Method Article

تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية

DOI:

10.3791/61371

⸱

June 9th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , For The Kidney Precision Medicine Project
1Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 2Department of Cellular & Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 3Division of Nephrology, Department of Medicine, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Division of Pathology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل التعبير الجيني للأنسجة الكلى البشرية هو أداة هامة لفهم التوازن والأمراض في الفيزيولوجيا. زيادة دقة وعمق هذه التكنولوجيا وتوسيعها إلى مستوى الخلايا داخل الأنسجة هناك حاجة. على الرغم من أن استخدام تسلسل الحمض النووي والرنا وحيد الخلية الواحد أصبح واسع الانتشار، فإن تواقيع التعبير للخلايا التي تم الحصول عليها من تفكك الأنسجة لا تحافظ على السياق المكاني. من شأن الميكروستيكشن بالليزر (LMD) القائم على علامات فلورية محددة أن يسمح بعزل هياكل محددة ومجموعات خلايا ذات أهمية مع التعريب المعروف، مما يسمح بالحصول على توقيعات مستنسخة ذات رسوخ مكانية في أنسجة الكلى. لقد قمنا بتحسين منهجية LMD ، مسترشدة بصبغة سريعة تستند إلى الفلورانس ، لعزل خمس مقصورات متميزة داخل الكلى البشرية وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق من عينات أنسجة الكلى البشرية القيمة. كما نقدم معايير لمراقبة الجودة لتمكين تقييم مدى كفاية العينات التي تم جمعها. يُظهر سير العمل الموضح في هذه المخطوطة جدوى هذا النهج لعزل التوقيعات المستنسخة الجزئية الفرعية بثقة عالية. ويمكن أيضاً تطبيق النهج المنهجي المعروض هنا على أنواع الأنسجة الأخرى مع استبدال علامات الأجسام المضادة ذات الصلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تحسنت التطورات التكنولوجية في دراسة عينات الأنسجة فهم الحالة الصحية والمرض في مختلف الأجهزة. وقد أكدت هذه التطورات أن علم الأمراض يمكن أن تبدأ في مناطق محدودة أو في أنواع محددة من الخلايا، ولكن لها آثار هامة على الجهاز بأكمله. ولذلك ، في العصر الحالي من الطب الشخصي ، من المهم أن نفهم علم الأحياء على حد سواء الخلية والمستوى الإقليمي وليس فقط على الصعيد العالمي1. وينطبق هذا بشكل خاص على الكلى ، التي تتكون من خلايا وهياكل متخصصة مختلفة تبدأ و / أو تستجيب بشكل متمايز للإجهاد المرضي. لا يزال المرض من أنواع مختلفة من أمراض الكلى البشرية غير مفهومة جيدا. ومن ثم فإن توليد منهجية لدراسة التغيرات في التعبير الجيني في أجزاء أنبوبية محددة أو هياكل أو مناطق من التداخل في الكلى البشرية سيعزز القدرة على الكشف عن التغيرات المحددة في المنطقة التي يمكن أن تُعلم عن التسبب في المرض.

عينات خزعة الكلى البشرية هي مورد محدود وثمين. لذلك، ينبغي تحسين التقنيات استجواب transcriptomics في أنسجة الكلى إلى الاقتصاد في الأنسجة. وتشمل الطرق المتاحة لدراسة النسخ على مستوى الخلية والمستوى الإقليمي تسلسل RNA خلية واحدة (scRNaseq)، RNaseq النووية واحدة (snRNaseq)، في التهجين المكاني في الموقع، والصغرى الليزر (LMD). وهذا الأخير مناسب تماماً لعزل المناطق أو الهياكل ذات الاهتمام الدقيق داخل أقسام الأنسجة، لتسلسل الحمض النووي الريبي في المصبوتحليله 2و3و4و5. يمكن اعتماد LMD للاعتماد على تحديد أنواع أو هياكل محددة من الخلايا استنادًا إلى علامات معتمدة باستخدام التصوير القائم على الفلور أثناء التشريح.

