التوصيف الكمي واللثي للأكياس الظهارية الظهارية الوظيفية والمستقطبة

Summary

تعد الأنظمة الخلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) نماذج ذات صلة بالتحقيق في تكوين الأعضاء. ويقترح طريقة هيدروجيل القائم على إنتاج الخراجات الصفراوية وتوصيفها. هذا البروتوكول يكشف الحواجز من توصيف 3D، مع طريقة واضحة وموثوق بها لتقييم كفاءة تكوين الكيس، والأحجام، واختبار وظائفها.

Abstract

Cholangiocytes، الخلايا الظهارية التي تصطف القنوات الصفراوية في الكبد، والإشراف على تشكيل الصفراء وتعديلها. في السنوات العشرين الماضية، في سياق أمراض الكبد، ظهرت نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) تستند إلى cholangiocytes مثل الخراجات، الزفير، أو هياكل تشبه الأنابيب لتقليد طوبولوجيا الأنسجة لنشأة الأعضاء، والنمذجة المرض، ودراسات فحص المخدرات. وقد تم الحصول على هذه الهياكل أساسا عن طريق تضمين cholangiocytes في هيدروجيل. كان الغرض الرئيسي لدراسة التنظيم الذاتي من خلال معالجة القطبية الظهارية، والخصائص الوظيفية، والمورفولوجية. ومع ذلك، تركز دراسات قليلة جدا على كفاءة تكوين الكيس. وعندما يكون الأمر كذلك، غالباً ما يتم تحديد الكفاءة من صور طائرة واحدة. يتم إجراء التحاليل الوظيفية والتحليل الهيكلي دون تمثيل التغايرية المحتملة لتوزيع الكيسات الناشئة عن التغايرات التبليمرة الهيدروجيل والآثار الجانبية. ولذلك، لا يمكن استخدام التحليل الكمي، عند القيام به، للمقارنة من مادة إلى أخرى. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية لا تسمح بإجراء مقارنات لإمكانات النمو ثلاثية الأبعاد لمختلف المصفوفات وأنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، لا يوجد أي ذكر لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التجريبية للخراجات المثبطة للمناعة. في هذه المقالة، ونحن نقدم طريقة موثوقة وعالمية لإظهار أن توزيع الخلايا الأولية يرتبط التوزيع الرأسي غير متجانسة من تكوين كيس. يتم اتباع خلايا تشولانجيوسيكي جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل مع Z-مداخن تحليل على طول عمق هيدروجيل على مدى الوقت من 10 أيام. مع هذه الطريقة، يتم الحصول على حركية قوية من كفاءة تكوين الكيس والنمو. ونحن نقدم أيضا طرق لتقييم قطبية الكيس وظيفة وإفرازية. وأخيراً، يتم توفير نصائح إضافية لتحسين بروتوكولات الكبت المناعي من أجل الحد من انهيار الكيس للتصوير. ويمكن تطبيق هذا النهج على دراسات أخرى لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد، مما يفتح إمكانيات مقارنة نظام بآخر.

Introduction

في العقود الثلاثة الماضية، تقدم مجال البحوث في المختبر نحو نظم الثقافة 3D. وقد ظهر عدد من البروتوكولات لخلايا زراعة في 3D كما spheroids أو المجاميع في وجود أو عدم وجود سقالة / مصفوفة، في قطرة، في التحريض، في الأجهزة microfluidic، أو العائمة¹. وقد ثبت استخدام أساليب الثقافة 3D مزاياه على الثقافات 2-الأبعاد (2D)، لا سيما بالنسبة للخلايا الظهارية، والتي تبين أن التنظيم الذاتي في هياكل 3D، ودعا الخراجات أو acini. في هذه الحالة، تشكل الخلايا أحادية الطبقات تطويق التجويف، حيث الخلايا الحصول على النمط الظاهري الظهاري الكامل مع وظائف محددة الفسيولوجية المحسنة².

وقد ساهمت العديد من الدراسات في تطوير أساليب لتشكيل هذه العضيات الظهارية في المصفوفات الطبيعية. وقد سمح هذا لtuapitulate في الخلية الخلية في الجسم الحي والخلايا الدقيقة البيئة التفاعلات، للحصول على إنشاء واستقرار الظاهري الظهارية^{3،4،5،6،7}. في الآونة الأخيرة ، وعلى وجه الخصوص بهدف تطوير organoids القابلة للزراعة وفك متطلبات البيئة الدقيقة لتنظيم البرنامج الظهاري ، وقد وضعت الهيدروجيل الاصطناعية لتعزيز تشكيل acini^{ظهاري 8،9،10}. للأسف ، هذه الدراسات تقرير عن البيانات النوعية ، أو أساليب حساب الحالية باستخدام المراجع الداخلية مثل نسبة الخراجات على غير الخراجات في طائرة 2D^8،9،10. وهذا يمنع أي مقارنة بين الدراسات المختلفة من حيث الكفاءة والاستقرار، أو التوصيف المورفولوجي والفسيولوجي للعضويات الظهارية.

