يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل استقلاب الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية

6.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61466

⸱

يونيو 22, 2020

 ,  , 
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الورقة، نحن وصف طريقة لقياس تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا في الإنسان الرئيسي القاتل الطبيعي (NK) الخلايا المعزولة من الدم المحيطي، في بقية أو بعد تنشيط الناجمة عن IL15. يمكن تمديد البروتوكول الموصوف بسهولة إلى خلايا NK البشرية الأولية التي يتم تنشيطها بواسطة السيتوكينات الأخرى أو المحفزات القابلة للذوبان.

الملخص

الطبيعية القاتل (NK) الخلايا التوسط أساسا الفطرية المضادة للورم والاستجابات المناعية المضادة للفيروسات والاستجابة لمجموعة متنوعة من السيتوكينات وغيرها من المحفزات لتعزيز البقاء على قيد الحياة, انتشار الخلايا, إنتاج السيتوكينات مثل انترفيرون غاما (IFNγ) و / أو برامج السمية الخلوية. NK تفعيل الخلية من قبل تنشيط السيتوكين يتطلب إعادة عرض كبيرة من المسارات الأيضية لدعم متطلباتها الحيوية والإنقاث البيولوجية. هناك مجموعة كبيرة من الأدلة التي تشير إلى أن ضعف استقلاب الخلايا NK يرتبط بعدد من الأمراض المزمنة بما في ذلك السمنة والسرطان، مما يسلط الضوء على الأهمية السريرية لتوافر طريقة لتحديد استقلاب الخلايا NK. هنا نحن وصف استخدام محلل تدفق خارج الخلية، منصة التي تسمح قياسات في الوقت الحقيقي من تحلل واستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا، كأداة لرصد التغيرات في استقلاب الطاقة من الخلايا NK الإنسان. الطريقة المذكورة هنا يسمح أيضا لرصد التغيرات الأيضية بعد تحفيز الخلايا NK مع السيتوكينات مثل IL-15، وهو النظام الذي يجري حاليا التحقيق في مجموعة واسعة من التجارب السريرية.

المقدمة

خلايا "القاتل الطبيعي" (NK) هي الخلايا اللمفاوية الفطرية التي تتوسط الاستجابات المضادة للورم والفيروسات. تشكل خلايا NK 5-15٪ من جميع الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي البشري، ويمكن العثور عليها أيضًا في الطحال والكبد ونخاع العظام والعقد الليمفاوية. لا تعبر خلايا NK عن مستقبلات clonotypic متعددة الأشكال، مثل مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو مستقبلات الخلايا B (BCR). في المقابل، يتم دفع تفعيل وظائفها الخلوية من خلال إشراك المستقبلات التي تعترف ligands ثابت على سطح الخلية المستهدفة1،2.

يستريح الإنسان NK الخلايا المعزولة من الدم المحيطي يمكن البقاء على قيد الحياة لعدة أيام في المتوسطة الثقافة تكملها مصل الإنسان. تفعيل خلايا NK بواسطة السيتوكينات مثل IL-15 أو IL-2 يدفع الخلايا إلى الانتشار وزيادة قدرتها على القتل، من بين تأثيرات أخرى3،4،5. وقد أظهرت العديد من الدراسات وجود علاقة مباشرة بين تنشيط الخلايا NK والتغيرات في نشاطهم الأيضي6. هذه التغييرات الأيضية متجهة لتلبية الاحتياجات الخاصة للخلايا من حيث الطاقة والإنحلال الحيوي.

الخلايا الهوائية والكائنات الحصول على الطاقة من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية التي تنطوي على تقويض وأكسدة الكربوهيدرات والدهون والبروتينات. من خلال مزيج من تحلل، وحامض ثلاثي الكربوكسيلي (TCA) دورة والفوسفورة التأسد، الخلايا eukaryotic تلبية غالبية الطلب ATP والحصول على وسيطة المطلوبة ككتل بناء للجزيئات الجزيئات الأساسية لنمو الخلايا والانتشار. تبدأ عملية تحلل الجلوكوز(الشكل 1A)بدخول الجلوكوز في الخلية. في السيتوسول، الجلوكوز هو الفوسفور وتحويلها إلى بيروفات (مع صافي إنتاج 2 جزيئات من ATP لكل جزيء الجلوكوز)، والتي يمكن تخفيضها إلى اللاكتات أو نقلها إلى الميتوكوندريا ليتم تحويلها إلى أسيتيل-CoA وتدخل دورة TCA. تستمر دورة TCA في ركوب الدراجات التي تغذيها جزيئات أكثر من أسيتيل-COA وتنتج CO2 (التي ستنتشر في نهاية المطاف خارج الخلية ، ومن خلال التفاعل مع H2O في الوسط ، سوف تولد حمض الكربونيك الذي سيؤدي إلى تحمض الوسط) و NADH ، الجزيء المسؤول عن التبرع بالإلكترونات لسلسلة نقل الإلكترونات (ETC). الإلكترونات السفر من خلال مختلف مجمعات البروتين وأخيرا قبلت من قبل الأكسجين. هذه المجمعات (I, III و IV) أيضا ضخ H+ من مصفوفة الميتوكوندريا في الفضاء intermembrane. ونتيجة للتدرج الكهروكيميائي المتولدة، فإن H+ سيدخل مرة أخرى في المصفوفة من خلال V المعقدة (ATP-synthase)، باستثمار الطاقة المحتملة المتراكمة في توليد ATP.

