مقالة منهجية

استخراج الحمض النووي عالي الجودة الأمثل من آفات تصلب الشرايين البشرية المضمنة في البارافين الثابت بالفورمالين

DOI:

10.3791/61452

⸱

فبراير 12, 2021

 ,  , 
1Department for Vascular and Endovascular Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technical University Munich, 2partner site Munich Heart Alliance, Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung (DZHK), 3Department of Vascular Surgery, University Hospital Zurich, 4Department of Experimental Cardiology, German Heart Centre, Technical University Munich

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخراج الحمض النووي شبه الآلي من الآفات المضمنة في البارافين الثابت بالفورمالين في الشرايين السباتية البشرية. يتم إجراء تحلل الأنسجة بدون زيلين سام ، والذي يتبعه بروتوكول استخراج الحمض النووي الآلي ، بما في ذلك خطوة التحلل الثانية ، وربط الحمض النووي بالجسيمات المغناطيسية للارتباط القائم على السليلوز ، وخطوات الغسيل ، وشطف الحمض النووي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل أنسجة البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) مصدرا قيما للتحليلات الجزيئية والدراسات الجينومية السريرية. غالبا ما تكون هذه الأنسجة فقيرة في الخلايا أو يصعب معالجتها. لذلك ، يجب عزل الأحماض النووية بعناية. في السنوات الأخيرة ، تم إنشاء طرق مختلفة لعزل الحمض النووي للأنسجة من العديد من الأمراض ، معظمها السرطان. لسوء الحظ ، فإن الحمض النووي الجيني المستخرج من أنسجة FFPE يتدهور بشدة بسبب الارتباط المتبادل بين خيوط الحمض النووي والبروتينات ، بالإضافة إلى الانكسار العشوائي في التسلسل. لذلك ، يتم تقليل جودة الحمض النووي من هذه العينات بشكل ملحوظ ، مما يجعلها تحديا لمزيد من التحليلات الجزيئية في اتجاه مجرى النهر. المشاكل الأخرى مع الأنسجة الصعبة هي ، على سبيل المثال ، نقص الخلايا في آفات تصلب الشرايين البشرية المتكلسة والأنسجة الدهنية ، وخزعات الجلد الصغيرة ، وبالتالي قلة توافر الأحماض النووية المرغوبة كما هو الحال أيضا في الأنسجة القديمة أو الثابتة.

في مختبراتنا ، أنشأنا طريقة لاستخراج الحمض النووي من آفات تصلب الشرايين الثابتة بالفورمالين ، باستخدام نظام عزل شبه آلي. قارنا هذه الطريقة ببروتوكولات الاستخراج الأخرى المتاحة تجاريا وركزنا على المزيد من التحليلات النهائية. تم قياس نقاء وتركيز الحمض النووي عن طريق قياس الطيف والفلورومترية. تم تقييم درجة التجزؤ والجودة الإجمالية.

تم الحصول على أعلى كمية وجودة للحمض النووي باستخدام بروتوكول الحمض النووي للدم المعدل لنظام الاستخراج الآلي ، بدلا من بروتوكول FFPE التجاري. باستخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة ، كانت غلة الحمض النووي من عينات FFPE أعلى بأربع مرات في المتوسط وفشلت عينات أقل في عملية الاستخراج ، وهو أمر بالغ الأهمية عند التعامل مع خزعات الأوعية الصغيرة. يمكن اكتشاف أحجام Amplicon من 200-800 نقطة أساس بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل تظهر هذه الدراسة أنه على الرغم من أن الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من أنسجة FFPE مجزأ للغاية ، إلا أنه لا يزال من الممكن استخدامه لتضخيم وتسلسل المنتجات الأقصر بنجاح. في الختام ، في أيدينا ، يبدو أن التكنولوجيا الآلية هي أفضل نظام لاستخراج الحمض النووي ، خاصة بالنسبة لعينات أنسجة FFPE الصغيرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تثبيت الفورمالين متبوعا بتضمين البارافين (FFPE) إجراء قياسيا للحفاظ على العينة المرضية على المدى الطويل في البنوكالحيوية 1. توفر هذه العينات مصدرا قيما للدراسات النسيجية وكذلك التحليلات الجزيئية ، وخاصة الدراساتالجينية 2. المزايا الإضافية لأنسجة FFPE هي تخزين أفضل على المدى الطويل ، وتكاليف أقل ، وظروف تخزين أسهل. هدفنا هنا هو توفير بروتوكول موثوق به وسهل الاستخدام لعزل الحمض النووي القابل للتكرار من كميات صغيرة من أقسام FFPE ، نظرا لأن استخراج الحمض النووي عالي الجودة هو الخطوة الأولى الحاسمة في مجموعة واسعة من التقنيات الجزيئية وأنسجة FFPE هي المصدر الأكثر توفرا للعينات.