وتشمل السمات الفريدة لتقنيات النسخ المجهرية بالليزر التي تساعد على ذلك: 1) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل، الذي يكمل تكنولوجيات الخلايا المفردة التي يتم فيها تحديد الخلايا بالتعبير وليس بالسنولوجيا؛ (2) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا المفردة؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على الخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة المكانية للخلايا والهياكل؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا الصغيرة التي يتم تحديدها باستخدامها في الهياكل المحددة؛ (2) الحفاظ على استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها تحديدها باستخدامها في 2) التكنولوجيا بإعلام ويتم إبلاغها من قبل تقنيات التصوير الأخرى لأن علامة الأجسام المضادة يحدد توقيعات التعبير؛ 3) القدرة على تحديد الهياكل حتى عندما علامات تغيير في المرض؛ 4) الكشف عن المحاضر أعرب عن انخفاض في ما يقرب من 20،000 الجينات؛ و 5) اقتصاد الأنسجة ملحوظا. التكنولوجيا قابلة للتطوير إلى خزعة الكلى مع أقل من 100 μm سمك من نواة ضرورية للحصول على ما يكفي من RNA وتمكن من استخدام الأنسجة المجمدة المؤرشفة ، والتي تتوفر عادة في مستودعات كبيرة أو المراكز الأكاديمية6.

في العمل الذي أعقب ذلك، ونحن وصف التكنولوجيا النسخ الإقليمية والجملة بالتفصيل، الأمثل مع بروتوكول تلطيخ الفلوريسينس السريعة رواية للاستخدام مع أنسجة الكلى البشرية. هذا النهج يحسن على استكشافات LMD الكلاسيكية لأنه يوفر بيانات التعبير منفصلة للفصيلات الفرعية والنيفرون بدلا من التعبير توبولونترسالية الكلي. وتشمل هذه التدابير تدابير ضمان الجودة والرقابة التي تم تنفيذها لضمان الصرامة وقابلية التكرار. ويتيح البروتوكول تصور الخلايا والمناطق ذات الأهمية، مما يؤدي إلى الحصول على RNA بشكل مرض من هذه المناطق المعزولة للسماح بتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الدراسة لاستخدامها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في جامعة إنديانا.

ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول مع أنسجة استئصال الكلى (حتى 2 سم في كل من أبعاد X و Y) المحفوظة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وتخزينها عند -80 درجة مئوية. أداء جميع الأعمال بطريقة تحد من التلوث RNA، واستخدام قفازات نظيفة يمكن التخلص منها وقناع الوجه. ضمان نظافة جميع الأسطح. المعدات التي تم تحسين هذا البروتوكول هو نظام microdissection الليزر تتميز ليزر الأشعة فوق البنفسجية نبض.

1. القاء الكرياء

  1. 1.2 μm LMD PPS-غشاء (بولي (p-p-phenylene كبريتيد) الشرائح للأشعة فوق البنفسجية (في نسيج غطاء تدفق لارينار لثقافة) لمدة 30 دقيقة، مباشرة قبل cryosectioning. تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة للانضمام الأمثل للأنسجة.
  2. تبريد التبريد إلى -20 درجة مئوية. تنظيف أسطح العمل وتثبيت شفرة قطع جديدة.
  3. ضع مربع شريحة صغيرة (تنظيفها مع RNase حل إزالة التلوث السطح) داخل غرفة التبريد لتخزين الشرائح مع الأنسجة قطع حديثا.
  4. الانضمام إلى العينة في أكتوبر إلى حامل الأنسجة والسماح لها لتكليل لبضع دقائق للوصول إلى درجة حرارة الغرفة وتعزيز التصاق بين كتلة أكتوبر وحامل. المساعدة في العملية باستخدام مستخرج حراري.
  5. قطع العينة إلى سمك 12 ميكرومتر ولصقها على الشريحة LMD المتخصصة، وذلك باستخدام محول الشريحة. تحتوي كل شريحة على قسم واحد لاستئصال الكلية لكل شريحة أو ما يصل إلى قسمين من خزعة الكلى لكل شريحة. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية بخراطيشة مجففة وداخل كيس بلاستيكي مغلق بإحكام لمنع تراكم الرطوبة الزائدة داخل مربع الشريحة.
  6. تسمية كل شريحة مع معرف عينة وتاريخ ورقم الشريحة.
  7. استخدم الشرائح مع العينات في غضون 10 أيام من التاريخ الأولي لتكرير الكرياض.