يمكن منع كل من تحلل التحلل والتنفس الميتوكوندريا في نقاط مختلفة باستخدام مثبطات. وكان معرفة واستخدام هذه المثبطات الأساس لتطوير مقايسة التدفق خارج الخلية. من خلال قياس اثنين من المعايير البسيطة في الوقت الحقيقي مثل الهيدروجيني والأكسجين، محلل تدفق خارج الخلية يستنتج معدل تحلل الغليك والتنفس الميتوكوندريا في لوحة 96-جيدا. يتم إجراء اختبار الإجهاد تحلل في وسط القاعدية دون الجلوكوز (الشكل 1B)7. والقياسات الأولى لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) تدل على تحمض تحلل مستقل. ويشار إلى هذا التحمض غير glycolytic ويرتبط مع CO2 التي تنتجها TCA التي، كما أوضح من قبل، يجمع مع H2O في المتوسط لتوليد H+ (ECAR المرتبطة TCA). الحقنة الأولى هي الجلوكوز للحث على استخدام الجلوكوز وتعزيز تحلل الجلوكوز. الحقنة الثانية تجمع بين كل من الرتينون، مثبطات معقدة I، ومضاد مضادة للاكتئاب A، مثبط مجمع الثالث معا، لمنع الخلايا ETC تستجيب لهذا الانخفاض الكبير في إنتاج ATP الميتوكوندريا عن طريق تفعيل تحلل للحفاظ على مستويات ATP الخلوية، وهذا يمثل كمية من glycolysis التي لا تستخدمها الخلية في الحالة القاعدية ولكن يمكن أن يحتمل أن يتم تجنيدها استجابة للزيادات في ATP الطلب (تعويض الجلسانية). الحقنة الثالثة هي الجلوكوز التناظرية 2-Deoxyglucose (DG)، الذي ينافس الجلوكوز كركيزة للهكية الانزيم. لا يمكن تحويل نتاج هذا الفسفر، 2-deoxyglucose-6-الفوسفات إلى بيروفات، وبالتالي يتم حظر تحلل، مما يقلل من ECAR إلى الحد الأدنى. ويشمل قياس الـ ECAR في هذه المرحلة مصادر أخرى من التحمض خارج الخلية لا تعزى إلى تحلل التحلل أو النشاط التنفسي، وكذلك إلى أي تحلل متبقي لا يمنعه بشكل كامل 2-DG (بعد 2-DG-acidification).

يتم تنفيذ اختبار الإجهاد الميتوكوندريا في المتوسط مع الجلوكوز (الشكل 1C)8. القياسات الأولى لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) تتوافق مع الخط الأساسي لتنفس الميتوكوندريا (التنفس القاعدي). الحقنة الأولى هي أولغوميسين، الذي يمنع عودة البروتونات من خلال سينثاز ATP (V المعقدة)، وحجب تركيب ATP وبالتالي بسرعة فرط القطب غشاء الميتوكوندريا، مما يمنع ضخ البروتونات من خلال مجمعات الجهاز التنفسي، ويؤدي إلى انخفاض في OCR. وتمثل المقارنة بين التنفس الأساسي والقيمة التي تُعطى عن طريق إضافة ألتغوميسين التنفس المرتبط بـ ATP. ويسمى معدل أقليجوميسين المتبقية من استهلاك الأكسجين تسرب البروتونات، والذي يمثل تدفق البروتونات من خلال ثنائي الدهون أو البروتينات في الغشاء الميتوكوندريا الداخلية مثل النيوكليوتيدات أدينينtranslocase 9. الحقنة الثانية هي uncoupler 2،4-dinitrophenol (DNP)، وهو ionophore الذي يحفز دخول ضخمة من H+ في مصفوفة الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى إزالة القطب من غشاء الميتوكوندريا وتعطيل تخليق ATP الميتوكوندريا. تستجيب الخلايا لتبديد قوة البروتون الدافعة عن طريق زيادة معدل نقل الإلكترون واستهلاك الأكسجين إلى أقصى مستويات في محاولة عقيمة لاستعادة إمكانات الغشاء (القدرة التنفسية القصوى). والفرق بين القدرة التنفسية القصوى والتنفس القاعدي هو قدرة الجهاز التنفسي الاحتياطية للخلية، والتي تمثل كمية التنفس التي لا تستخدمها الخلية لتوليد ATP في الحالة القاعدية ولكن يمكن أن يكون من المحتمل تجنيد استجابة للزيادات في الطلب ATP أو في ظل ظروف الإجهاد8. الحقنة الثالثة هي مزيج من الروتينون ومضادات الديميسينين A. هذه الحقن توقف تماما وSOCS انخفاض OCR إلى أدنى مستوى لها، مع استهلاك الأكسجين المتبقية يجري غير الميتوكوندريا (الناجمة عن NADPH-أوكسيداسيس، الخ).