تتطلب الأساليب العلمية الجديدة ، مثل تسلسل الجيل التالي (NGS) ونهج البحث "omics" ، جودة عالية للأحماض النووية3،4،5. لا يزال استخراج الحمض النووي من عينات أنسجة FFPE مسعى صعبا. يمكن أن يختلف الحمض النووي من عينات FFPE بشكل كبير من حيث الجودة والكمية اعتمادا على عمره وظروف التثبيت. الفورمالين ، المركب الأكثر استخداما ، يؤدي إلى تشابك البروتين بينالحمض النووي 6،7،8 ويسبب كسرا عشوائيا غير محدد في تسلسل النيوكليوتيدات9. قد يؤثر هذا بشكل كبير على التحليلات الجينومية النهائية ، لأن التشابك يمكن أن يعطل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)6،10. بسبب الملوثات أثناء عملية التثبيت ، غالبا ما يكون نقاء الحمض النووي المعزول من عينات FFPE محدودا. في السنوات الأخيرة ، تم إنشاء طرق مختلفة لعزل الحمض النووي ، معظمها من عينات الأنسجة السرطانية2،11،12،13.

بشكل عام ، يمكن تمييز بروتوكولات استخراج الأحماض النووية من أنسجة FFPE إلى ثلاث مجموعات رئيسية. تتضمن المجموعة الأولى والأكثر استخداما من الطرق أنظمة الأعمدة القائمة على السيليكا المتاحةتجاريا 14. تتضمن المجموعة الثانية طرق استخراج الطور العضوي اليدوية باستخدام الفينول والكلوروفورم ، والتي وصفها لأول مرة جوزيف سامبروك وديفيد دبليو راسل15. كمجموعة ثالثة ، تم إنشاء أنظمة آلية على مدى السنوات الماضية مثل أنظمة مناولة السوائل وكذلك الأنظمة القائمة على الجسيمات المغناطيسية16. ولكل نظام من الأنظمة الثلاثة المذكورة مزايا وعيوب مختلفة مثل المواد الكيميائية الخطرة (مثل الزيلين والفينول والكلوروفورم) والتكاليفالمرتفعة 17 والقوى العاملة18 واستهلاك الوقت19. على وجه الخصوص ، بالنسبة لعينة الأنسجة الصعبة بالإضافة إلى تحليلات الإنتاجية العالية ، فإن التوحيد القياسي ، والقابلية للاستنساخ ، واستهلاك الوقت المنخفض نسبيا ، والقوى العاملة ، والتكاليف هي أكثر الميزات ذات الصلة في إيجاد طريقة مناسبة لعزل الحمض النووي20. من المعروف أن طرق الاستخراج الآلي تظهر نتائج أفضل قابلة للتكرار وهي أكثر حساسية للخزعات الصغيرة. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى كمية أقل من الأنسجة أو الدم وتقليل خطر انسداد النظام بسبب الكميات الكبيرة من البارافين. على الرغم من أن آلات الاستخراج الآلي للحمض النووي والمجموعات اللازمة أغلى ثمنا مقارنة بالطرق اليدوية ، إلا أنها لا تزال مقنعة بسبب عمليات الاستخراج الأقل إشكالية. يوفر البحث في الأدبيات الكثير من المنشورات التي توضح مقارنة مباشرة بين طرق استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي اليدوية والقائمة على الأعمدة والآلية من الأنسجة والكائنات الحية المختلفة ، مثل النباتات والبشر وكذلك الخلايا في الثقافة20،21،22. هناك أيضا أدلة موجودة في الأدبيات لإظهار أن الحمض النووي والحمض النووي الريبي المعزولين من الأنسجة المجمدة المفاجئة البالغة من العمر 10 سنوات يمكن استخدامهما في التحليلات النهائية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و PCR الكمي ، و NGS ، وتحليلات المثيلة ، والاستنساخ9،23،24،25،26.