وقد سمح صغر حجم الخلايا الظهارية في الخرز باستخدام الأجهزة microfluidic للحصول على نتائج أكثر واقعية الكمية والمقارنة. باستخدام هذه التكنولوجيا ، تم تشكيل organoids من أنواع الخلايا المختلفة وتفاضلها على أساس مورفولوجيا بين مختلف الهياكل الخلوية 3D^11،12. ومع ذلك ، فإن هذه التكنولوجيا ليست سهلة للعمل مع وتتطلب استخدام غرف نظيفة لإنتاج الأجهزة microfluidic. وقد أنشئت هذه التكنولوجيا لبعض أنواع من الهيدروجيل ولكنها تتطلب التكيف التقني لتطبيقها على الهيدروجيل الأخرى، مما يحد من تعدد استعمالاتها. لذلك، تعتمد معظم الدراسات التي تهدف إلى تطوير العضيات الظهارية على تضمين الخلايا الظهارية في الجزء الأكبر من الهيدروجيل. في هذه الطرق ، وغالبا ما يتم إهمال التغايرية العالية للجيل structuration وتوزيع الخلايا داخل الثقافة 3D كله. ولذلك، فإن معظم التحليلات تتعلق بصور 2D واحدة، والتي تمثل فقط تقريباً توزيع الكائنات الخلوية المختلفة في وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد.

الأمراض التي تؤثر على القنوات الصفراوية، مثل cholangiocarcinoma، التنافر الصفراوي، التهاب القولون الشوكولي الأولي، من بين أمور أخرى، هي سبب رئيسي للوفيات والمراضة. باستثناء زراعة الكبد، لا توجد علاجات فعالة لهذه الحالات¹³. الجهود المبذولة للتحقيق في تكوين القناة الصفراوية، وأسباب المرض، والتقدم سوف تسمح لتطوير العلاجات الجديدة¹⁴.

وقد وضعت نماذج الهياكل المرارة من الخراجات، spheroids أو هياكل تشبه أنبوب باستخدام العادي أو المريض المستمدة، متمايزة، أو سلف المشتقة من خطوط الخلايا cholangiocyte^{15،16،17،18،19،20}. وقد لخصت دراسات مختلفة قطبية cholangiocyte, التعبير عن علامات cholangiocyte, وجود أهداب, إفراز cholangiocyte والقدرة الاستيعابية, وتشكيل تجويف وعرقلة; كل منها يمثل خصائص هامة من النمط الظاهري cholangiocyte ، مورفولوجيا ، والوظيفة^15،17،19. وأفادت آخرون الحفاظ على organoids الصاري المستمدة من المريض لفترات طويلة من الوقت²⁰. في الآونة الأخيرة، قمنا بالتحقيق في دور الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية على الخراجات الصفراوية²¹. الأهم من ذلك، تمت دراسة التسبب في الرضّاء من الزّرّية الصفراوية في الزّوئيّات الصفراوية و الأنابيب^7،22. وعلاوة على ذلك، تمت دراسة السمات الرئيسية لالتهاب الشفة الزخراب الصلاسية الأولية مثل شيخوخة cholangiocyte، إفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات، فضلا عن تجنيد الضامة بنجاح باستخدام spheroids الصفراوية^15،20. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى نماذج كمية 3D في المختبر التي تعدل من الناحية الفسيولوجية النمط الظاهري للكولينجيويت ، وعلم وظائف الأعضاء ، والبياضة الدقيقة حيث يمكن معالجة هذه الأسئلة. وعلاوة على ذلك، ذكرت المنشورات قليلة فقط تكوين الكيس كفاءة^21،23. هذه نقطة مهمة لإنشاء, لا سيما عند التحقيق في تكوين الأعضاء, سبب المرض, وارتباط الاستجابات المخدرات مع وظيفة cholangiocyte والاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، مع وجود اختلافات في سقالة / مصفوفة المستخدمة من بروتوكول إلى بروتوكول، فإنه من الصعب مقارنة بين النظم. لحل هذه القضايا، نقترح طريقة كمية وموثوقة وعالمية لتوليد الخراجات الصفراوية تحاكي تشكيل التجويف، والاستقطاب cholangiocyte، ووظيفة إفرازات cholangiocyte. الأهم من ذلك، ونحن نقدم تحليلا منهجيا على طول المحور Z عبر هلام 3D عند تقييم مع مرور الوقت، كفاءة تكوين الكيس، وحجم، ومقومات البقاء، والاستقطاب، والوظائف. وعلاوة على ذلك، استخدمنا هيدروجيل طبيعي والجرذان cholangiocytes الطبيعية (NRC) ق، كمثال للبروتوكول، ولكن غيرها من الهيدروجيلات الطبيعية أو الاصطناعية، فضلا عن الخلايا الظهارية يمكن استخدامها لتشكيل هياكل الكيسي 3D.