2. الليزر microdissection

  1. مباشرة قبل تلطيخ، وإعداد مزيج الأجسام المضادة (Ab-ميكس) في 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية من خلال إضافة ما يلي: 4 ميكرولتر من FITC-Phalloidin، 1.5 ميكرولتر من DAPI، 2 ميكرولتر من تام-هورسفال بروتين (THP) الأجسام المضادة مترافقة مباشرة إلى اليكسا فلور 546، 3.3 ميكرولتر من مثبط RNase، و 89.2 ميكرولتر من 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني (للوصول إلى حجم 100 ميكرولتر).
    ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة البديلة بدلاً من الأجسام المضادة THP. على سبيل المثال، يمكن استخدام 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة ميغالين/LRP2، مترافق مباشرة مع فلور اليكسا 568، لتسمية الأنابيب القريبة. يحتوي Ab-Mix على جسم مضاد LRP2 أو THP (لتصور إما أنابيب قريبة أو أطراف صاعدة سميكة، على التوالي). قد يتم التحقق من صحة الأجسام المضادة الأخرى وفقا لاحتياجات المستخدم.
  2. غسل الشريحة في الجليد البارد (-20 درجة مئوية) 100٪ الأسيتون لمدة 1 دقيقة ونقله إلى غرفة الرطوبة.
  3. غسل الجزء العلوي من الشريحة مع برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
  4. غسل الجزء العلوي من الشريحة مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
  5. تطبيق Ab-Mix لمدة 5 دقائق.
  6. غسل الجزء العلوي من الشريحة مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
  7. الهواء الجافة الشريحة لمدة 5 دقائق وتحميله على منصة قطع microdissection الليزر.
  8. تثبيت أنابيب جمع (autoclaved 0.5 مل أنابيب microcentrifuge) مناسبة لعمل PCR، التي تحتوي على 50 ميكرولتر من مخزن الاستخراج من طقم العزلة RNA.
  9. المضي قدما مع LMD. أكمل كل جلسة LMD في غضون ساعتين على الأكثر.
    1. جمع الصور قبل وما بعد LMD immunofluorescence، وذلك باستخدام كاميرا المجهر للتحقق من صحة تشريح للتباين بين المشغلين، فضلا عن أغراض المحفوظات والتدريب وتقييم الجودة للبروتوكول المنجز. من أجل الحصول على 0.5 - 1 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، مطلوب ما لا يقل عن 500،000 μm2 المساحة. وهذا يتطلب في كثير من الأحيان استخدام ما يصل إلى 8 μm 8 أجزاء سميكة μm للحصول على كمية كافية من المواد لجميع القطاعات الفرعية من الفائدة.
    2. تحديد المناطق ذات الأهمية عن طريق تلطيخ، مورفولوجيا وموقع ومكوس لهم باستخدام قوة الليزر أكبر من 40.
      ملاحظة: هنا معايير تشريح. يتم تعريف الأنبوبة القريبة بواسطة FITC-Phalloidin و LRP2 التسمية. يتم تعريف الطرف الصاعد سميكة من قبل THP وضع العلامات. يتم تعريف قناة التجميع بواسطة مورفولوجيا النووية (DAPI) وعدم وجود تلطيخ آخر. يتم تعريف الكبيبات من قبل FITC-Phalloidin ومورفولوجيا. ويعرف الخلية على أنها المنطقة بين الأنابيب الملون.
  10. الحصول على توقيع تعبير مقطعي مقطعي مجمع عن طريق لصق قسمين 12 ميكرومتر على شريحة LMD وتشريح المقاطع بأكملها في مخزن الاستخراج المؤقت.
  11. عند الانتهاء من عملية LMD، قم بإغلاق أنابيب microcentcentuge جمع ونفض الغبار بقوة لضمان أن المحتوى انتقل من الغطاء إلى أسفل الأنبوب
  12. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3000 س ز لمدة 30 s.
  13. احتضان الأنابيب في 42 درجة مئوية حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
  14. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3000 س ز لمدة 2 دقيقة.
  15. نقل عظمى إلى أنبوب 0.5 مل جديدة وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. RNA العزل

ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول عزل RNA، قمنا بتكييف بروتوكول من مجموعة العزل RNA التجارية. تم تعديل بروتوكول الشركة المصنعة لتلبية متطلبات مراقبة الجودة التي تم تعيينها للمشروع.