المشكلة الرئيسية ، على سبيل المثال ، في أنسجة الأوعية الدموية البشرية المسنة ، وكذلك خزعات الأنسجة الصغيرة ، خاصة فيما يتعلق بعينات FFPE ، هي نقص الخلايا في آفات تصلب الشرايين شديدة التكلسية ، مما يؤدي بالتالي إلى تركيزات منخفضة من الأحماض النووية1. على الرغم من أن العديد من الطرق لاستخراج الحمض النووي من أنسجة FFPE قد تم إنشاؤها بالفعل واستخدامها على نطاق واسع ، إلا أن طرق تحضير العينات اليدوية تتطلب وقتا عمليا طويلا27 والكواشف السامة مثل الزيلين أو الفينول ضرورية لإزالة البارافين2. كما هو موضح ، فإن عملية إزالة البارافينات هي خطوة حاسمة تستغرق وقتا طويلا (على سبيل المثال ، حوالي 30 دقيقة) تؤثر بشكل ملحوظ على جودة وكمية الحمض النووي المستخرج (على سبيل المثال ، التأثيرات السامة على الحمض النووي ، مثل تجزئة وتدهور محلول إزالة البارافينات ودرجات الحرارة المرتفعة)28. تركز بروتوكولات استخراج الحمض النووي الجديدة التي تم تطويرها مؤخرا على استخدام حلول إزالة البارافينات الأخرى غير السامة واستراتيجيات الإصلاح وتقنيات الخرز الآلي. على وجه الخصوص ، ثبت أن الطرق الآلية وشبه الآلية ناجحة في استخراج الحمض النووي مع الاسترداد الفعال ، وعدم التلوث المتبادل ، والأداء السهل29. لقد أنشأنا بروتوكولا يتغلب على هذه القيود. نتيجة لذلك ، تسمح تقنيتنا بتقليل وقت المعالجة والتدريب العملي وفقا لأعلى المعايير الكمية والنوعية.

خاصة بالنسبة للتحليلات عالية الإنتاجية القابلة للتكرار مثل التنميط الجيني ، والدراسات اللاجينية ، وتسلسل الحمض النووي الريبي ، غالبا ما يكون التعامل مع عينة FFPE باستخدام أنظمة التنقية القائمة على العمود أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا (على سبيل المثال ، خطوات إزالة التفاراث الطويلة ، وانسداد العمود ، والأوقات العملية الطويلة). انسداد أغشية السيليكا بسبب ارتفاع كمية البارافين هو المشكلة الرئيسية. الظروف الأخرى التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم عزل الأحماض النووية عالية الجودة هي كميات صغيرة من الأنسجة مثل الخزعات الدقيقة للجلد وأنسجة الفئران الصغيرة والأنسجة الدهنية جدا أو المتكلسة مثل اللويحات والأنسجة المتحجرة والعينات القديمة. خاصة في التشخيص والطب الشرعي ، أصبحت الأنظمة الآلية وشبه الآلية مثل مناولة السوائل أو طرق الاستخراج القائمة على الجسيمات المغناطيسية أكثر أهمية خلال السنوات القليلة الماضية30،31 ، ويرجع ذلك أساسا إلى الأوقات العملية المنخفضة نسبيا وإمكانية التوحيد القياسي. تعمل معظم البروتوكولات المنشورة بالفعل بشكل مثالي مع الأنسجة الملساء التي تحتوي على كميات عالية أو متوسطة من الخلايا مثل خزعات الورم أو الأنسجةالنباتية 13،22،32. الأدبيات حول طرق الطرق شبه الآلية القائمة على الجسيمات المستخدمة لعزل الحمض النووي من الأنسجة التي يصعب التعامل معها نسبيا مثل الخلايا المفردة الثابتة ، والأوعية المتكلسة ، والأنسجة الغنية بالكولاجين ، والأنسجة الدهنية ذات الأعداد المنخفضة من الخلايا ، تم وصفها بشكل سيئفقط 33.