Protocol

1. جيل من الخراجات

ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نوع من الهيدروجيل، إذا كان الجلايشن يسمح بتضمين الخلايا.

1. هيدروجيل طلاء
   ملاحظة: طلاء هيدروجيل السليم من الشريحة الغرفة هو خطوة حاسمة لتجنب تشكيل طبقات الخلايا 2D على الجزء السفلي من البئر، التي قد تتداخل مع التصوير الكيس اللاحقة وإضعاف حساب كفاءة تكوين كيس.
   1. لضمان تجانس محلول الجل ، اذيب الهيدروجيل عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (O / N).
   2. نصائح ماصة سابقة على الجليد أو O / N في -20 درجة مئوية وشريحة غرفة 8-جيدا في -20 درجة مئوية O / N.
   3. ضع الهيدروجيل وشريحة الحجرة ذات الـ 8 بئر على دلو ثلج مليء بالثلج.
   4. في أنبوب مخروطي 15 مل، إعداد محلول يحتوي على 40٪ هيدروجيل (V/ V) في المتوسط NRC الباردة كاملة (انظر جدول المواد)ووضع الأنبوب على الجليد.
   5. لمعطف شريحة غرفة، وذلك باستخدام نصائح ماصة الباردة، إضافة 50 ميكرولتر من حل هيدروجيل على مركز كل بئر، وتنتشر على السطح كله باستخدام تلميح ماصة، في حين عقد الشريحة غرفة على الجليد (الشكل 1A).
      ملاحظة: نشر حل هيدروجيل بالتساوي ممكن تجنب فقاعات.
   6. لتبليمرة الهيدروجيل، احتضان الشريحة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية، 5٪ CO_2.
2. إعداد الخلية
   1. الاحماء NRC المتوسطة كاملة، الفوسفات المالحة المخزنة (PBS)، و تريبسين-اثيلينيدياميني حمض رباعية الحموضة (تريبسين-EDTA) في حمام مائي قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
   2. في حين أن الهيدروجيل هو البلمرة، وضمان أن تزرع NRCs إلى التقاء 70٪ في قارورة T-25 سم² الكولاجين المغلفة²¹. غسل الخلايا مرة واحدة مع ما قبل ساخنة 1X برنامج تلفزيوني.
   3. احتضان NRCs مع 5 مل من قبل ساخنة 1X PBS (ل قارورة T-25 سم²⁾ لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂.
      ملاحظة: هذه الخطوة، التي تقصر وقت الحضانة مع التربسين-EDTA هو دور فعال في الاحتفاظ بخصائص التنظيم الذاتي للخلايا.
   4. تجاهل برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من تريبسين-EDTA، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂.
   5. تحييد مع 4 مل من ما قبل ساخنة كاملة NRC المتوسطة. جمع ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل, وتدور في 150 × ز لمدة 4 دقائق.
   6. تجاهل المتوسطة وإعادة بناء بيليه الخلية في 5 مل من المتوسطة قبل ساخنة.
   7. باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر، قم بتصفية محلول الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل وفرز الخلايا.
      ملاحظة: تمرير الخلايا من خلال مصفاة هو خطوة حاسمة بالنسبة للنتائج الكمية لتكون قابلة للتكرار أي، للحصول على حجم مماثل تقريبا من مجاميع الخلية لتكون جزءا لا يتجزأ.
3. تضمين تعليق الخلية في حل الهيدروجيل
   1. إعداد حل من 1600 ميكرولتر من 80٪ هيدروجيل (V / V) في متوسطة NRC كاملة باردة (أنبوب 1); إبقاء في الجليد. تخفيف 5 × 10⁵ خلايا / مل في 1600 ميكرولتر من الباردة كاملة NRC المتوسطة (أنبوب 2) والحفاظ في الجليد.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب البلمرة من الهيدروجيل في حين خلطه مع تعليق الخلية والحفاظ على صلاحية الخلية.
   2. لإعداد محلول بذر الخلايا من 2.5 × 10⁵ خلايا / مل في 40٪ هيدروجيل (V / V)، مزيج أنبوب 1 والأنابيب 2. إضافة 400 μL من حل الخلية في كل بئر من شريحة غرفة الهيدروجيل المغلفة تجنب فقاعات (الشكل 1B).
   3. الحفاظ على الشريحة الغرفة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ حتى تغيير وسائل الإعلام.
   4. بعد 2 أيام في الثقافة، وإزالة 250 ميكرولتر من المتوسط من زاوية كل بئر، يجب الحرص على عدم الماصات من الهيدروجيل. ثم، ببطء إضافة 250 ميكرولتر من الوسط ثقافة. تغيير الوسط كل 2 أيام.
      ملاحظة: تقليل حركة الشريحة الغرفة، لا سيما أثناء بدء الكيس.

