مقالة منهجية

التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

DOI:

10.3791/61446

⸱

مايو 15, 2020

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لزراعة وتمييج الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الأنساب العصبية، تليها سلسلة من المقايسات لتوصيف الخلايا المتمايزة. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأرة E14 لتشكيل أجسام جنينية من خلال طريقة الإسقاط المعلق ، ثم تم حثها على التفريق إلى خلايا السلف العصبي بواسطة حمض الريتينويك ، وتم تمييزها أخيرا إلى خلايا عصبية. كشفت تجارب النسخ العكسي الكمي البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) وتجارب immunofluorescence أن السلف العصبي والخلايا العصبية تظهر علامات المقابلة (نستين للسلف العصبية والتشخيص العصبي للخلايا العصبية) في اليوم 8 و 12 بعد التمايز، على التوالي. أظهرت تجارب قياس التدفق الخلوي على خط E14 التي تعبر عن مراسل GFP مدفوع من قبل Sox1 أن حوالي 60٪ من الخلايا في اليوم 8 إيجابية GFP ، مما يشير إلى التمايز الناجح لخلايا السلف العصبي في هذه المرحلة. وأخيرا، استخدم تحليل الحمض النووي الريبي-seq لتحليل التغيرات العالمية في النسخ. هذه الأساليب مفيدة لتحليل مشاركة جينات ومسارات محددة في تنظيم انتقال هوية الخلية أثناء التمايز العصبي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ اشتقاقها الأول من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الكيسية الماوسالنامية 1،2، وقد استخدمت الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESC) كأدوات قوية لدراسة الخلايا الجذعية التجديد الذاتي والتمايز3. وعلاوة على ذلك، فإن دراسة التمايز mESC يؤدي إلى فهم هائل للآليات الجزيئية التي قد تحسن الكفاءة والسلامة في العلاج القائم على الخلايا الجذعية في علاج أمراض مثل الاضطرابات العصبية4. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية، يوفر هذا النظام في المختبر العديد من المزايا بما في ذلك البساطة في الممارسة والتقييم، وانخفاض التكلفة في الحفاظ على خطوط الخلايا على النقيض من الحيوانات، وسهولة نسبية في التلاعب الجيني. ومع ذلك، فإن كفاءة وجودة أنواع الخلايا المتمايزة تتأثر في كثير من الأحيان بخطوط مختلفة من mESCs وكذلك طرق التفريق5و6. كما أن المقايسات التقليدية لتقييم كفاءة التمايز تعتمد على الفحص النوعي لجينات العلامات المختارة التي تفتقر إلى القوة، وبالتالي فهي تفشل في فهم التغيرات العالمية في التعبير الجيني.

هنا نهدف إلى استخدام بطارية من المقايسات لتقييم منهجي للتمايز العصبي. باستخدام كل من التحليلات التقليدية في المختبر على علامات مختارة ورنا-seq، ونحن إنشاء منصة لقياس كفاءة التمايز، فضلا عن التغيرات النسخية خلال هذه العملية. استنادا إلى بروتوكولالمنشأةسابقا 7 , أنشأنا الأجسام الجنينية (EBs) من خلال تقنية إسقاط شنقا, تليها التعريفي باستخدام كمية فوقفيزيولوجية من حمض الريتينويك (RA) لتوليد خلايا السلف العصبية (NPCs), التي تم تمييزها في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية مع وسيط التعريفي العصبي. لدراسة كفاءة التمايز ، بالإضافة إلى المقايسات التقليدية RT-qPCR والمناعة (IF) ، قمنا بإجراء قياس الخلايا الحمض النووي الريبي والتدفق. وتوفر هذه التحليلات قياسا شاملا لتطور التمايز الخاص بالمرحلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة mESC