في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة شبه آلية محسنة لعزل الحمض النووي من أقسام البارافين الوعائية المضمنة ، ومقارنتها ببروتوكولين يدويين قائمين على الأعمدة. تم استخدام كمية الحمض النووي والنقاء ومدى التجزئة للتحقق من الصحة. تم استخدام بروتوكول الحمض النووي للدم المتاح تجاريا كنقطة انطلاق وتم تحسين الخطوات اليدوية للنظام شبه الآلي لاحقا لاستخدام FFPE بالإضافة إلى عينات الأنسجة المجمدة الطازجة من الأنسجة البشرية والحيوانية ، والجمع بين خطوات FFPE وبروتوكول الأنسجة. يتم تثبيت الخطوة التلقائية لهذا البروتوكول مسبقا على الجهاز وتعتمد على المجموعة المستخدمة (هنا ، مجموعة الحمض النووي للدم). باستخدام النظام شبه الآلي القائم على الخرطوشة الموصوف ، من الممكن عزل الحمض النووي من الدم والأنسجة المجمدة الطازجة والأنسجة الثابتة بالفورمالين وحتى الخلايا المفردة بنفس البروتوكول والآلة والمجموعة والمواد الاستهلاكية ، بدلا من استخدام بروتوكولات ومجموعات مختلفة للأداة ، كما توصي بها الشركة. لا توجد سوى اختلافات طفيفة في البروتوكولات ، مثل مخزن مؤقت واحد وبعض أوقات الحضانة للتطبيقات المختلفة ، مما يجعل هذا البروتوكول مفيدا جدا لاستخراج الحمض النووي من جميع أنواع الأنسجة. تم تحسين بروتوكولنا بشكل أساسي للخلايا المتكلسة والفقيرة في الخلايا وأنسجة الأوعية الدموية البشرية الليفية ، ولكن يمكن بالطبع استخدامه وتحسينه بشكل أكبر لجميع أنواع الأنسجة الصعبة المذكورة أعلاه.

باختصار ، بالنسبة للباحثين في مجال القلب والأوعية الدموية الذين يعملون على تصلب الشرايين (على سبيل المثال ، الشريان الأورطي ، الشرايين السباتية ، الشرايين التاجية) ، نقدم بروتوكولا سهل الاستخدام ، نقطة بنقطة لاستخراج الحمض النووي شبه الآلي من عينات FFPE الوعائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الإذن بجمع عينات تصلب الشرايين السباتية البشرية في بنكنا الحيوي من قبل لجنة أخلاقيات المستشفيات المحلية (2799/10 ، Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München ، ميونيخ ، ألمانيا). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى. أجريت التجارب وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي.