2. كمية الكيس

1. تصوير الكيس
   ملاحظة: يجب تنفيذ هذا القسم بسرعة لعدم المساس بصلاحية الخلية إذا لم يتم تجهيز المجهر بغرفة تدفئة للتحكم في CO₂ ودرجة الحرارة. من أجل ضمان القياس الكمي متسقة، ممثل توزيع الكيس في حجم هيدروجيل الكامل، يتم تصوير الخراجات عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة والتصوير التسلسلي (Z-المكدسات)، مع معلمات محددة مسبقا في جميع أنحاء نقاط زمنية مختلفة.
   1. اتخاذ Z- المكدس على طول عمق هيدروجيل لكل نقطة زمنية (الشكل 1C، D). في هذا المثال، يتم أخذ مكدسات Z في أيام 1 و 2 و 4 و 7 و 10.
      ملاحظة: تحقق من أن توزيع الخلايا الأولي موحد في الهيدروجيل لضمان إمكانية تطبيق هذه الطريقة.
      1. مع المجهر المرحلة النقيض مجهزة برنامج اقتناء صورة، حدد التكبير الهدف 10x في نافذة لوحة الأنف القطعة اليدوية(الشكل 2B (1)).
      2. قم بتشغيل المصباح الأبيض وحدد خيار التصوير في الحقل الساطع.
      3. قم بتشغيل الكاميرا عن طريق تحديد الزر"تشغيل"في القائمة الفرعية للشريط. التركيز على حقل من الخراجات وتعيين وقت التعرض(الشكل 2B (2)). فتح نافذة مجلد التقاط السيارات لحفظ تلقائي للصور ( الشكل2B (3)).
      4. فتح نافذة التقاط سلسلة Z وتحديد مع المسمار Z الطائرات العلوية والسفلى من المكدس Z (نفس إحداثيات س ص ولكن Z مختلفة فرزها). ضبط الخطوة Z اعتمادا على الهدف، ومستوى القرار واضغط على زر "تشغيل الآن" لإطلاق اقتناء(الشكل 2B (4)).
         ملاحظة: في هذا المثال، تنتشر الخراجات على سمك هيدروجيل 520 ميكرومتر. يتم الحصول على 26 صورة على طول عمق الهيدروجيل مع فاصل زمني 20 ميكرومتر Z-الخطوة. اعتمادا على الهدف، ينبغي تعديل الخطوة Z لعدم تفويت أي كيس وضمان الكشف عن الخلايا والمجاميع واحدة.
      5. خذ على الأقل 3 غير متداخلة Z- مكدسات في بئر.
         ملاحظة: هذه العينات ضرورية عندما، كما هو الحال في هذا المثال، الخراجات هي أكثر عددا في عمق الجل من على حواف بسبب عدم التجانس في البلمرة هيدروجيل.
      6. لكي يكون هناك مجموعة بيانات تمثيلية كرر الخطوة 2.1.1.5. ل3 آبار في المجموع.
         ملاحظة: التوزيع غير المتجانس للخراجات يعتمد على نوع الهيدروجيل، البلمرة، وخط الخلية. النظر في ثلاث اكوادس Z في البئر وثلاثة آبار لكل تجربة، وصورت ما لا يقل عن 200 الخراجات أكثر من تسعة Z-رصة لتوصيف تشكيل الكيس ونمو الكيس في كل نقطة زمنية.
2. معالجة الصور
   ملاحظة: في الهيدروجيل، يمكن العثور على NRCs كخلايا مفردة أو كيسات أو مجاميع. يتم تحديد الخراجات من خلال وجود قذيفة خلية مستديرة ورقيقة مغايرة تحيط بالتجويف ، في حين أن مجاميع الخلايا تقدم شكلًا غير منتظم وليس لديك تجويف. المجاميع والخلايا المفردة لها مظهر كثيف ومتناقض (الشكل 3B (4)).
   1. افتح برنامج فيجي، افتح مكدس Z ثم انتقل إلى قائمة فيجي وانقر فوق ملف | فتح (الشكلالتكميلي 1). حدد المكدس Z لتحليل. إذا لزم الأمر، حدد"التكديس الظاهري"الخيار وانقر فوق "نعم" لفتح (الشكل 3A (1)).
   2. تكرار المكدس عبر صورة | مكررة. انقر على مربع "كومة مكررة" وانقر فوق "موافق" ( الرقمالتكميلي 2).