  1. معطف 10 سم الأنسجة الثقافة المعالجة لوحة مع 0.1٪ الجيلاتين والسماح للجيلاتين لتعيين ما لا يقل عن 15-30 دقيقة قبل أسبيراتينغ بها.
  2. البذور γ المشععة الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) قبل يوم واحد من زرع mESCs في المتوسط mESC قبل الاحماء (دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) مع 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، والأحماض الأمينية غير الأساسية، β ميركابتوثانول، إل-غلوتامين، البنسلين/الستربتومايسين، بيروفات الصوديوم، LIF، PD0325901 (PD)، وChir99021 (CH)).
  3. السماح للماء المشع γ لتسوية ونلتصق على سطح لوحة قبل زراعة الخلايا E14.
  4. تذوب E14 ESCs في حمام مائي 37 درجة مئوية ونقل الخلايا بسرعة في أنبوب مخروطي 15 سم مع المتوسطة mESC الدافئة. بيليه الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.
  5. إعادة تشغيل الخلايا في 10 مل من المتوسط mESC ولوحة الخلايا على لوحة الثقافة التي تحتوي على MEFs المشع γ المصنفة في وقت سابق. احتضان ثقافة الخلية في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  6. لثقافة passaging، يستنشق ه المتوسطة وغسل لوحة معقمة 1x PBS. إضافة ما يكفي من 0.05٪ تريبسين لتغطية سطح لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  7. تحييد التريبسين مع المتوسطة mESC وماصة لتوليد تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.
  8. عد الخلايا مع عداد الدم أو عداد الخلية والبذور حوالي 5.0 × 105 خلايا في لوحة ثقافة 10 سم.
  9. Resuspend الخلايا في 10 مل من المتوسطة mESC، لوحة الخلايا على لوحة زراعة الأنسجة المغلفة الجيلاتين واحتضان الثقافات كما هو موضح سابقا.
    ملاحظة: من المستحسن أن يتم تمرير mESCs كل يومين لمنع الخلايا من التفريق في مستعمراتها. فينول الأحمر في وظائف متوسطة فقط كمؤشر درجة الحموضة واعتمادا على الكثافة الخلوية، فإنه يمكن أن تتحول مصفر (أكثر حمضية)، في وقت أقرب من 2 أيام. وبالتالي، قد يكون من الضروري تغيير الوسط كل يوم. سوف تموت صناديق الاستثمار متعددة الإشعاعات γ في نهاية المطاف بعد بضعة مقاطع.