1. تحضير الأنسجة

  1. قم بإعداد 5-8 أقسام نسيجية من 10 ميكرومتر من عينة FFPE باستخدام الميكروتوم ونقلها في أنبوب 1.5 مل. ليس من الضروري تقليل فائض البارافين من الكتلة.
    ملاحظة: تعمل الأقسام المفردة الرقيقة بدلا من قسم واحد كبير على تسريع تفاعل المخزن المؤقت. تجاهل الأقسام الأولى بسبب التعرض O2 . بالنسبة للعينات الأكبر حجما ، من الممكن أيضا استخدام أقسام أقل.
  2. جهاز طرد مركزي لهذه الأنابيب في جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء ، اضبطه على 5,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لجمع كل عينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    تنبيه: يؤدي الطرد المركزي الطويل جدا إلى تخثر العينة ويعقد التحلل.

2. انحلال الدهون وإزالة البارافين

ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة البارافينات وهضم الدهون. المخزن المؤقت المستخدم أقل سمية من محاليل إزالة البارافينات التجارية.

  1. أضف 300 ميكرولتر من مخزن الحضانة المتاح تجاريا و 6 ميكرولتر من 1-ثيوغليسرين لكل أنبوب.
    ملاحظة: لا تستخدم أكثر من 300 ميكرولتر لأن هذا هو الحد الأقصى لحجم خرطوشة نظام الأتمتة.
  2. دوامة لمدة 10 ثوان واحتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 80 درجة مئوية و 500 دورة في الدقيقة في كتلة تسخين لإذابة البارافين.
    تنبيه: يجب إذابة الأنسجة تماما في النهاية. إذا لزم الأمر ، دوامة عدة مرات أثناء الحضانة.

3. عينة وهضم البروتين

ملاحظة: الهضم الأصلي مع البروتياز K أمر بالغ الأهمية للحصول على مستخلصات الحمض النووي النظيفة بدون بروتينات. كما أنه يقلل من أي بروتينات ملوثة موجودة. علاوة على ذلك ، يتم تدمير النوكليازات أيضا لإنقاذ الحمض النووي34. هذه الخطوة بين عشية وضحاها ضرورية أيضا لعملية الهضم الكامل للعينة.

  1. دع العينة تبرد حتى 60 درجة مئوية ثم أضف 30 ميكرولتر من محلول البروتيناز K المقدم.
  2. دوامة مرة أخرى واحتضان الخليط عند 65 درجة مئوية و 500 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها (4-20 ساعة) في كتلة تسخين. دوامة العينات أثناء الحضانة من وقت لآخر لهضم العينة بالكامل.
    ملاحظة: تؤدي الحضانة الليلية إلى نتائج أفضل. يوصى بخطوات الخلط كل 30-60 دقيقة. في النهاية ، يجب ألا يكون هناك أي قطعة من الأنسجة المرئية داخل الأنبوب.

4. تحلل الخلايا

  1. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، الموجود في مجموعة الدم والدوامة قريبا.
  2. احتضان العينة مرة أخرى عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع 500 دورة في الدقيقة.
  3. دع العينة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. سوف يتصلب البارافين في الأعلى.
    تنبيه: لا تقم بالدوامة مرة أخرى لإبقاء البارافين منفصلا عن العينة. خلاف ذلك ، يتم خلط البارافين مع الأنسجة ، مما يؤدي إلى تدمير العينة. سيتم جمع العينة في الخطوة 6.1.

5. تحضير الخراطيش التي تم الاستغناء عنها مسبقا

  1. قم بتشغيل الجهاز ، بالإضافة إلى الكمبيوتر اللوحي المرتبط.
  2. ابدأ تشغيل تطبيق البرنامج وانقر على زر الباب لفتح الجهاز.
  3. قم بإزالة الحامل من الجهاز وأدخل الخرطوشة المعبأة مسبقا في رف المسبار. تأكد من أن الخرطوشة تنقر مرتين عندما تكون في مكانها وقم بإزالة رقائق الختم.
  4. أضف المكبس في آخر (8) بئر من الخرطوشة. إنه بمثابة طرف ماصة في الأداة.
  5. املأ أنابيب الشطف المتوفرة 0.5 مل ب 65 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف، المرفق مع المجموعة. اترك الأنابيب مفتوحة وأدخلها في الموضع المخصص في الجزء الأمامي من الحامل ، بعد الخرطوشة.
    ملاحظة: الحد الأدنى لحجم الشطف هو 60 ميكرولتر. سيفقد النظام 5-10 ميكرولتر من حجم الشطف الإضافي.