      ملاحظة: في هذا المثال، مكدسات Z في تنسيق ملف .nd2 مرمزة في 16 بت.
   3. إنشاء إسقاط كثافة الحد أدنى من المكدس المكرر. اذهب إلى قائمة الصور | مداخن | Z المشروع. حدد نوع الإسقاط "الحد الأدنى كثافة" وانقر فوق "موافق" (الشكل 3A (2)) (الشكل التكميلي 3).
   4. اطرح الخلفية من الإسقاط. انتقل إلى قائمة المعالجة | طرح الخلفية. نوع 500.0 بكسل من نصف قطر الكرة المتداول وانقر فوق "خلفية الضوء" لتقديم الخراجات أكثر تناقضا من الخلفية (الشكل 3A (3)) (الشكل التكميلي 4).
      ملاحظة: نصف قطر الكرة المتداولة يحدد حجم المنطقة التي يتم تشغيل الطرح الخلفية. يجب تعيين هذه المعلمة إلى حجم الكائن الأكبر لتعريف.
   5. إذا كان هناك حاجة إلى تحسين التباين، انتقل إلى قائمة الصور | ضبط | سطوع / تباين | تلقائي | تطبيق. سوف فيجي تلقائيا تحسين السطوع والتباين. في (الشكل 3A (3)، تم تعيين القيم الرمادية السفلية والعليا إلى 49702 و 65452 على التوالي (الشكل التكميلي 5).
      ملاحظة: إذا لم يتم معايرة الإسقاط، انتقل إلى قائمة تحليل | تعيين مقياس واكتب نسبة المعايرة المطابقة μm/pixel(الشكل التكميلي 6).
3. قياس عد الكيس وحجم الكيس
   1. لقياس قطر الكيس التقريبي، حدد أداة الخط المستقيم في قائمة فيجي وارسم خطًا عبر قطر كل كيس على الإسقاط النهائي(الشكل 3B (4)). إضافة منطقة جديدة من الفائدة (ROI) التي تم إنشاؤها لكل كيس إلى مدير ROI: اضغط على "t" اختصار على لوحة المفاتيح لأسرع العد وفتح مدير العائد على الاستثمار. انقر فوق "إظهار الكل" لرؤية الخراجات التي تم عدها ( الرقمالتكميلي 7)
   2. تحقق من أنه لم يتم ترك أي كيس دون العد عن طريق فرض مجموعة ROIs من الإسقاط على المكدس Z. للقيام بذلك، انقر فوق إطار Z-المكدس لتحديده. في مدير ROI ، انقر فوق "إظهار الكل" وتحريك المؤشر على طول المكدس Z للتحقق من تلك الصورة لكل صورة ، تم حساب جميع الخراجات ( الشكلالتكميلي 8).
   3. مرة واحدة وقد تم عد الخراجات الجديدة وROIs وأضاف على الخطوة 2.3.1.، حدد مجموعة العائد على الاستثمار وحفظه عبر نافذة مدير ROI عن طريق النقر على المزيد | حفظ (الشكل التكميلي 9).
   4. حدد كل ROIs في مدير العائد على الاستثمار وانقر فوق "قياس" في مدير ROI للحصول على حجم كل كيس. هذا سيفتح نافذة جديدة من القياسات المسماة "النتائج" ترقيم كل كيس وحجمه المقدر. ثم احفظ .csv التنسيق عن طريق النقر على "نتائج" نافذة وعبر القائمة : ملف | حفظ باسم (الشكل التكميلي 10).
      ملاحظة: يمكن إنشاء ماكرو إلى مكدسات معالجة شبه تلقائيًا، وتقدير عدد الكيس/ الأحجام من الإسقاطات، وتخزين البيانات لإجراء العد الأسرع. للقيام بذلك، حدد أداة "سجل" في قائمة شريط ، عن طريق النقر على الإضافات | وحدات الماكرو | سجل.
4. القياس الكمي لكفاءة تكوين الكيس
   1. عد عدد الخراجات في اليوم Y ، على إسقاط (Y = 1 ، 2 ، 4 ، 7 أو 10).
   2. لحساب كفاءة تكوين الكيس ل1000 خلية في اليوم Y، قسم عدد الخراجات التي تم عدها في ذلك الوقت على عدد الخلايا المصنفة في اليوم 0 الاستدلال من حجم هيدروجيل وضرب من قبل 1000(الشكل 3C، الشكل 4).
      