يمكن أن التغيرات في المسارات الأيضية التنبؤ بطريقة أو بأخرى عمل الخلايا NK، كما اقترح أن التنشيط المستمر للخلايا NK مع السيتوكينات في المختبر يمكن أن يؤدي إلى استنفاد الخلايا NK من خلال دراسة مسارات التمثيل الغذائي المختلفة10،11. العلاقة بين NK حالة الأيضية الخلية والوظيفة مهم جدا من وجهة نظر العلاج المناعي السرطان. في هذا المجال، تم اختبار تفعيل خلايا NK مع ضخ IL-15، وحدها أو بالاشتراك مع الأجسام المضادة العلاجية أحادية النسيلة من أجل تحسين الخلايا السرطانية قتل12،13،14. من شأن معرفة الحالة الأيضية للخلايا NK استجابة لهذه الاستراتيجيات العلاجية توفير مؤشر قيمة لحالة تنشيط الخلية NK و وظيفة القتل.

وقد وصفت دراسة المسارات الأيضية في الخلايا النخاعية واللمفاوية الأخرى مثل الخلايا الأحادية، T و B الخلايا15 والطرق الأمثل قد نشرت16. في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة تجمع بين كل من بروتوكول العزلة NK التي تعطي أعدادا كبيرة من الخلايا النقية والقابلة للحياة NK وبروتوكول محسن لقياس النشاط الأيضي باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. هنا نظهر أن هذا هو وسيلة صالحة لدراسة التغيرات الأيضية في الراحة و IL-15 تنشيط الخلايا NK الإنسان. بالنسبة للفحص الخارج عن الخلية، تم اختبار المعلمات مثل عدد الخلايا وتركيزات الأدوية وتحسينها. بالمقارنة مع أساليب التنفس الأخرى ، محلل تدفق خارج الخلية مؤتمتة بالكامل وقادرة على اختبار في الوقت الحقيقي ، مع كميات منخفضة جدا من الخلايا ، تصل إلى 92 عينات في وقت واحد ، وبالتالي يسمح بالفحص عالي الإنتاجية (مع عينات متعددة ومكررات) بطريقة سريعة نسبيا17.

يمكن استخدام هذه الطريقة من قبل الباحثين المهتمين في تقييم وظيفة الخلية NK من خلال دراسة NK استقلاب الخلية. ويمكن تطبيقه كذلك على الخلايا التي تنشطها السيتوكينات الأخرى، والأجسام المضادة أو المحفزات القابلة للذوبان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع التجارب وفقا لإعلان مبادئ هلسنكي الأخلاقية للبحوث الطبية. تم الحصول على عينات الدم الطرفية من المتبرعين من إدارة طب نقل الدم في المعاهد القومية للصحة بموجب بروتوكول 99-CC-0168 الذي تمت الموافقة عليه من IRB ، بموافقة خطية من المريض.

1- إعداد الكاشفات

  1. الكواشف لعزل خلايا NK
    ملاحظات: تحضير هذه الكواشف في غطاء لثقافة الخلية.
    1. إعداد NK العازلة الفصل: برنامج تلفزيوني ملحق (درجة حرارة 7.4) مع 1 mM EDTA و 2٪ مصل العجل الجنين (FCS) التي تم سابقا تنشيط الحرارة (في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة).
    2. إعداد NK ثقافة المتوسطة: ملحق إيسكوف وسائل الإعلام Dulbecco المعدلة (IMDM) مع مصل الإنسان 10٪ (HS). مرشّح معقم ويخزن في 2-8 درجة مئوية. تدفئة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الخلايا.
    3. Resuspend الإنسان IL-15 في برنامج تلفزيوني في 200 ميكروغرام / مل.
  2. الكواشف لمقايسة التدفق خارج الخلية
    1. إعداد وسائل الإعلام فحص: لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا المتوسطة، إضافة 1 mM بيروفات الصوديوم، 2 M L-الجلوتامين و 10 mM الجلوكوز إلى وسط قاعدة. لجليكوليس الإجهاد المتوسط اختبار، إضافة 2 M L-الجلوتامين إلى وسط قاعدة.
      ملاحظة: يتم توفير تركيزات الجلوكوز، بيروفات والجلوتامين على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة محلل تدفق خارج الخلية. ومع ذلك، يمكن تغيير تكوين وسائل الإعلام من قبل الباحثين لتتناسب تماما مع تلك من وسط الثقافة، إذا رغبت في ذلك.
    2. ضبط درجة PH من كل من وسائل الإعلام إلى 7.4 مع 0.1 N NaOH باستخدام مقياس درجة حرارة المقعد، مرشح معقمة من خلال حجم المسام 0.2 μM وتخزينها في 2-8 درجة مئوية. وسائل الإعلام الدافئة إلى 37 درجة مئوية، والتحقق من درجة حُكم الجوح وإعادة ضبطها إلى 7.4 قبل الاستخدام إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يتم احتواء CO2 المحيط فقط في الغلاف الجوي لمحلل تدفق خارج الخلية، واستخدام وسائل الإعلام دون بيكربونات أمر بالغ الأهمية.
    3. إعداد حلول الأسهم للكاشفات: Oligomycin (مثبطات ATP synthase)، 10 mM حل الأسهم في DMSO؛ 2،4-dinitrophenol (DNP، uncoupler)، 1 M حل الأسهم في DMSO؛ antimycin A (مثبطات الثالث المعقدة)، 10 mM حل الأسهم في DMSO؛ rotenone (مجمع مثبطات I)، 10 mM حل الأسهم في DMSO. جعل 30 ميكرولتر aliquots من جميع الكواشف وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الإرشادات مخصصة للكاشف التي يتم شراؤها بشكل فردي وإعدادها من قبل الباحث. إذا تم شراء الكواشف من الشركة المصنعة محلل بدلا من ذلك، اتبع المبادئ التوجيهية لإعداد الكاشف.