6. استخراج الحمض النووي الآلي

  1. قم بثقب البارافين بعناية أعلى أنبوب 1.5 مل من الخطوة 4.3 للوصول إلى العينة النظيفة في الجزء السفلي من الأنبوب دون خلطها بالبارافين مرة أخرى.
  2. انقل الخليط الكامل (730 ميكرولتر) من العينة المحضرة في البئر الأول من الخرطوشة.
  3. أدخل الرف في آلة استخراج الحمض النووي الآلية. تأكد من قفل الحامل في الجزء الخلفي من الماكينة أولا وفي الأمام بعد ذلك.
  4. ابدأ التشغيل بالنقر فوق الزر "ابدأ" البرتقالي العلوي الأيسر في البرنامج. سيتم فتح نافذة ببروتوكولات مختلفة مثبتة مسبقا. حدد بروتوكول الحمض النووي للدم على الجهاز. تأكد من إضافة المكبس وأنبوب الشطف والعينة بالنقر فوق نعم في البرنامج. سيغلق باب الأداة تلقائيا ، ويبدأ التشغيل (سيتحول الضوء إلى اللون الأخضر). سيستغرق السباق حوالي 38 دقيقة. ليست هناك حاجة إلى مزيد من المعايرة.
    ملاحظة: راقب حتى يلتقط النظام الغطاسات لجميع العينات الموجودة في الحامل. إذا لم يحدث ذلك، يتوقف النظام تلقائيا ويجب إعادة تشغيل بروتوكول الجهاز.
  5. تأكد من أن النظام يقوم بخطوة التحلل الآلي في البئر الأول من الخرطوشة ، متبوعا بخطوات الغسيل في الآبار من 3 إلى 7. لا توجد حاجة إلى مزيد من خطوات البرمجة. البرنامج الكامل مثبت مسبقا من قبل الشركة.
  6. بمجرد الانتهاء من ذلك ، تأكد من أن النظام يمحو الحمض النووي في أنابيب الشطف المحضرة عبر المكبس المضاف. تبقى الجسيمات المغناطيسية في المكبس. يعود المكبس في النهاية إلى آخر بئر من الخرطوشة.

7. إنهاء الجري

  1. عند اكتمال التشغيل (يظهر الجهاز ضوءا أخضر وامض) ، افتح الجهاز بالنقر فوق زر الفتح (علامة الباب) وقم بإزالة الحامل من النظام.
  2. تجاهل الخراطيش.
  3. أعد إدخال الرف الفارغ في الجهاز وأغلق الباب عبر زر الباب في الزاوية العلوية اليمنى. أغلق تطبيق البرنامج وقم بإيقاف تشغيل الجهاز ، وكذلك الكمبيوتر اللوحي.
  4. قم بتخزين المواد المعلوة عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل أو عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل أو استخدمها مباشرة للتحليل النهائي أو قياسات التركيز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإنشاء البروتوكول ، تم استخدام 5 كتل أنسجة FFPE من المرضى الذين يعانون من تصلب الشرايين في الشريان السباتي. تم عزل الحمض النووي باستخدام بروتوكول شبه آلي محسن (المجموعة C) بالإضافة إلى بروتوكولين يدويين قائمين على الأعمدة المتاحين تجاريا (المجموعة A والمجموعة B ، انظر جدول المواد). تم إجراء استخراج الحمض النووي باستخدام المجموعة A و B وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. التغيير الوحيد الذي تم إجراؤه في بروتوكول المجموعتين المتاحتين تجاريا (المجموعة A والمجموعة B): تم إجراء إزالة البارافينات في البداية مرتين ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تختلف طرق استخراج الحمض النووي لأنسجة FFPE في جودة وكمية الحمض النووي المعزول ، مما يؤثر حتما على أداء المزيد من التحليلات النهائية. وبالتالي ، أصبحت الأتمتة ضرورية لتحسين سير العمل والتوحيد القياسي ، فضلا عن إدارة الجودة. لذلك ، في هذه الدراسة ، تم تقييم طريقة شبه آلية لاستخراج الحمض النووي من عينات FFPE مما يدل على نتائج أفضل من البروتوكولات اليدوية الأخرى القائمة على الأعمدة التي تم اختبارها.