  1. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المشروط (CB) لكل عمود تنقية RNA (PC) وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. أجهزة الطرد المركزي جميع أجهزة الكمبيوتر لمدة 1 دقيقة في 16،000 س ز.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول (المقدمة في عدة) في الأنابيب مع عينات الأنسجة. مزيج العينات جيدا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. لا دوامة. لا الطرد المركزي.
  4. نقل الخليط إلى أجهزة الكمبيوتر مكيفة والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 × ز (لربط RNA)، اتبع بسرعة مع الطرد المركزي لمدة 30 s في 16،000 س ز (لإزالة تدفق من خلال). كرر هذه الخطوة إذا كان أكثر من 1 أنبوب مع عينات الأنسجة المتاحة لأي شريحة فرعية معينة.
  5. إضافة 100 μL من الغسيل العازل 1 (WB1) في أجهزة الكمبيوتر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 س ز.
  6. إعداد 40 ميكرولتر من DNase لكل عينة (أضف 5 ميكرولتر من DNase إلى 35 ميكرولتر من العازلة RDD). ثم إضافة 40 μL من الخليط مباشرة على غشاء الكمبيوتر واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. إضافة 40 ميكرولتر من WB1 على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 15 s في 8000 x ز.
  8. إضافة 100 μL من غسل العازلة 2 (WB2) على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8،000 س ز.
  9. إضافة 100 μL من WB2 على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16،000 س ز،تليها مباشرة من قبل الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 16،000 س ز.
  10. نقل الكمبيوتر إلى أنبوب جديد 0.5 مل.
  11. أضف 12 ميكرولتر من عازلة Elution (EB) على الغشاء واحتضان لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، فإن الحجم النهائي لجميع العينات التشريحية تجمع الأنسجة هو 12 ميكرولتر لكل جزء فرعي.
  12. الطرد المركزي العينات لمدة 1 دقيقة في 1000 س ز ثم لمدة 2 دقيقة في 16000 س ز.
  13. نقل 2 ميكرولتر إلى أنبوب جديد لتحليل Bioanalyzer (لمنع تجميد ذوبان).
  14. تخزين جميع الأنابيب في -80 درجة مئوية حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.

4. تسلسل الجيش الملكي النيبالي

  1. تقييم كل عينة، مخصصة لتسلسل، للجودة باستخدام Bioanalyzer التجارية ورقاقة مخصصة لقياس كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
  2. المعلمات التالية لمراقبة الجودة (QC) قبل الإعدادية للمكتبة وتسلسل مطلوبة: كمية من RNA أكبر من 4 نانوغرام لكميات كبيرة وأكبر من 0.5 - 1 نانوغرام لكل جزء فرعي; في المئة من النصوص أطول من 200 النيوكليوتيدات (DV200) مطلوب أن تكون أكبر من 25٪ لعينات LMD (الأمثل > 75٪).
  3. تنفيذ الإعدادية مكتبة مع إعداد مكتبة cDNA التجارية طقم إعداد مكتبة مخصصة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي المتدهورة. بالنسبة للمجموعة التجارية المذكورة في الملحق ، نقترح استخدام الخيار 2 ، الذي يتطلب الحد الأدنى من DV200 من 25 ٪ وعدم التجزئة. قد تتطلب بعض تقنيات التسلسل عتبات DV200 الحد الأدنى الأعلى ، مثل 30٪7.
  4. إضافة محولات وفهارس cDNA.
  5. تنقية المكتبات RNAseq باستخدام تكنولوجيا الخرز المغناطيسي.
  6. نضوب الريبوسومال cDNA باستخدام مجموعة إزالة rRNA التجارية قبل RNAseq مكتبة خطوة التضخيم.
  7. تنقية مكتبة RNAseq النهائي باستخدام تكنولوجيا حبة المغناطيسي في تركيز مكتبة cDNA 2 نانوغرام /ميكرولتر.
  8. تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي من 75 نقطة بريتيش بتروليوم يقترن نهاية على نظام تسلسل التجارية مع 30 مليون يقرأ / عينة للجملة و 100 مليون يقرأ / عينة لأقسام فرعية.
  9. استخدم RNA المرجعي (25 ميكروغرام) مع كل تشغيل تسلسل للسماح بالسيطرة على تأثير الدفعة. التركيز الأولي للرنا المرجعي لدينا هو 1 ميكروغرام/ميكرولتر، في حين أن التركيز النهائي المستخدم في التسلسل هو 25 نانوغرام/ميكرولتر. تشغيل الحمض النووي الريبي المرجعي كعينة منفصلة أثناء إعداد المكتبة وتشغيلها مع جميع عينات LMD في كل مرة.
  10. إجراء تحليل البيانات باستخدام تطبيق FastQC لتقييم جودة تسلسل، intergenic و القراءة الميتوكوندريا وتحديد قراءات المنسوبة إلى الجينات.
  11. استخدام المتكاملة الجينوم عارض (IGV) للمحاذاة وحافة / rbamtools لمقاييس التعبير عن النص.
  12. إزالة العينات مع أقل من 100،000 يقرأ. Quantile تطبيع يقرأ الخام في مجموعة البيانات بعد تصفية الجينات أعرب عن انخفاض في عتبة محددة من قبل المستخدم.
  13. كمّي التعبير كنسبة من الجزء الفرعي من الفائدة إلى متوسط جميع الأجزاء الفرعية الأخرى و log2-transform. ويمكن مقارنة التعبير النسبي لنفس الجين عبر الأجزاء الفرعية والعينات؛ ومع ذلك، فإنه ليس من المثالي لمقارنة التعبير النسبي بين اثنين من الجينات المختلفة بسبب الاختلافات المحتملة في التدهور عبر الجينات وأنواع الحمض النووي الريبي.
  14. إجراء تحليل للإثراء لمقارنة التعبير الجيني لمجموعة من صانعي محددة لكل شريحة فرعية من النيفرون، في حين تتم مقارنة عينات RNA المرجعية عبر دفعات. يعتبر تأثير الدُفعة ضمن انحراف معياري 1 للتعبير المتوسط مع قيمة R > 0.9 مقبولاً. مطلوب التطبيع إضافية للحصول على درجة تأثير دفعة أعلى. يمكن وضع علامة على أي تشغيل ينحرف عن تأثير الدفعة المقبول. يجب أن يكون Q30 أكبر من > 90٪ لكل تشغيل تسلسل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عينات