2. NK الخلايا العزلة من الدم المحيطي

  1. إعداد خلايا الدم الأحادية النوية الطرفية (PBMCs) من الدم البشري
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات في غطاء محرك بيانات الخلية. إزالة التلوث من جميع المخلفات والمواد التي تتلامس مع الدم مع التبييض والتخلص منها في الحاوية المناسبة لحرقها.
    1. Pipette 20 مل من متوسط الفصل الليمفاوي (LSM) في أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. بعناية، مع الحفاظ على أنبوب في زاوية 30 درجة، ماصة 20 مل من الدم على LSM، بلطف جدا ولمس جدار الأنبوب. تجنب خلط الدم مع LSM وخلق واضح ومحدد بوضوح بين السائلين.
      ملاحظة: يمكن استخدام الدم المحيطي أو منتجات leukapheresis المخصب.
    3. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 25 دقيقة، 1000 س ز في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم الفرامل، لأنها يمكن أن تجعل كلا المرحلتين في مزيج أنبوب (LSM والدم).
    4. إخراج الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي ووضعها في رف. تحقق من وجود طبقة واضحة من الخلايا (الخلايا أحادية النوى) التي سوف تتشكل في الطور البيني بين LSM (واضحة) والبلازما (الصفراء) ، في حين أن خلايا الدم الحمراء بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. استلهم بلطف طبقة الخلية أحادية النواة مع ماصة بلاستيكية 10 مل (حوالي 5-8 مل) ووضعها في أنبوب جديد مخروطي 50 مل. يمكن تجميع الليفتيوم بين الزفير يصل إلى 2 أنابيب مختلفة معا.
    6. اغسل الخلايا أحادية النوى 2x عن طريق إعادة الإنفاق في PBS 45 مل وrrifuging في 800 × ز لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة، يتم الحصول على بيليه من خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية (PBMCs) ويمكن للباحث المتابعة إلى خطوة العزل NK.
  2. NK عزل من PBMCs
    1. عد الخلايا من 2.1.6 ثم إعادة تعليقها في NK الفصل العازلة (1x 108 PBMCs / مل).
    2. تأخذ 10 مل من resuspension الخلية (109 PBMCs ) ووضعها في أنبوب 50 مل.
    3. Add 500 μL (50 μL/mL of buffer) of NK cell isolation antibody mix and 10 μL (1 μL/ mL of buffer) of anti-CD3 positive isolation antibody mix to the PBMCs and incubate at room temperature for 10 min.
    4. دوامة الخرز المغناطيسي وإضافة 1 مل إلى مزيج من PBMCs مع الأجسام المضادة (100 ميكرولتر الخرز / مل PBMCs). احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك أحيانا.
    5. إضافة 35 مل من العازلة العازلة NK العزل (3.5 مل العازلة / مل PBMCs)، مزيج ومكان على المغناطيس لمدة 15 دقيقة (2.2 × 107 PBMCs / مل). بعد ذلك الوقت، والخرز والخلايا المحددة بشكل إيجابي (جميع الخلايا ولكن NK) سوف تلتزم جدران الأنبوب.
    6. جمع بعناية فائقة (تحتوي على خلايا NK) مع ماصات بلاستيكية 50 مل دون لمس الجانبين أو الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية والطرد المركزي في 800 س ز لمدة 5 دقائق.
    8. resuspend عزل خلايا NK في 5 × 106 خلايا / مل في IMDM تحتوي على 10٪ HS ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى يتم تنفيذ التجربة.
      ملاحظة: هذا البروتوكول عزل NK الدول أرقام الخلايا وأحجام الكاشف تكييفها لاستخدام أنبوب 50 مل ومغناطيس كبير. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول (في حالة الحصول على المزيد من PBMCs) عن طريق تكرار خطوات العزل في أنابيب مختلفة أو تقليصها عن طريق تقليل حجم في الأنبوب. للأحجام النهائية من 14-45 مل ويستخدم أنبوب البوليسترين 50 مل، للمجلدات 4-14، ويستخدم أنبوب البوليسترين 15 مل، وبالنسبة للمجلدات 1-4 مل، ويستخدم أنبوب البوليسترين 5 مل. المغناطيس هو مختلف وتناسب الأنبوب المناسب في كل حالة. ويمكن أيضا أن حجم كمية من مزيج الأجسام المضادة والخرز المغناطيسي وفقا لعدد الخلايا والحجم النهائي.
  3. NK عدد الخلايا تلطيخ لتدفقات cytometry
    1. اتخاذ 0.25 × 106 خلايا لكل عينة من الخطوة 2.2.8 ، وإزالة المتوسطة عن طريق الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة صبغة قابلة للحياة وفقا لتوصية الشركة المصنعة (1 ميكرولتر من صبغة DMSO المعاد تشكيلها إلى 1 مل من resuspension الخلية) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. غسل 2x عن طريق إعادة الإنفاق في 5 مل PBS وsuguging في 800 × ز لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
    4. وصمة عار مع الأجسام المضادة المضادة للإنسان المقابلة في 100 ميكرولتر من IMDM تحتوي على 10٪ HS لمدة 30 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء (انظر الجدول 1). يمكن الجمع بين جميع الأجسام المضادة واستخدامها في خطوة واحدة تلطيخ.
    5. تحليل العينات بواسطة تدفق عملية استئصال الخلايا لتقييم نقاء NK الخلية التي تم الحصول عليها. استخدام الغوات الخلية وطريقة التحليل التي سبق وصفها18،19.
  4. تحفيز خلايا NK مع IL-15 قابل للذوبان
    1. Resuspend 0.75 × 106 خلايا من الخطوات 2.2.8 أو 2.4.3 في 100 ميكرولتر من IMDM تحتوي على 10٪ HS في بئر من 96 لوحة جيدة (مستديرة أسفل).
    2. تخفيف الإنسان IL-15 إلى 1 ميكروغرام/مل في IMDM التي تحتوي على HS 10%. أضف 100 ميكرولتر من IL-15 الإنسان المخفف إلى الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكروغرام/مل.
      ملاحظة: 0.5 ميكروغرام/مل هو تركيز تشبع من IL-15. قد يتم اختبار تركيزات أقل من IL-15 أو غيرها من السيتوكينات مثل IL-2 أو IL-12 أو IL-18 من قبل الباحثين إذا رغبت في ذلك.
    3. وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية وتحفيز ل 48 ساعة قبل إجراء فحص تدفق خارج الخلية. resuspend غير مُنَخَذ (التحكم) الخلايا في نفس التركيز والحجم في IMDM التي تحتوي على 10٪ HS دون IL-15، ووضعها في نفس الحاضنة لمدة 48 ساعة.