3- قابلية الخلية للاستمرار

1. إعداد محلول الأسهم من الفلوريسين diacetate (FDA) في 5 ملغ / مل عن طريق حل 5 ملغ من ادارة الاغذية والعقاقير في 1 مل الأسيتون وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. إعداد محلول مخزون من يوديد البروديم (PI) بتركيز 2 ملغ/مل في المياه الأيونية (dH₂O) وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
3. إعداد متوسط NRC دون مصل عجل الجنين (FCS).
4. لإعداد ادارة الاغذية والعقاقير / PI حل تلطيخ، إضافة 4 ميكرولتر من ادارة الاغذية والعقاقير حل المخزون (8 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) و 25 ميكرولتر من PI الأسهم الحل (20 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) في 2.5 مل من NRC المتوسطة دون FCS.
5. إزالة المتوسطة من الشريحة الغرفة، إضافة 250 ميكرولتر من حل تلطيخ في كل بئر واحتضان 4-5 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية، 5٪ CO_2. الماصات خارج حل تلطيخ بعناية وغسل مرة واحدة مع 250 ميكرولتر من 1X برنامج تلفزيوني.
6. إضافة بعناية 250 ميكرولتر من كامل NRC المتوسطة لكل بئر، واتخاذ الصور باستخدام المجهر المقلوب الفلوريسين مع تكساس الأحمر وفلوريسين isothiocyanate (FITC) مرشحات. سوف الخلايا الحية تكون خلايا خضراء والخلايا الميتة تكون حمراء (الشكل 5A).
   ملاحظة: من أجل تحديد حجم الخلايا الحية / الميتة، خذ Z-مكدسات عبر حجم هيدروجيل التالية الخطوة 2 وتكييف طريقة معالجة الصور لفلوريسنس.

4- نشاط إفراز

ملاحظة: يتم تقييم نشاط إفراز من خلال الغشاء الغشاء الزحلي من قبل إفراز الفلوريسين في تجويف. ويمكن تقييم خصوصيتها عن طريق القيام بنفس الاختبار مع فيراباميل، وهو متعدد الأدوية المقاومة (MDR) المانع^{الناقل 24}.

1. لإعداد حل تلطيخ من Hoechst 33258 في 5 ميكروغرام / مل، إضافة 0.83 ميكرولتر من حل الأسهم Hoechst (15 ملغ / مل تركيز الأسهم في dH₂O) في 2.5 مل من NRC المتوسطة دون FCS.
2. إضافة 250 ميكرولتر من الحل Hoechst في كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ لمدة 15 دقيقة.
3. إزالة الحل Hoechst وإضافة 250 ميكرولتر من ادارة الاغذية والعقاقير حل (8 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) في كل بئر. احتضان 4-5 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂.
   ملاحظة: بمجرد أن تتعرض الخلايا إلى حل ادارة الاغذية والعقاقير تلطيخ، متابعة حركية إفراز الفلورسين قد تكون مفيدة لمعايرة الوقت اللازم لتفرز الخراجات. للقيام بذلك، التقاط الصور كل دقيقة لمدة 1 ساعة عن طريق التصوير الفاصل الزمني. في هذا المثال، الوقت اللازم لمراقبة الخراجات سر NRC في هيدروجيل حوالي 15-20 دقيقة.
4. التقاط الصور باستخدام المجهر المقلوب الفلوريسين 5 دقائق بعد الشطف مع المتوسطة دون FCS. استخدام 4′, 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) والمرشحات فيتف للكشف عن الملصقات النوى وتراكم الفلورسين في تجويف (الشكل 6A). لتحديد عدد الخراجات إفراز، واتخاذ Z-مكدسات كما هو الحال في الخطوة 2 وتكييف خطوات معالجة الصور إلى الصور الفلورية.
   ملاحظة: بالنسبة لاختبار فيراباميل، تسبق العملية السابقة (الخطوات 4.3. إلى 4.4.) عن طريق حضانة مع فيراباميل، وفقا للشروط التالية:
5. إعداد محلول مخزون من 10 mM فيراباميل في ثنائيات الكبريت (DMSO). لإعداد 10 μM حل العمل، مزيج 2.5 μL من فيراباميل حل الأسهم مع 2.5 مل ثقافة المتوسطة دون FCS.
6. لتقييم أن الفلوريس في التجويف ينتج عن إفراز MDR ، خذ شريحة أخرى وأضف 250 ميكرولتر من محلول عمل فيراباميل في كل بئر واحتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂
7. إزالة الحل وإضافة 250 ميكرولتر من ادارة الاغذية والعقاقير حل (8 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) في كل بئر. احتضان 4-5 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂. ثم، وغسل مع 250 ميكرولتر من 1X PBS، قبل التصوير(الشكل 6B، C).