لتحسين الطريقة شبه الآلية الموصوفة ، كان هدفنا هو الحصول على بروت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم إنشاء بروتوكول استخراج الحمض النووي الآلي من قبل الدكتور بول موشلر من شركة Promega. نشكر بول موشلر على دعمه ومساهمته العلمية. نشكر أيضا زميلنا الدكتور موريتز فون شيدت (مركز القلب الألماني في ميونيخ) على تزويدنا بأداة ماكسويل ودعم الجزء التجريبي. أجريت جميع التجارب في مختبرات المركز الألماني للقلب (ميونيخ ، ألمانيا) و Klinikum rechts der Isar (ميونيخ ، ألمانيا). تم تمويل البحث من قبل DFG (PE 900 / 6-1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب 1.5 مل لحضانة العينةEppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا30120086
1-ThioglycerolPromega ، Walldorf ، ألمانياA208
برنامج محطة الشريط Agilent 3.2Agilent ، Waldbronn ، ألمانيا
dsDNA HS KitThermoFisher Scientific ، Schwerte ، ألمانياQ32851
مجموعات تنقية الحمض النووي FFPE (Kit A)Norgene Biotek ، هايدلبرغ ، ألمانيا47400
عينات أنسجة FFPE n = 5ميونيخ Vascular Biobank ، ميونيخ ، ألمانيا
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)Qiagen ، Hilden ، ألمانيا180134
كتل التسخين ، مضبوطة على 80 درجة ؛ C و 65 درجة ؛ CVWR ، دارمشتات ، ألمانيا460-0250
كواشف D5000 عالية الحساسيةAgilent ، Waldbronn ، ألمانيا5067-5593
عالية الحساسية D5000 ScreenTapeAgilent ، Waldbronn ، ألمانيا5067-5592
Incubation BufferPromega ، Walldorf ، ألمانياD920
Maxwell Blood Kit RSC بما في ذلك: Lysis Buffer ، Elution Buffer ، Proteinase KPromega ، Walldorf ، ألمانياAS1400
Maxwell RSC 48 InstrumentPromega ، والدورف ، ألمانياAS8500
طرد مركزي دقيقEppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا
NanoDrop 2000c مطيافThermoFisher Scientific ، شويرتي ، ألمانياND-2000C
أغطية بصريةAgilent ، Waldbronn ، ألمانيا401425
شرائط الأنبوب البصريAgilent ، Waldbronn ، ألمانيا401428
الماصات وأطراف الماصاتEppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا
Prism 6 للإحصاءات ، الإصدار 6.01GraphPad Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا
Qubit 3.0 مقياس الفلورThermoFisher Scientific ، Schwerte ، ألمانياQ33216
TapeStation 4200Agilent ، Waldbronn ، ألمانيا
Tecan Infinite M200 ProTecan ، M & auml ؛ nnedorf, سويسراIN-MNANO
جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251(2019).
  2. Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications. 130 (1), 118-126 (1985).
  3. Busch, A., Eken, S. M., Maegdefessel, L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Annals of Translational Medicine. 4 (12), (2016).
  4. Kandpal, R. P., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. BioTechniques. 46 (5), 351-355 (2009).
  5. McDonough, S. J., et al. Use of FFPE-derived DNA in next generation sequencing: DNA extraction methods. PloS One. 14 (4), (2019).
  6. Gilbert, M. T. P., et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when. PloS One. 2 (6), (2007).
  7. Williams, C., et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American Journal of Pathology. 155 (5), 1467-1471 (1999).
  8. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  9. Gillio-Tos, A., et al. Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39 (3), 345-348 (2007).
  10. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  11. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Experimental and Molecular Pathology. 94 (1), 121-125 (2013).
  12. Sarnecka, A. K., et al. DNA extraction from FFPE tissue samples–a comparison of three procedures. Contemporary Oncology. 23 (1), 52(2019).
  13. Kalmár, A., et al. Comparison of automated and manual DNA isolation methods for DNA methylation analysis of biopsy, fresh frozen, and formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal cancer samples. Journal of Laboratory Automation. 20 (6), 642-651 (2015).