نقدم بيانات من تسعة زرع الكلية المرجعية (3 عينات تم الحصول عليها في جامعة إنديانا و 6 عينات تم الحصول عليها من خلال مشروع طب دقة الكلى)، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ الفلوريسين السريع لعزل أجزاء الكلى والمناطق الخلالية. تم الحصول على الأقسام المستخدمة في هذه العملية من المتبرعين بالكلى المتوفين أو استئصال الكلية الورم غير المصاب. لم يكن لدى هذه العينات أدلة مرضية للمرض كما هو متصور في وصمة H & E المأخوذة من الأقسام المتجاورة (الشكل 1A).<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LMD المستندة إلى transcriptomics هي تقنية مفيدة التي ترسي التعبير الجيني لمناطق محددة داخل الأنسجة. وقد وصفت أساس هذه التكنولوجيا وتطبيقها المحتملة في الكلى سابقا8. ومع ذلك ، فإن التحسين والتحديث وتبسيط التشريح القائم على الفلور الذي يهدف على وجه التحديد إلى تشريح الدقة العالية لتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب أقل في كل مكان. ولأن هذه المنهجية مُسَكَّمة مكانياً داخل النسيج، فإنَّ لديها القدرة على كشف علامات جديدة أو غير مقدرة في هياكل الأنسجة، لا سيما في حالات المرض. في الواقع، قد تتغير العديد ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عام: ويود المؤلفون أن يشكروا محققي مشروع طب دقة الكلى (www.kpmp.org) على دعمهم ونصائحهم الكريمة.

التمويل: وقد قدمت الدعم لهذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.)؛ المعاهد القومية للصحة/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S. ). وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي وطب أمراض الكلى (NIDDK) كلية الطب (KPMP)، (www.kpmp.org)، تحت رقم الجائزة U2CDK114886.

توافر البيانات والمواد: يتم أرشفة البيانات في التعبير الجيني Omnibus (GEO # معلقة)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أسيتونسيجما ألدريتش270725-1L
أمبير الخرزبيكمان كولترA63880
محلل حيويAgilent2100
BSAVWR0332-100G
DAPIThermoFisher62248
خرطوشة مجففةبيل آرتF42046-0000
يتم تضمين المخزن المؤقتQiagen79254
مجهر التشريح الدقيق بالليزرpakage LeicaLMD6500
Megalin / LRP2 الأجسام المضادةAbcamab76969مترافق مباشرة مع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Alexa Fluor 568
ThermoFisherAB-0350
كاميرا مجهرLeicaDFC700T
PBS ( RNAse Free)VWRK812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)ThermoFisherO7466
PicoPure RNA Isolation Kitالأنظمة الحيوية التطبيقيةKIT0204
شرائح غشاء PPS Leica11505268
qPCR المرجع البشري إجمالي الحمض النووي الريبي 25 ومايكرو ؛ زتاكارا كلونتك636690
RNA 6000 حقيقيات النوى توتال الحمض النووي الريبي بيكو رقاقةAgilent5067-1513
RNAseAway ThermoFisher7000
RNAse مثبطThermoFisherAM2696
Sequencer (HiSeq أو NovaSeq)IlluminaNA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2Takara Clontech634411
Tamm-Horsfall بروتين الأجسام المضادةR & D SystemsAF5144مترافق مباشرة مع Alexa Fluor 546
Tissue-Tek & Reg ، O.C.T. مركبساكورا4583
DNAse RDD في

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
  2. Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
  3. Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
  4. Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
  5. Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
  6. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).
  7. Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
  8. Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832(2019).
  10. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
  11. Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionHuman Kidney TissueRegional TranscriptomicsRNA SequencingImmunofluorescence StainingCryostat SectioningFluorescence based StainTubular Sub segmentsSpatial TranscriptomicsQuality Control Parameters

Related Articles