5. تقييم القطبية الظهارية عن طريق الفلوروسين

1. لإعداد حل التثبيت، مزيج 4٪ الفورمالديهايد مع 5٪ السكروز، في 1X PBS، درجة حَمَر 7.4 واحتضان في حمام مائي قبل تسخينه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
2. لإصلاح الخلايا، الماصات بلطف خارج المتوسطة الثقافة من البئر دون إتلاف المصفوفة. إضافة ببطء 400 μL من حل التثبيت إلى جانب الآبار. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   ملاحظة: دائما ترك 25 ميكرولتر من السائل فوق المصفوفة لمنع تلفه.
3. قم بإزالة محلول التثبيت برفق واغسل 3x بـ 400 ميكرولتر من 1x PBS في (RT).
4. الماصات خارج برنامج تلفزيوني، إضافة 400 ميكرولتر من حل permeabilization (0.5٪ تريتون X-100 في 1x PBS) واحتضان 10 دقيقة في RT.
5. قم بإزالة محلول permeabilization بلطف، تليها 3 غسيلات سريعة مع 400 ميكرولتر من PBS 1x وخطوة غسيل طويلة من 30 دقيقة في RT.
   ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن تخزين الشريحة عند 4 درجة مئوية لمدة يومين. في هذه الحالة، ختم الشريحة مع فيلم البارافين لمنع التبخر وتجفيف المصفوفة.
6. إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 400 ميكرولتر من محلول منع تحتوي على 0.1٪ البوم الأبقار (BSA) ومصل الماعز 10٪ في برنامج تلفزيوني 1x واحتضان لمدة 60 دقيقة في RT.
   تنبيه: تركيزات BSA أعلى من 0.1٪ سوف يؤدي إلى تراجع التجويف وانهيار الكيس مزيد من (انظر قسم النتائج التمثيلية) (الشكل 7A).
7. الماصات خارج الحل حجب وغسل مرة واحدة مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني /0.05٪ توين 20 وتجاهل.
8. أضف 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة، على سبيل المثال، الأجسام المضادة E-cadherin المخففة 1:400 وفالويدين 568 (16.2 nM التركيز النهائي) في 1X PBS واحتضان لمدة 90 دقيقة في RT.
   ملاحظة: هذا التخفيف من e-cadherin هو نفسه المستخدمة في بروتوكول المناعة 2D القياسية.
9. غسل العينة مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني/0.05٪ توين 20، 3x؛ في كل مرة احتضان العينة لمدة 10 دقيقة في RT.
10. أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus 647) ، المخفف 1:500 في PBS 1x واحتضان 60 دقيقة في RT.
11. غسل 3x مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني/0.05٪ توين 20، في كل مرة احتضان العينة لمدة 10 دقيقة في RT.
12. اغسل 3x مع 400 ميكرولتر من 1X PBS ، في كل مرة تحتضن العينة لمدة 10 دقائق في RT.
13. تجاهل برنامج تلفزيوني من غسل الماضي وإعداد الشريحة غرفة للتصور عن طريق المجهر confocal بعد واحد من الخيارين أدناه.
    1. إضافة 400 μL من 1X PBS و 50 ميكرولتر من DAPI في البئر. ويمكن فحص العينات من خلال الجزء السفلي من البئر دون الحاجة إلى تركيب مع غطاء (الشكل 7B).
    2. أضف 100 ميكرولتر في بئر من الكاشف المضاد للتجفيف الذي يحتوي على DAPI واترك الشريحة تجفف O/N في RT.

Results

تشكيل وتوصيف الخراجات
3D نظم ثقافة الخلايا هي أداة هامة لدراسة تولد الأعضاء والمرض^{النمذجة 25.} للأسف، معظم هذه الطرق هي نوعية أو استخدام القياس الكمي الداخلي الذي يتم القيام به على مستوى واحد من خلال مقارنة عدد الخراجات مقابل غير الخراجات، في أحجام متغيرة وغير محددة في كثير من الأحيان، ومنع أي مقارنة من حيث كفاءة تكوين الكيس بين الدراسات المختلفة^{7،8،9،10،}

Discussion

من أجل دراسة تكوين الأعضاء وصيانة الهياكل الخلوية 3D، وقد تم نمذجة الأنسجة المختلفة، وذلك باستخدام أصول الخلوية المختلفة ولكن أيضا أنواع مختلفة من المصفوفات خارج الخلوية بما في ذلك الهيدروجيل الاصطناعية^8،9،10،21. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود تحليل كمي 3D التي تسمح للمقارنات بين الأساليب من حيث تشكيل organoids أو وظيفة^7،8،