2. EB، المجلس الوطني للصحافه، والتمايز العصبي

  1. تنفيذ بروتوكول تمرير الثقافة المذكورة سابقا، وعدد الخلايا (الخطوات 1.7-1.10).
  2. طريقة إسقاط شنقا (يوم 0)
    1. للوحة زراعة الخلية 10 سم، عد ما يقرب من 2.5 × 104 خلايا حيث سيتم تعليق 5.0 ×10 2 خلايا في 20 ميكرولتر متوسط التمايز (DMEM مع 15٪ FBS، والأحماض الأمينية غير الأساسية، β ميركابتوثانول، L-الجلوتامين، البنسلين / streptomycin، وبيروفات الصوديوم). يمكن أن تكون مطلية ما يقرب من خمسين قطرات 20 ميكرولتر التي تحتوي على الخلايا على لوحة واحدة 10 سم.
    2. Aliquot العدد المناسب من الخلايا، ومن ثم الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.
    3. إعادة إنفاق الخلايا في الحجم المناسب من وسيط التمايز لكثافة الخلية من 5.0 × 102 خلايا لكل 20 ميكرولتر (على سبيل المثال، 2.5 × 104 خلايا في 1 مل من متوسط التمايز).
    4. باستخدام ميكروباينيت أو ماصة مكررة، ضع قطرات 20 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء لوحة زراعة الأنسجة. تأكد من أن قطرات ليست قريبة جدا من بعضها البعض لمنعهم من الاندماج.
      ملاحظة: يمكن أن تكون مطلية قطرات على لوحة مرفق الأنسجة الثقافة المعالجة أو لوحة تعليق كما سيتم وضعها على الغطاء وليس لوحة نفسها. لنهج أكثر جدوى وعقيمة، لوحة قطرات على لوحة مرفق الأنسجة والثقافة ونقلها إلى لوحة تعليق كما هو موضح أدناه.
    5. ملء لوحة مع 5-10 مل من برنامج تلفزيوني 1x ووضع بعناية الغطاء مرة أخرى على لوحة. احتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتم إضافة برنامج تلفزيوني إلى لوحة الثقافة لمنع قطرات من الجفاف.
  3. في اليوم 2، استخدم micropipette لجمع قطرات من الغطاء ووضعها في لوحة تعليق خلية 10 سم مليئة 10 مل من وسيط التمايز. احتضان الثقافة على شاكر المداري تهتز بسرعة منخفضة في الحاضنة.
  4. في اليوم 4، لحصاد EBs ، وجمع الخلايا ، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant.
    ملاحظة: يمكن غسل EBs أيضا مع برنامج تلفزيوني 1x وفقا لمتطلبات التجارب اللاحقة.
  5. لمواصلة الإجراء والحث على التمايز EB في خلايا السلف العصبي (NPCs)، وإعداد وسيط التمايز مع حمض الريتينويك 5 ميكرومتر (RA).
  6. إزالة المتوسطة القديمة عن طريق بيليه EBs في 100 × ز لمدة 3 دقائق أو السماح لEBs لتسوية قبل أسبيراتينغ خارج المتوسطة القديمة. أضف 10 مل من وسيط التمايز الذي يحتوي على 5 ميكرومتر RA إلى لوحة الثقافة.
  7. في اليوم 6، استبدل ما لا يقل عن نصف الوسط بوسط طازج يحتوي على 5 ميكرومتر RA عن طريق إمالة اللوحة وأنابيب الوسط كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: من المستحسن أن يتم استبدال نصف المتوسط على الأقل مع وسيطة جديدة تحتوي على RA في اليومين 5 و 7. يحيط علما مؤشر فينول الأحمر; إذا كان يتحول مصفر، فمن الأفضل أن تحل محل كل من المتوسط.
  8. في اليوم 8، حصاد الشخصيات الوطنية عن طريق جمع الخلايا ، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant.
    ملاحظة: يمكن غسل الشخصيات أيضا مع برنامج تلفزيوني 1x وفقا لاحتياجات التجارب اللاحقة. وإذا لزم الأمر، يمكن تجميد المركبات غير الوطنية وذوبانها مرة أخرى من أجل الثقافة والتحليل في وقت لاحق. إذا كان ل NPCs أن تكون مثقفة، يمكن أيضا استخدام accutase كبديل للتريبسين.
  9. لمواصلة الإجراء وتمييز الشخصيات في الخلايا العصبية، وجمع الخلايا العصبية في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق الطرد المركزي، وتفكيكها مع التريبسين واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ماصة الشخصيات لضمان أن يتم فصل جميع المجاميع المجلس الوطني لنواب الشعب وتحييد التريبسين مع المتوسطة.
  10. تصفية الخلايا مع 40 ميكرومتر مصفاة خلايا النايلون والعد الخلايا قبل الطلاء لهم في كثافة 1.5 × 105/ سم2 في N2 المتوسطة (DMEM / F12 المتوسطة + 3 ملغ / مل الجلوكوز + 3 ملغ / مل الدهون الغنية مصل البقري الألبومين (LBSA) + 1:100 N2 الملحق + 10 نانوغرام / مل bFGF + 50 U / مل القلم / العقدية + 1 mM L-الجلوتامين) على لوحة الأنسجة والثقافة المعالجة لPCR اللاحقة والتجارب لطخة الغربية; أو على غرفة زراعة الأنسجة لتجارب immunofluorescence.
  11. في اليوم 9، استبدل الوسط القديم بوسط N2 طازج.
  12. في اليوم 10, تبديل المتوسط N2 مع N2/B27 المتوسطة (50٪ DMEM/F12 و 50٪ القاعدية العصبية, 3 ملغم/مل LBA, 1:200 N2 الملحق, 1:100 B27 الملحق, 50 U/mL القلم / العقدية, و 1 MM L-الجلوتامين).
  13. في الأيام 11-12، حصاد الخلايا العصبية على النحو التالي. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x، إضافة تريبسين، واحتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل تحييد التريبسين مع أجهزة الطرد المركزي والمتوسطة في 200 × ز لمدة 3 دقائق.

3. توصيف mESCs والخلايا المتمايزة

  1. الفوسفاتاز القلوية (AP) المقايسة
    1. استخدم مجموعة لتقييم نشاط الفوسفاتاز القلوية (انظر جدول المواد).
    2. إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة وغسل ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x.
    3. إضافة 1 مل من حل الإصلاح (يتكون من الفورمالديهايد والميثانول) المقدمة مع عدة إلى لوحة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق.
      ملاحظة: الإفراط في الحضانة في حل الإصلاح يمكن أن يعرض نشاط AP للخطر.
    4. إزالة الحل الإصلاح، وغسل ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x وترك بعض كمية من برنامج تلفزيوني في لوحة.
      ملاحظة: حافظ على رطوبة ESCs في PBS لعدم تعريض نشاط AP للخطر.
    5. قم بإعداد حل AP عن طريق خلط حلول الركيزة A وB وC بنسبة 1:1:1. امزجي المحاليل A وB أولا واحتضني الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين قبل إضافة محلول C.
    6. إزالة برنامج تلفزيوني 1x وإضافة الحل AP أعدت في وقت سابق.
    7. احتضان ESCs لمدة 15 دقيقة في الظلام عن طريق التفاف لوحة الثقافة مع رقائق الألومنيوم أو أداء الخطوة 3.5 في غرفة مظلمة.
    8. مراقبة رد الفعل وإزالة محلول رد الفعل عندما يتحول الحل مشرق لتجنب تلطيخ غير محددة.
    9. غسل ESCs مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
    10. منع العينة من التجفيف عن طريق تغطية ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x أو تركيب المتوسطة.
      ملاحظة: سوف تظهر وصمة عار حمراء أو أرجوانية للتعبير عن AP. يمكن تخزين الطبق في ثلاجة 4 °C.
  2. RT-qPCR
    1. جمع الخلايا في مراحل مختلفة باتباع الخطوات 1.6-1.7 و 2.4 لESCs وEBs وNPCs، على التوالي.
    2. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، واستخراج البروتين الحل (انظر جدول المواد).
    3. إنشاء cDNA مع عدة النسخ العكسي (انظر جدول المواد)واتبع دليل الشركة المصنعة.
  3. التثبيت والتضمين
    1. حصاد EBs وNPCs كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.6) وإصلاحها مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) الحل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة PFA وغسل العينة مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق.
    3. ضع العينة في مخفف متسلسل من حلول 1x PBS و 10٪ - و 20 ٪ - و 30 ٪ سكروز في 25 درجة مئوية حيث يتم نقل العينة إلى الحل التالي بعد 30 دقيقة من الحضانة.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينة في محلول السكروز بنسبة 30٪ عند 4 درجات مئوية قبل المتابعة مع خطوة التضمين.
    4. الرطب تلميح ماصة مع محلول السكروز قبل وضع العينة (دون التراص لهم) في وسط العفن cryo وماصة من السائل الزائد.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام ورقة التصفية لإزالة الحل الزائد. التبول تلميح ماصة مع محلول السكروز مهم لمنع EBs وNPCs من الالتصاق بجدران الطرف.
    5. إضافة بعناية درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) حل للقالب دون إعادة تعليق العينات وإزالة الفقاعات الزائدة مع ماصة.
    6. ضع القالب مع العينة على خلاط مختبر بسرعة منخفضة لإثارة العينة بشكل معتدل لمدة 15 دقيقة. وهذا يساعد على تسوية EBs و NPCs إلى أسفل إذا تم إعادة إنفاقها في حل OCT.
    7. تجميد العينة بسرعة عن طريق وضع القالب في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في ثلاجة -70 درجة مئوية قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  4. بكاء
    1. تعيين cryostat لتهدئة إلى -20 إلى -18 درجة مئوية قبل نقل العينة إلى الصك.
    2. فصل كتلة أكتوبر المجمدة من القالب وتأمينه على حامل مع حل أكتوبر قليلا وضعت على سطح حامل.
    3. قم بمحاذاة كتلة OCT بحيث تكون EBs وNPCs الأقرب إلى النصل لضمان عدم فقدان العينة أثناء المقطع.
    4. بعناية القسم 10 ميكرومتر من كتلة وإيلاء اهتمام وثيق لشرائح التي تحتوي على العينة.
    5. ضع بسرعة شريحة OCT التي تحتوي على العينة على الشريحة الزجاجية التي تتضمن الأنسجة والسماح لشرائح OCT بتجفيف الهواء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -70 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  5. الفلورة المناعية (IF)
    1. كتلة أقسام أكتوبر أو غرف الثقافة التي تحتوي على الخلايا العصبية في 10٪ مصل الحمير العادية / 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. احتضان العينات في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 5٪ مصل الحمير العادي/0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    3. غسل العينات في 1x PBS/0.1٪ تريتون X-100 ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل غسل.
    4. احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 5٪ مصل الحمير العادي /0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    5. غسل العينات في 1x PBS/0.1٪ تريتون X-100 ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل غسل ثم احتضان العينات في 1 ميكروغرام / مل DAPI.
    6. جبل العينات مع غطاء وبعض المتوسطة المتصاعدة والسماح لها لتجف.
    7. مراقبة العينات تحت المجهر الفلوري.
  6. تحليل الحمض النووي الريبي-seq
    1. جمع الخلايا في مراحل مختلفة وأداء استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 3.2).
    2. إعداد مكتبات cDNA، وإجراء تسلسل عميق وتحليل البيانات وفقا للبروتوكول الموصوف في وانغوآخرون.
    3. إجراء تحليل علم الأنتولوجيا الجينية (GO) باستخدام حزمة R، clusterProfiler.
  7. قياس التدفق الخلوي
    1. جمع ESCs باتباع الخطوات 1.6-1.7 وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط. جمع EBs و NPCs باتباع الخطوة 2.4 وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط.
    2. تصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية النايلون 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
    3. قياس إشارة GFP للعينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي (الذي يؤديه المرفق الأساسي للمؤسسة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كتمثيل لطريقتنا ، قمنا بإجراء تجربة تمايز EB و NPC والخلايا العصبية على خلايا E14. تم استزراع خلايا E14 على γ المشععة MEFs(الشكل 1A)حتى تم تخفيف مجموعة MEF المشععة γ. أكدنا pluripotency من الخلايا E14 من خلال أداء الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب)تلطيخ (الشكل 1B)وRT-qPCR في وقت لاحق (انظر أدناه) لعلامات نانوغ و Oct4. ثم تم تحريض خلايا E14 الخالية من ال MEF γ المشعة على التمايز باستخدام البروتوكول المبين في الشكل 2A. باختص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء طريقة التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس لعقود واستمر الباحثون في تعديل البروتوكولات السابقة أو إنشاء بروتوكولات جديدة لأغراض مختلفة7و10و11. استخدمنا سلسلة من المقايسات لتحليل شامل لكفاءة وتقدم مراحل التمايز من mESCs إلى الخلايا العصبية ، والتي يمكن استخدامها في تحليل تمايز النسب الأخرى من الماوس أو ESCs الإنسان. وعلاوة على ذلك، أثبتت نهجنا أن تكون أدوات مفيدة لتقييم تأثير جينات محددة أو مسارات على التمايز ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد القومية للصحة (1R35GM133496-01) إلى Z. Gao. نود أن نشكر الدكتور ريان هوبز على المساعدة في القسم. نشكر المرافق الأساسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب، بما في ذلك علوم الجينوم والمعلوماتية الحيوية، والتصوير المجهري الضوئي المتقدم، وقياس التدفق الخلوي. كما نشكر الدكتور يوكا إيمامورا على المساعدة في تحليل الحمض النووي الريبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ تريبسين + 0.53 ملي مولار EDTA 1Xكورنينج25-052-CV
0.1٪ جيلاتينسيجماG1890-100Gمحضر في ماء منزوع الأيونات
16٪ بارافورمالدهيدحراري علمي28908مخفف في 1X PBS
40-& mu ؛ مصفاة الخلايا mFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG (H + L)InvitrogenA11001في الساعة 1:500 لمجموعة
تلطيخ الفوسفاتيز القلوية IF IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
مكمل B27Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer مجموعة الحمض النووي عالية الحساسيةAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
ChloroformC298-500Fisher كيميائي
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM / F12 متوسطThermo Fisher Scientific11320033
EB bufferQiagen19086
الإيثانول111000200Pharmcoمخفف في الماء منزوع الأيونات
مصل الأبقار الجنينيأتلانتا بيولوجيزS10250
فيشربراند سوبر فروست بلس شرائح مجهر فيشرسيانتيفيك12-550-15
نظام التسلسل HiSeq 2500IlluminaSY-401-2501
الأيزوبروبانولBDH1133-4LGBDH VWRتحليلي مخفف في الماء منزوع الأيونات
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030024
LIFN / AN /A تم جمعها من بادئات MEF الطافية
m18srRNAIDTDNAN /A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
الأحماض الأمينية غير الأساسيةCorning25-025-Cl
mNanog بادئاتIDTDNAN / A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
بادئات mNesIDTDNAN / A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1
بادئاتIDTDNAN / A5'-CGAGTCATGAGTGGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAGAAACTGACGTG-3'mOct4
بادئاتIDTDNAN / A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
بادئاتIDTDNAN / A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
مكملThermo Fisher Scientific17502048
تم تخفيف الجسم المضاد الأساسيMilliporeMAB5326في الساعة 1:200 ل IF
العصبية القاعديةالحرارية فيشر العلمية21103049
الجسم المضاد الأساسي للخيوط العصبيةDSHB2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep KitBioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
البنسلين / الستربتومايسينCorning30-002-Cl
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)N / AN / Aمحضرة في ماء منزوع الأيونات
- كلوريد البوتاسيومP217-500GVWR
- فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة اللامائي0781-500GVWR
- كلوريد الصوديومBP358-10الكواشف
- فوسفات الصوديوم ، ثنائي الأساس ، سباعي الهيدراتSX0715-1Milipore
التمهيدي السداسي العشوائيThermo ScientificSO142
حمض الريتينويكSigmaR2625المحضر في DMSO
بيروفات الصوديومCorning25-000-Cl
السكروزSigma84097مخفف في 1X PBS
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. مركبساكورا4583
كاشف العزل TriPureسيجما ألدريتش11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
& beta ؛ -mercaptoethanolفيشر الكواشف الحيويةBP176-100
تم تخفيف الجسم المضاد الحيوية فيشر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RT qPCR RNA Sequencing Sox1 GFP

مقالات ذات صلة