3. ترطيب خرطوشة الاستشعار

ملاحظة: تحتوي نصائح المسبار 96 لخراطيش الاستشعار على فلوفورات فردية ذات حالة صلبة لـ O2 و H+ التي تحتاج إلى ترطيب من أجل اكتشاف التغيرات في O2 و الرقم الـ PH.

  1. بدوره على محلل والسماح لها الاحماء تصل إلى 37 درجة مئوية.
  2. افتح حزمة خرطوشة المستشعرات وافصل خرطوشة المستشعر عن لوحة الأدوات المساعدة. إضافة 200 μL من حل الفرجان في كل بئر من لوحة فائدة ووضع مرة أخرى خرطوشة الاستشعار على لوحة، والتحقق من أن أجهزة الاستشعار مغمورة تماما في الحل. للحصول على أفضل النتائج احتضان خرطوشة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2خالية من أن يتم ترطيب بشكل صحيح لمنع التبخر. منع تشكيل فقاعة تحت أجهزة الاستشعار أثناء الترطيب.
    ملاحظة: الحد الأدنى من وقت ترطيب الخراطيش هو 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة خالية من CO2. بدلا من ذلك، ترطيب بين عشية وضحاها من خرطوشة الاستشعار مع 200 ميكرولتر من الماء المعقم في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2-الحرة،تليها حضانة خرطوشة الاستشعار مع 200 ميكرولتر من محلول الكاليبرانت قبل الدافئة 45 – 60 دقيقة قبل بدء التشغيل، ويمكن استخدامها.