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 وميكرو ؛ ل- ماصة Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 & micro ؛ ل - ماصة Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000046
1000 & micro ؛ ل - ماصة Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 & micro ؛ ل - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3،3 & ، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم	Sigma-Aldrich	T5516	NRC التركيز النهائي المتوسط الكامل = 3.4 & micro ؛ جم / مل
حمض الخليك	VWR	20104-298	0.02N نصائح
ماصات حاجز الهباء الجوي النهائي 10 ومايكرو ؛ ل (فيشربراند)	نصائح
Scientific 1000 & micro; ل (فيشربراند)	نصائح ماصات حاجز الهباء	الجوي 2707404
Fisher Scientific 200 & micro; ل (فيشربراند)			المضاد
للمضادات الحيوية من ثيرمو فيشر (100X)	Sigma-Aldrich	A5955	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 1: 100 تخفيف
مستخلص الغدة النخامية البقري	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 30 & micro ؛ جم / مل
ألبومين مصل الأبقار	Sigma-Aldrich	A2153	1: 1000 تخفيف
تركيز الدهون المحدد كيميائيا (100X)	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC التركيز النهائي المتوسط الكامل = 1: 100 تخفيف
تركيز عالي الكولاجين ، ذيل الفئران	Thermo Fisher Scientific	354249	50 & micro ؛ جم / مل التركيز النهائي
ديكساميثازون	سيجما ألدريتش	D4902	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 0.393 & ميكرو ؛ جم / مل
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 1X
E-cadherin Rabbit مضاد للإنسان ، جرذ ، متعدد النسيلة	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	1: 400 تخفيف
Eclipse TE300 مجهر مقلوب	نيكون		تصوير
الإيثانولامين	سيجما ألدريتش	E9508	NRC نهائي متوسط كامل التركيز = 0.32 ملي
مصل ربلة الساق الجنينية	ثيرمو فيشر ساینتفيك	10270-106	تركيز نهائي متوسط كامل NRC = 5: 100 تخفيف
Fluoroshield مع DAPI (وسط تثبيت)	Sigma-Aldrich	F6057
الفورمالديهايد 16٪ (W / V)	Thermo Fisher Scientific	28906	4٪ (W / V)
مصل الماعز	ثيرمو فيشر العلمي	16210-064	1:10 تخفيف
كاميرا Hamamatsu (كاميرا رقمية C11440 ORCA - فلاش 4.OLT)	Hamamatsu		التصوير
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 & micro; جم / مل التركيز النهائي
IgG (H + L) الماعز عالي الامتصاص المضاد للأرانب ، Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	1: 500 تخفيف
ImageJ الإصدار 2.0.0-rc-69 / 1.52n			برنامج معالجة الصور مفتوح المصدر
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (100X)	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC التركيز النهائي المتوسط الكامل = 1: 100 التخفيف
L-Glutamine (100X) Thermo	Fisher Scientific	25030-024	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 1: 100 تخفيف
Matrigel GFR (تركيز المخزون 9.7 مجم / مل)	Thermo Fisher Scientific	356231	4:10 التخفيف
NIS Elements إصدار البرنامج 4.50.00	الحصول على صور نيكون
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 1: 100 تخفيف
الخطة الموضوعية فلور 10X / 0.30 Ph1 DL (&infin ؛ / 1.2 WD 15.2)	نيكون
إطالة الذهب الكاشف المضاد للتلاشي	الحراري فيشر العلمي	P36931
البروبيديوم (PI)	سيجما ألدريتش	P4170	20 & جم / مل التركيز النهائي
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	16.2 nM التركيز النهائي
Sir-Actin / Verapamil kit	Spirochrome	SC001	10 & micro ؛ M التركيز النهائي
مثبط التربسين فول	الصويا Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 50 & micro; جم / مل
مصفاة خلايا معقمة 40 وميكرو ؛ م (فيشربراند)	22363547		ثيرمو فيشر العلمي
10 مل (فيشربراند)	ماصات معقمة من ثيرمو فيشر سينتيفيك	1367811E
5 مل (فيشربراند)	معقمة من ثيرمو فيشر ساینتفيك	1367811D
أنابيب معقمة 1.5 مل (فيشربراند)	معقمة 11926955
15 مل (فيشربراند)		7200886
50 مل (فيشربراند)	ثرمو فيشر 553913
	سيجما ألدريتش	S0389	5:100 تخفيف
قارورة معالجة لزراعة الأنسجة 25 سم < سوپ > 2 < / سوب > (فالكون) ثيرمو	فيشر	353108
تريتون X-100	سيجما ألدريتش	T8787	5: 1000 تخفيف
التربسين EDTA (0.05٪) الفينول الأحمر	ثيرمو فيشر العلمي	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5: 10000 تخفيف
فيتامين (100X)	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC تركيز نهائي متوسط كامل = 1: 100 تخفيف
& -الشريحة 8 Well ibiTreat ، Ibidi	Clinisciences	80826