة باستخدام طريقة تجانس الخرز ، لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو كيموكينات في وقت واحد بواسطة صفائف خرز متعددة الإرسال إلى جانب التحليل الخلوي للتدفق. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة المناعية الرئوية في بيئات الأمراض الأخرى ، مثل أمراض الرئة المعدية أو أمراض الحساسية.

Introduction

الرئتين هي عضو حاجز ، يتعرض للبيئة الخارجية ، وبالتالي ، يتلقى باستمرار تحديات مناعية مثل مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية¹. مطلوب تنشيط الخلايا المناعية المقيمة في الرئة وتسلل الخلايا المناعية من المحيط لإزالة مسببات الأمراض من البيئة الرئوية. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ الخلايا المناعية المقيمة في الرئة على التسامح مع البكتيريا المصاحبة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تلعب دورا في إزالة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن¹. البلاعم السنخية والخلالية هي من بين الخلايا المناعية الخافرة المقيمة في الرئة التي تستشعر مسببات الأمراض عبر مستقبلات التعرف على الأنماط وتزيل هذه مسببات الأمراض عن طريق البلعمة^2<....

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات التي تم تنفيذها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة ويست فرجينيا. تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في vivarium في جامعة فرجينيا الغربية.

1. إعداد الحلول

1. تحضير المخزن المؤقت للتروية (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS). استخدم ما يقرب من اثنين من الأليكوتات 10 مل من PBS المثلج البارد لكل ماوس.
2. تحضير وسط خلايا الرئة / المخزن المؤقت FACS. يحتوي مخزن FACS المخزن المؤقت على PBS مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS). الحفاظ على البرد المتوسط طوال عملية استئصال الرئة ونقلها. تحضير ما يقرب من 8 مل لكل عينة رئة. قم بإعداد وسيط جديد / مخزن مؤقت FA....

Results

لقد أبلغنا مؤخرا أن تحريض السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران يغير تكوين الخلايا المناعية للرئتين¹¹. على وجه التحديد ، زاد نقص التروية الدماغية العابرة من النسب المئوية للبلاعم السنخية ، والعدلات ، و CD11b + DCs ، مع تقليل النسب المئوية للخلايا التائية CD4 + ، والخلايا التائية CD8 + ، والخلايا البائية ، وخلايا NK ، والحمضات في المقصورة الرئوية. علاوة على ذلك ، يتوافق التغيير الخلوي مع مستويات متناقصة بشكل كبير من الكيموكينات المتعددة في الرئتين. الموصوفة هنا هي طريقة لعزل وتحديد مجموعات الخلايا ا.......

Discussion

تسمح البروتوكولات الموصوفة هنا بتحديد أنواع الخلايا المناعية الرئوية والتعبير عن الكيموكينات أو السيتوكينات في نفس الماوس. إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء دراسة لأمراض الأنسجة ، فيمكن إزالة الفص الفردي وتثبيته لهذا الغرض قبل المتابعة إلى خطوات عزل الخلية الواحدة. أحد القيود على هذه الطريقة هو أن هذا النهج قد لا يكون مناسبا في بعض بيئات المرض إذا كان من المتوقع أن يكون التغيير في تكوين الخلايا المناعية والتعبير عن الكيموكينات و / أو السيتوكينات موزعا بشكل غير متساو بين الفصوص المختلفة للرئتين. على سبيل المثال ، تظهر بعض البك.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC ، استنساخ RA3-6B2	Biolegend	103212	1: 200 تخفيف
Beadbug 3 موضع الخالط الخرزة	المعياري Scientific	D1030	مخالط الأنسجة
CCR2-BV421 ، استنساخ SA203G11	Biolegend	150605	1: 200 تخفيف
CD103-BV421 ، استنساخ 2E7	Biolegend	121422	1: 200 تخفيف
CD11b-PE / Cy7 ، استنساخ M1 / 70	Biolegend	101216	1: 400 تخفيف
CD11c-PE / Cy7 ، استنساخ N418	Biolegend	117318	1: 200 تخفيف
CD11c-Percp / Cy5.5 ، استنساخ N418	Biolegend	117328	1: 200
CD4-BV421 ، استنساخ GK1.5	Biolegend	100443	1: 200
CD45-FITC ، استنساخ 30-F11	Biolegend	103108	1: 200 التخفيف
CD64-APC ، استنساخ X54-5 / 7.1	Biolegend	139306	1: 200 تخفيف
CD8-PE ، استنساخ 53-6.7	Biolegend	100708	1: 800 تخفيف
كولاجيناز D	سيجما ألدريتش	11088882001	مكون في المخزن المؤقت للتفكك
أنبوب غطاء لولبي مخروطي	ThermoFisher	02-681-344	أنبوب لتجانس الأنسجة
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001	مكون في المخزن المؤقت للتفكك
Fc الجسم المضاد Biolegend		101320	1: 100 التخفيف
genlteMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	هضم الرئة مع أو بدون مفكك ميكانيكي
لطيف أنابيب MACS C Miltenyi	Biotec	130-093-237	أنبوب لتفكك الأنسجة باستخدام dissociator genlteMACS
وقف البروتياز ومثبط الفوسفاتيز	ThermoFisher	78442	مكون في عازلة التجانس
مراقب دوبلر بالليزر	Moor	MOORVMS-LDF	مراقبة تدفق الدم أثناء لوحة الكيموكين المسببة للالتهابات من tMCAO
LEGENDplex	Biolegend	740451	مجموعة حبات متعددة
الإرسال LIVE / DEAD قابلة للإصلاح بالقرب من الأشعة تحت	ThermoFisher	L34976	استخدم لاستبعاد الخلايا الميتة أثناء تحليل قياس التدفق
الخلوي Ly6C-PE ، استنساخ HK1.4	Biolegend	128008	1: 800 تخفيف
Ly6G-BV510 ، استنساخ 1A8	Biolegend	127633	1: 200
خياطة MCAO L56 قابلة لإعادة الاستخدام 6-0 متوسطة	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510 ، استنساخ M5 / 114.15.2	Biolegend	107636	تخفيف 1: 800
NK1.1-Percp / Cy5.5 ، استنساخ PK136	Biolegend	108728	1: 200 تخفيف
Siglec F-PE ، استنساخ E50-2440	BD Biosciences	552126	1: 200 تخفيف
خيط خياطة الحرير ، مقاس 6/0	أدوات العلوم الدقيقة	18020-60	نظام تخدير tMCAO
SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01	تخدير الفأر ل tMCAO
TCRb-BV510 ، استنساخ H57-897	Biolegend	109234	1: 200 تخفيف
حبات الزركونيا / السيليكا ، 2.3 مم	Biospec	11079125z	الخرز لتجانس الأنسجة