4. فحص تدفق خارج الخلية

  1. إعداد لوحات لاصقة مغلفة
    ملاحظة: منذ قياس المعلمات الأيضية يحدث في غرفة نوم تتكون في الجزء السفلي من لوحة 96-جيدا، يجب أولا أن تلتزم خلايا التعليق إلى الجزء السفلي من البئر. يتم استخدام لاصقة خلية المستخرجة من بلح البحر Mytilus edulis. توصي الشركة المصنعة للصق الخلية بتركيز الطلاء من 1 إلى 5 ميكروغرام / سم2. بئر من الخلية محلل ثقافة microplate لديه سطح من 0.110 سم تقريبا2. وهكذا، فإن تركيز 5 ميكروغرام/سم2، يتطلب حوالي 0.55 ميكروغرام من المادة اللاصقة. كما سيتم استخدام 25 ميكرولتر من محلول لاصقة لمعطف كل بئر، والتركيز الحل لاصق الأمثل لصغر حجم الخلايا محلل هو حوالي 22.4 ميكروغرام / مل (22.4 ميكروغرام / مل x 0.025 مل = 0.56 ميكروغرام).
    1. إعداد 2.5 مل من محلول لاصق الخلية (22.4 ميكروغرام / مل) في 0.1 م بيكربونات الصوديوم، وhh 8.0. يوفر بيكربونات درجة الH الأمثل لأداء الخلية التي، وفقا للشركة المصنعة، هو بين 6.5 و 8.0.
    2. ماصة 25 μL من حل لاصق الخلية إلى كل بئر من لوحة المقايسة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، إزالة الحل وغسل 2x مع 200 ميكرولتر من الماء المعقم / جيدا. دع الآبار تجف من خلال الحفاظ على اللوحة مفتوحة لمدة 15 دقيقة داخل غطاء ثقافة الخلية.
      ملاحظة: قد يتم تخزين الألواح المغلفة لمدة تصل إلى أسبوع في 4 درجة مئوية.
  2. بذر الخلية في لوحات المغلفة مع لاصقة
    1. خلايا الطرد المركزي من الخطوة 2.4.3 في 200 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatants وغسل الخلايا في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا الدافئة المتوسطة (إذا كان يجري إجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا) أو اختبار الإجهاد glycolysis المتوسطة (إذا كان يجري إجراء اختبار الإجهاد glycolysis). خلايا بيليه مرة أخرى، و resuspend إلى تركيز الخلية المفضلة في نفس المتوسطة (سوف يعتمد حجم resuspension على تركيز الخلية المختارة؛ لأن كل بئر سوف تحتوي على 180 ميكرولتر من تعليق الخلية، إعداد 0.26 × 106، 0.52 × 106، 1.04 × 106، 2.08 × 106، 4.17 × 106 و 8.33 × 106 خلايا / mL تعليق الخلايا لـ 1 0.047 x 106، 0.094 x 106، 0.187 x 106، 0.375 x 106، 0.75 x 106 و 1. 5 × 106 خلايا في كل بئر).
    2. لوحة 180 μL من تعليق الخلية في كل بئر على طول الجانب من كل بئر. ويوصى الماصات متعددة القنوات. استخدم الآبار A1 و A12 و H1 و H12 من لوحة ثقافة المحلل كآبار تحكم لتصحيح الخلفية. إضافة 180 ميكرولتر من الوسيط المقايسة في هذه الآبار (لا توجد خلايا). ويمكن استخدام آبار التحكم الإضافية إذا رغبت في ذلك وإذا كان هناك مساحة كافية في لوحة.
      ملاحظة: وجود المصل قد يسبب مرفق خلية رديئة.
    3. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في CO2-حاضنة الحرة. إعداد 10x مركبات في هذه الأثناء (انظر الخطوة 4.3 أدناه).
    4. تغيير إعدادات الطرد المركزي إلى صفر الكبح. الطرد المركزي لوحة في 200 × ز لمدة 5 دقائق. مراقبة الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها تشكل أحادية الطبقة في الجزء السفلي من البئر. نقل لوحات العودة إلى CO2حاضنة الحرة لمدة 25 دقيقة. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن لا يكون إجمالي الوقت بعد الطلاء أكبر من حوالي ساعة 1.
  3. إعداد حلول العمل 10x لتحميل في خرطوشة الاستشعار
    ملاحظة: كل من النصائح 96 مسبار من خرطوشة الاستشعار الموانئ 4 (A، B، C و D) التي يمكن استخدامها لحقن المركبات بالتتابع في الآبار الفردية.
    1. لإجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا, إعداد 2.5 مل كل من 10 ميكرومتر oligomycin, 1 M DNP, وخليط من 10 ميكرومتر الروتينون و 10 ميكرومتر antimycin A, في التحاليل الإجهادية الميتوكوندريا المتوسطة (استخدام حلول الأسهم من الخطوة 1.2.3). وستكون التركيزات النهائية في البئر بعد الحقن 1 ميكرومتر أوليغوميسين، 0.1 mM DNP و 1 ميكرومتر أنتيميسين A/rotenone.
    2. لإجراء اختبار الإجهاد تحلل, إعداد 2.5 مل من خليط من 10 ميكرومتر روفينون و 10 ميكرومتر antimycin A في التحلل الإجهاد التحلل التحاليل المتوسطة (استخدام حلول الأسهم من الخطوة 1.2.3). قم بذوبان الجلوكوز في اختبار الإجهاد التحلل المتوسط لمحلول 100 mM و 2-deoxy-glucose (2-DG) في اختبار الإجهاد الجليكوليس الوسيط لمحلول 500 mM. وستكون التركيزات النهائية في البئر بعد الحقن 10 mM الجلوكوز، 1 μM antimycin A/rotenone و 50 mM 2-DG.
    3. حلول دافئة إلى 37 درجة مئوية، والتحقق من درجة حِسّه وإعادة ضبطه إلى 7.4 إذا لزم الأمر. تحميل المركبات المعدة في الخطوة 4.3.1. (لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا) أو 4.3.2 (لاختبار الإجهاد تحلل الجلوكوز) في الموانئ A و B و C من خرطوشة الاستشعار المائية (من الخطوة 3.2) باستخدام micropipettor متعددة القنوات وأدلة تحميل الميناء المقدمة مع خرطوشة، كما هو مبين في الجدول 2.
      ملاحظة: لضمان الحقن السليم في جميع الآبار أثناء الفحص، يجب أن تحتوي كل سلسلة من المنافذ المستخدمة (مثل جميع المنافذ A) على نفس حجم الحقن عبر خرطوشة الاستشعار بأكملها. وهذا ينطبق على آبار تصحيح الخلفية وحتى على تلك الآبار غير المستخدمة في التجربة.
    4. احتضان خرطوشة الاستشعار المحملة في 37 درجة مئوية في الحاضنة CO2-free أثناء إعداد البرنامج.
  4. إعداد بروتوكولات فحص تدفق خارج الخلية
    1. فتح برنامج محلل تدفق خارج الخلية، وباستخدام تعريفات المجموعة وطبقة خريطة علامات التبويب تشير إلى مجموعات من الآبار التي لديها ظروف مماثلة (على سبيل المثال، الآبار مع نفس العدد من الخلايا، أو الآبار مع خلايا يستريح أو خلايا محفّزة IL-15). كما سيتم تعيين آبار تصحيح الخلفية (افتراضياً A1 و A12 و H1 و H12، ولكن يمكن استخدام آبار إضافية) وآبار فارغة.
    2. إعداد البرنامج الموضح في الجدول 3 في البرنامج باستخدام علامة التبويب Protocol .
    3. ابدأ البرنامج باستخدام علامة التبويب "تشغيل الفحص". ضع خرطوشة المستشعر (رطبة ومحملة بمركبات 10x) ولوحة الأدوات المساعدة على الدرج. بعد خطوة المعايرة (15 - 20 دقيقة)، عند المطالبة، استبدل لوحة الفرجار لصفيحة المقايسة (بدون غطاء) بالخلايا المرفقة. بعد ذلك، يتم تشغيل الآلي بالكامل (الجهاز سوف تؤدي جميع القياسات والحقن).
      ملاحظة: من الممكن إجراء اختبار إجهاد الميتوكوندريا واختبار الإجهاد الغليكوليكي في نفس اللوحة، طالما يتم تحميل مركبات محددة في الموانئ المناسبة (oligomycin، DNP ومضادات الميميسين / الروتينون في الموانئ A، B و C على التوالي من الآبار حيث يتم إجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا; الجلوكوز, antimycin/rotenone و 2-DG في الموانئ A, B و C على التوالي من الآبار حيث يتم إجراء اختبار الإجهاد glycolysis), يتم تحديد نفس وحدات التخزين للحقن في كل سلسلة من الموانئ والآبار لكل اختبار يتم تحديدها بشكل صحيح باستخدام تعريفات المجموعة ولوحة علامات التبويب خريطة البرنامج.
    4. بعد الانتهاء من تشغيل، واسترداد البيانات وتحليلها باستخدام البرنامج.