  14. McCormick, S. F. Multilevel adaptive methods for partial differential equations. (SIAM). , (1989).
  15. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 4455(2006).
  16. Berensmeier, S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 73 (3), 495-504 (2006).
  17. Petrigh, R. S., Fugassa, M. H. DNA extraction and a cost-effective detection method for Echinococcus granulosus protoscoleces. Veterinary Parasitology. 198 (3-4), 410-413 (2013).
  18. Lee, J. H., Park, Y., Choi, J. R., Lee, E. K., Kim, H. S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Medical Journal. 51 (1), 104-110 (2010).
  19. Rohland, N., Siedel, H., Hofreiter, M. A rapid column-based ancient DNA extraction method for increased sample throughput. Molecular Ecology Resources. 10 (4), 677-683 (2010).
  20. Gutiérrez-López, R., Martínez-de la Puente, J., Gangoso, L., Soriguer, R. C., Figuerola, J. Comparison of manual and semi-automatic DNA extraction protocols for the barcoding characterization of hematophagous louse flies (Diptera: Hippoboscidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 40 (1), 11-15 (2015).
  21. Seiler, C., et al. Nucleic acid extraction from formalin-fixed paraffin-embedded cancer cell line samples: a trade off between quantity and quality. BMC Clinical Pathology. 16 (1), 17(2016).
  22. Harada, S. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples. , Springer. 125-138 (2016).
  23. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PloS One. 12 (6), 0178706(2017).
  24. Fujii, T., et al. Evaluation of DNA and RNA quality from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue for next-generation sequencing-Retrospective study in Japanese single institution. Pathology International. , (2020).
  25. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Archiv: An International Journal of Pathology. 460 (2), 131-140 (2012).
  26. Niland, E. E., McGuire, A., Cox, M. H., Sandusky, G. E. High quality DNA obtained with an automated DNA extraction method with 70+ year old formalin-fixed celloidin-embedded (FFCE) blocks from the indiana medical history museum. American Journal of Translational Research. 4 (2), 198(2012).
  27. Riemann, K., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 21 (4), 244-248 (2007).
  28. Steinau, M., Patel, S. S., Unger, E. R. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 13 (4), 377-381 (2011).
  29. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. The Journal of Molecular Diagnostics. 10 (4), 311-316 (2008).
  30. Okello, J. B., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Analytical Biochemistry. 400 (1), 110-117 (2010).
  31. Witt, S., Neumann, J., Zierdt, H., Gébel, G., Röscheisen, C. Establishing a novel automated magnetic bead-based method for the extraction of DNA from a variety of forensic samples. Forensic Science International: Genetics. 6 (5), 539-547 (2012).
  32. Ivanova, N. V., Fazekas, A. J., Hebert, P. D. Semi-automated, membrane-based protocol for DNA isolation from plants. Plant Molecular Biology Reporter. 26 (3), 186(2008).
  33. Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., Berktas, M. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. International Journal of Medical Sciences. 11 (5), 494(2014).
  34. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16 (3), 1215(1988).
  35. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  36. Khokhar, S. K., Mitui, M., Leos, N. K., Rogers, B. B., Park, J. Y. Evaluation of Maxwell 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 50 (2), 267-272 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة