يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61438

⸱

أغسطس 30, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, 2Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول هو وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة وقوية لعزل microglia الأولية من العيش، والكبار، أنسجة الدماغ البشرية. يمكن أن تكون ميكروجليا الإنسان المعزولة أداة لدراسة العمليات الخلوية في التوازن والمرض.

الملخص

Microglia هي الخلايا المناعية الفطرية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). تلعب Microglia دورًا حاسمًا أثناء التطوير ، وفي الحفاظ على التوازن ، وأثناء الإصابة أو العدوى. وقد سلطت عدة مجموعات بحثية مستقلة الضوء على الدور المركزي الذي تلعبه المايكجليا في أمراض المناعة الذاتية، ومتلازمات المناعة الذاتية والسرطانات. قد يؤدي تنشيط الوميكروجليا في بعض الأمراض العصبية إلى المشاركة مباشرة في العمليات المسببة للأمراض. microglia الأولية هي أداة قوية لفهم الاستجابات المناعية في الدماغ، والتفاعلات الخلية الخلية والأنماط الظاهرية microglia dysregulated في المرض. ميكروجليا الأولية تقليد في خصائص ميكروجليال الجسم الحي أفضل من خطوط الخلايا الصغيرة الخالدة. تظهر ميكروجليا الإنسان الكبار خصائص متميزة بالمقارنة مع الجنين البشري والقوارض microglia. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل ميكروجليا الأولية عن الدماغ البشري البالغ. دراسة هذه microglia يمكن أن توفر رؤى حاسمة في التفاعلات الخلية الخلية بين microglia وغيرها من السكان الخلوية المقيمين في الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك، oligodendrocytes، الخلايا العصبية والخلايا الفلكية. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون مثقفة microglia من أدمغة بشرية مختلفة لتوصيف الاستجابات المناعية الفريدة للطب الشخصي وعدد لا يحصى من التطبيقات العلاجية.

المقدمة

تم بناء الجهاز العصبي المركزي (CNS) من شبكة معقدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1. بين الخلايا الدبقية، وظيفة microglia كالخلايا المناعية الفطرية من الجهاز العصبي المركزي2،3. Microglia هي المسؤولة عن الحفاظ على التوازن في الجهاز العصبي المركزي صحية4. Microglia تلعب أيضا دورا هاما في النمو العصبي، عن طريق تقليم نقاط الاشتباك العصبي2. Microglia هي مركزية في علم الفيزيولوجيا المرضية من عدة أمراض عصبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على; مرض الزهايمر5, مرض باركنسون6, السكتة الدماغية7, التصلب المتعدد8, إصابة الدماغ الرضية9, آلام الأعصاب10, إصابة الحبل الشوكي11 وأورام الدماغ مثل الأورام الدبقية12.

الدراسات المتعلقة بالسوستاسيس CNS والأمراض استخدام microglia القوارض بسبب ندرة كفاءة التكلفة والوقت كفاءة الإنسان microglia بروتوكولات العزلة الأساسية13. القوارض microglia تشبه microglia الإنسان الأولية في التعبير عن الجينات مثل Iba-1، PU.1، DAP12 ومستقبلات M-CSF وكانت فعالة في فهم الدماغ العادي وكذلك المريض13. ومن المثير للاهتمام، والتعبير عن العديد من الجينات المناعية ذات الصلة مثل TLR4، MHC الثاني، Siglec-11 وسيجلج-3 يختلف بين الإنسان والقوارض microglia13. التعبير عن العديد من الجينات يختلف أيضا في التعبير الصدغي والأمراض العصبية في كلا النوعين14,15. هذه الاختلافات الكبيرة تجعل من ميكروجليا الإنسان نموذجا أساسيا لدراسة وظيفة microglia في التوازن والمرض. يمكن أن تكون ميكروجليا الإنسان الأولية أيضا أداة فعالة للفحص قبل الإكلينيكي للمرشحين المحتملين المخدرات16. وتؤكد الأسباب المذكورة أعلاه الحاجة المتزايدة إلى بروتوكولات فعالة من حيث التكلفة لعزل الغليا البشري الأولي.

لقد وضعنا بروتوكول لعزل ميكروليا الإنسان الأولية من أنسجة الدماغ البشرية الكبار التي تم جمعها نتيجة نافذة جراحية تم إنشاؤها لاستئصال الورم أو ال استئصالات جراحية أخرى. الأسلوب هنا يختلف بشكل كبير عن الأساليب الموجودة. تمكنا من عزل واستزراع الميكولا بعد مرور 75 دقيقة من موقع جمع الأنسجة إلى بدء بروتوكول العزل في المختبر. لقد استخدمنا سوبرات من الخلايا الليفية L929 لتعزيز نمو microglia معزولة. تركز هذه الطريقة على وجه التحديد على ثقافة وتطوير ميكروجليا الأولية فقط. الثقافة الناتجة عن إعداد حوالي 80٪ microglia. بينما البروتوكولات الأخرى توفر ثقافة غنية من microglia بالانقسام المركزي للانقسام الانحدار الكثافة ، cytometry التدفق والخرز المغناطيسي ، فإن البروتوكول هو طريقة سريعة وبسيطة وقوية وفعالة من حيث التكلفة لثقافة ميكروجليا الإنسان الأولية17،18،19،20. القدرة على استخدام جراحيا إزالة حية أنسجة المخ الكبار بدلا من أنسجة الدماغ الثابتة من الجثث يثبت ميزة إضافية من هذه الطريقة على النقيض من الإجراءات القائمة18,21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على جميع الأنسجة بعد موافقة أخلاقية من لجان أخلاقيات المعهد الهندي للتكنولوجيا جودبور ومعهد عموم الهند للعلوم الطبية (AIIMS) جودبور.

1.نسيج اكتساب وتجهيز (يوم 0)

  1. جمع الأنسجة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من الجليد السائل النخاعي الاصطناعي البارد (aCSF) (2 mM CaCl2∙ 2H2O، 10 mM الجلوكوز، 3 M KCl، 26 mM NaHCO3،2.5 mM NaH2PO4،1 mM MgCl2∙ 6H2O، 202 mM سكروز)20. تأكد من أن الأنبوب يبقى على الجليد إذا كان النسيج يحتاج إلى نقلها إلى مكان مختلف.
    ملاحظة: إعداد aCSF في الماء المقطر المقطّع. تصفية مع 0.22 μm مرشاح حقنة في غطاء محرك السيارة. ويمكن تخزين هذا لمدة شهر واحد عند 4 °C.
  2. امسح أنبوب الجمع بعناية مع 70٪ من الكحول ونقلها إلى غرفة تدفق الهواء المتعفنة.
  3. تجاهل aCSF بعناية وزن الأنسجة في حالة تعفن. وزن الأنسجة ضروري لحساب حجم التربسين-EDTA اللازمة للخطوات اللاحقة.
  4. الحفاظ على الأنسجة في aCSF دافئة جديدة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لتجنب موت الخلايا.
  5. تخلص من aCSF وغسل الأنسجة مرة واحدة مع 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة) في 37 درجة مئوية. تأكد من أن جميع الدم يتم غسله مع غسل برنامج تلفزيوني المتكررة (حسب الحاجة).
  6. احتضان الأنسجة في PBS الحارة، في 37 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق.
  7. تجاهل برنامج تلفزيوني بعناية ونقل الأنسجة إلى طبق بيتري تعقيم. يمكن إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة. وهذا سوف يمنع أي فقدان الأنسجة.
  8. الزهر على الأنسجة الصغيرة (على الأقل 1 مم3)قطعة باستخدام مشرط معقمة. توفر الأنسجة المقطّعة ناعماً مساحة أعلى لسطح الأنسجة لتفكك الأنسجة عن طريق التربسين-EDTA لضمان زيادة الغلة.
  9. نقل النسيج مكعبات إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل / غرام من الأنسجة 0.25٪ التربسين-EDTA ومزيج عن طريق الأنابيب من خلال ماصات المصلية 10 مل. أضف 2 مل من التربسين/EDTA إلى طبق بيتري واغسل الطبق جيدًا بمساعدة الماصات. أضف هذا التربسين مرة أخرى إلى أنبوب الصقر. وهذا يقلل من فقدان الأنسجة والخلايا أثناء ا.
  10. احتضان الأنبوب على شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة. هذه الخطوة يزيد من تفكك الخلايا من الأنسجة.
  11. في نهاية الحضانة، إضافة 10 مل من تحييد المتوسطة (50٪ DMEM/50٪ F12 مع الجلوتامين، 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين، 10٪ FBS) لتحييد التربسين. اخلطي مع ماصة سيرولوجية 10 مل. يجب أن يكون مقدار تحييد الوسائط المضافة مساوياً لمقدار التربسين المستخدم.
  12. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 2000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  13. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من المتوسط الثقافة (50٪ DMEM/50٪ F12 مع الجلوتامين، 1٪ البنسلين-الستربتوميسين، 20٪ L929 فائقة، 10٪ FBS).
    ملاحظة: L929 الخلايا هي الثقافة في DMEM (DMEM مع الجلوتامين، 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين، 10٪ FBS). يجب اتباع أسلوب الثقافة ATCC الموصى بها لثقافة الخلية. يجب أن يتم جمع Supernatant من قارورة الثقافة التي لا تقل عن 75٪ التقاء. ويمكن جمعها بكميات كبيرة وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمنع تدهور عوامل النمو. من المستحسن إضافة L929 supernatant بشكل منفصل في قارور بدلا من إضافة إلى الأسهم ثقافة المتوسطة.
  14. لوحة الخلايا في قارورة T-25، مناسبة للخلايا الملتصمة، وإضافة 4 مل من ثقافة إضافية المتوسطة. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. يهز بعناية قارورة لتفريق متجانسة الأنسجة. تجنب جلب وسائل الإعلام إلى عنق القارورة، في حين تهتز، وهذا قد يزيد من فرص التلوث.

ثقافة 2.Cell (اليوم 2)

  1. جمع وسائل الإعلام من قارورة ثقافة T-25 أعدت في اليوم 0 في ثلاثة أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل من خلال جمع حجم متساو من وسائل الإعلام في كل أنبوب. اغسل القارورة مرة واحدة مع 1 × PBS. هز القارورة بلطف لإزالة أي بقايا الأنسجة شظايا اليسار. تجنب اهتزاز قاسية من القارورة كما أي بقايا شظايا لن تؤثر سلبا على الثقافة. أضف 5 مل وسائط ثقافية جديدة إلى القارورة.
  2. أجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 1,466 x ز (4000 دورة في الدقيقة) عند 4 °C لمدة 4 دقائق.
  3. تجاهل افرا من كل أنبوب وإضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى واحدة من الأنابيب. اخلطي جيدا مع الماصات. أضف الوسائط المختلطة مع الخلايا إلى أنابيب أخرى بشكل متسلسل. تخلط جيدا مع ماصة وتجمع الخلايا في أنبوب واحد.
  4. لوحة الخلايا في قارورة تي 25 منفصلة، ومناسبة للخلايا الملتصق. إضافة 4 مل من الثقافة المتوسطة واحتضان القارورة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.

3.Cell ثقافة (اليوم 4)

  1. تجاهل وسائل الإعلام من كل من قارورة وإضافة جديدة 5 مل من وسائل الإعلام الثقافة إلى القارورة.
  2. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 2 يوم.

4. خلية الثقافة (اليوم 6)

  1. الخلايا ستكون جاهزة لمزيد من التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه(الشكل 1) ، تمكنا من عزل ميكروجليا الإنسان الأولية من أنسجة الدماغ الحية التي تم استئصالها جراحيًا. كانت الخلايا المستزرعة ملطخة بالريسينوس كومونيس agglutinin-1 (RCA-1) للليكتين للميكروجليا (الأخضر) ومع البروتين الضبي الرجيلي الحمضي (GFAP) للسيّدات الفلكية (أحمر)(الشكل 2)كما هو موضح سابقا22،23،24...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

Microglia ضمان التوازن في الدماغ العادي وتلعب أدوارا مركزية في علم الفيزيولوجيا المرضية من مختلف الأمراض العصبية4. Microglia هي مركزية لنماء الأعصاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي2. وقد أثبتت الدراسات microglial محوري في فهم تطور وتطور الأمراض العصبية المتنوعة4. microglia القوارض هي النموذج السائد من اختيار للدراسات microglial الأولية، على الرغم من أن القوارض microglia تختلف عن microglia الإنسان الأولية في الجوانب الرئيسية13. قد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تأسيس مختبر SJ بمنح مؤسسية من IITJ ويتم تمويله من خلال منح من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ووزارة الإلكترونيات وتكنولوجيا المعلومات الحكومية في الهند (No.4(16)/2019-ITEA). تم الحصول على أقسام أنسجة الدماغ البشري من معهد عموم الهند للعلوم الطبية (AIIMS) جودبور بعد موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية. نشكر مايانك راثور، عضو B.Tech Student في جمعية التصميم والفنون IIT Jodhpur، لدعم التصوير بالفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول مضاد حيوي مضاد للفطرياتهيميدياA002
كلوريد الكالسيومسيجما223506
طرد مركزي (4 درجات ؛ ج)سيجما 146532
AbdosP10203
CO2< / sub> حاضنةNew BrunswikGalaxy 170 S
D-GlucoseHimediaGRM077
DMEM medium مع الجلوتامينHimediaAL007S
مصل الأبقار الجنينيHimediaRM9955
أنبوب فلاكون (50 مل)Thermo Fsiher Scientific 50CD1058
الفلوريسين Ricinus communis agglutinin-1VectorFL-1081
مجهر الفلورسنتLeicaDM2000LED
Fluoroshield مع DAPISigmaF6057
GFAP الأجسام المضادةGA53670S
شاكر حاضنةنيو برونسويك ScientificInnova 42
L929 خط الخليةATCCNCTC استنساخ 929 [خلية L ، L-929 ، مشتق من السلالة L] (ATCC & nbsp ؛ CCL-1)
تدفق الهواء الصفحيThermo Fsiher Scientific   ؛1386
كلوريد المغنيسيومهيميدياMB040
فوسفات أحادي الصوديومميرك567545
خليط المغذيات F-12 لحم الخنزير متوسطهيميدياAl106S
طبق بتريدوران المجموعة237554805
محلول ملحي مخزنبالفوسفات هيميدياML023
كلوريدالبوتاسيومHimediaMB043
ماصة مصليةLabwareLW-SP1010
بيكربونات الصوديومHimediaMB045
سكروزHimediaMB025
مرشح حقنة (0.2 مو ؛ قطر 25 مم)Axiva SFPV25R
T-25 مناسبة لزراعة الخلايا الملتصقة.HimediaTCG4-20X10NO
Trypsin-EDTA (0.25٪)Gibco   ؛هاتف: 25200-056
جهاز أنابيب الطرد المركزي قوارير زراعة الأنسجة

المراجع

  1. Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  2. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
  3. Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
  4. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  5. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
  6. Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).
  7. Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
  8. Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
  9. Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
  10. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  11. Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518(2019).
  12. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  13. Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
  14. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).
  17. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
  18. Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).
  19. Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).
  20. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  21. Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
  22. Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).
  23. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  24. Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
  25. Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).
  26. Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
  27. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).
  28. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  29. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Trypsin EDTA
الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.