5- تحديد رقم الخلية

ملاحظة: يمكن تسوية النتائج لحساب الاختلافات المحتملة في رقم الخلية. ويمكن استخدام نهجين رئيسيين يرد وصفهما أدناه.

  1. تحديد محتوى الحمض النووي
    1. إزالة المتوسطة ما تبقى من الفحص مع ماصة من كل بئر. عندما التعرق المتوسطة، والحرص على عدم تعكير صفو الخلايا. يمكن تخزين اللوحة في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
      ملاحظة: خطوة التجميد مهمة لتحديد محتوى الخلية الفعالة والحمض النووي.
    2. إعداد حل 1x من الخلايا انتشار التحليل الخلية- تحلل العازلة (20x) في الماء المقطر (200 ميكرولتر / بئر).
    3. إضافة الخلية انتشار صبغة الأسهم الحل (400x) في 1x الخلية- تحلل العازلة. للكشف عن 50 إلى 50.000 الخلايا في بئر، استخدم 1x خلية انتشار صبغة الفحص. بالنسبة لأرقام الخلايا الأعلى، يوصى باستخدام صبغة فحص انتشار الخلايا بتركيز نهائي أعلى من 1x. في هذه الحالة، استخدم صبغة التحليل انتشار الخلية في تركيز نهائي 5x (تمييع الخلية انتشار الأسهم التحليل الحل 80 أضعاف في 1x الخلية- تحلل العازلة).
    4. إضافة 200 μL من الخلية الكاشف انتشار إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة 2-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حماية من الضوء.
    5. قياس الفلورية للعينات عند الإثارة: 480 نانومتر؛ 480 نانومتر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر؛ 200 متر الانبعاث: 520 نانومتر باستخدام قارئ الفلورسينت microplate وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  2. تحديد محتوى البروتين
    1. بعناية، وpirate تماما وسيطة من كل بئر دون لمس الخلايا وتجميد الخلايا في -20 درجة مئويةلمدة 1 ساعة على الأقل. بدلا من ذلك، يمكن أن تبقى الخلايا المجمدة لأوقات أطول (تصل إلى 1 أسبوع) حتى يتم إجراء التحليل.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من اختبار المناعة المشعة (RIPA) تحلل المتوسطة تكملها مثبطات البروتياز 1x (من محلول الأسهم 100x) إلى كل بئر. ضع الطبق على شاكر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضن الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة لتحلل الخلية الكاملة.
    3. الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 200 × ز في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة سوف بيليه الحطام الخلوي لمنع التداخل مع قياس البروتين.
    4. قياس تركيز البروتين عن طريق حمض bicinchoninic (BCA) اختبار وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إن عزل خلايا NK من الدم المحيطي يوفر مجموعة نقية وقابلة للحياة

ويستند المقايسة تدفق خارج الخلية على قياس H+ و2 التركيز في البئر، وسوف لا تميز بين مجموعات مختلفة من الخلايا أو قدرتها على البقاء. ولهذا السبب، كان الحصول على مجموعة سكانية نقية للغاية وقابلة للحياة من خلية الاهتمام هو الخطوة الرئيسية للنجاح في هذه التجارب.

تم عزل خلايا NK من الدم المحيطي كما هو مذكور في القسم 2. من أجل تقييم نقاء وديمومة الخلايا NK التي تم الحصول ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الورقة، أنشأنا بروتوكولاً لعزل واستزراع الخلايا النقية النقية والأساسية NK البشرية من الدم المحيطي. كما قمنا بتحسين ظروف قياس النشاط الأيضي لهذه الخلايا NK التي تم تقييمها من قبل معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. بالمقارنة مع أساليب التنفس الأخرى ، محلل التدفق خارج الخلية سريع ، يتطلب أعدادًا صغيرة من الخلايا ، ويسمح بإجراء فحوصات عالية الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن الكواشف مكلفة ، وحقن المركبات تقتصر على أربعة فقط. إعادة عرض الأيض وتنشيط تحلل وفسفورية الأكسدة من قبل السيتوك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدكتور مايكل ن. ساك (المعهد الوطني للقلب والرئة والدم) على الدعم والمناقشة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل برامج البحوث داخل الأمعاء من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم. ويدعم JT من قبل برنامج رامون y Cajal (منحة RYC2018-026050-I) من MICINN (إسبانيا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5Gمركب حاقن اختبار الإجهاد Glycolyisis
2،4-Dinotrophenol (2،4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC مفكك الاقتران / اختبار الإجهاد الميتوكوندريا حاقن مركب
96 لوحة ثقافة خلية جيدة / قاع دائري مع غطاءCostar3799NK ثقافة الخلايا
Antimycin AMilliporeSigmaA8674مثبط المركب الثالث / تحلل السكر واختبار إجهاد الميتوكوندريا حاقن مركب
BD FACSDIVA SoftwareBD Biosciencesالحصول على بيانات التدفق
BD LSR FortessaBD Biosciencesالحصول على بيانات
التدفق Cell-TakCorning354240
مقايسة تكاثر الخلايا اللاصقة CyQUANTThermoFisher ScientificC7026فحص تكاثر الخلايا لقياس الحمض النووي. يحتوي على مخزن مؤقت لتحلل الخلايا وصبغة CyQUANT GR
EasySep مجموعة الاختيار الإيجابية للإنسان CD3 IIتقنيات الخلايا الجذعية17851عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من PBMCs
EasySep مجموعة تخصيب الخلايا القاتلة الطبيعية البشريةتقنيات الخلايا الجذعية19055عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من PBMCs
تقنياتالخلايا الجذعيةEasySep 18001عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من PBMCs
EDTA 0.5 M ، درجة الحموضة 8الجودة بيولوجي10128-446NK بيع عازلة فصل
أنابيب FACSFalcon-Fisher Scientific352235تجربة قياس التدفق الخلوي
Falcon 50 مل أنابيب مخروطيةFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK فصل الخلايا
مصل عجل الجنين (FCS)Gibco10437-028NK فصل الخلايا العازلة
FlowJo SoftwareBD Biosciencesتحليل بيانات التدفق
الجلوكوزMilliporeSigmaG8270مكون من وسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا. اختبار إجهاد تحلل السكر حاقن مركب
وقف مثبطات البروتياز كوكتيلThermoFisher Scientific78429مثبط البروتياز 100X. استخدم في عازلة تحلل RIPA
الإنسان IL-15Peprotech200-15-50ugتحفيز الخلايا NK
مصل بشري (HS)وادي بيوميديك9C0539NK مكمل ثقافة الخلايا المتوسطة
IMDMGibco12440053خلية NK متوسط الثقافة
L-Glutamine (200 ملم)ThermoFisher Scientific25030-081مكون من وسائط اختبار الإجهاد
LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell StainKit ThermoFisher ScientificL34965صبغة الجدوى لقياس التدفق الخلوي تلطيخ
LSMmpbio50494XPBMCs فصل عن دم الإنسان
الفأر المضاد للإنسان CD3 BV711BD Biosciences563725تلطيخ قياس تدفق الخلايا
التائية الفأر المضاد للإنسان CD56 PEBD Pharmingen555516NK قياس التدفق الخلوي تلطيخ
الفأر المضاد للإنسان NKp46 PEBD Pharmingen557991NK التدفق الخلوي تلطيخ
OligomycinMilliporeSigma75351مثبط V المركب / اختبار الإجهاد الميتوكوندريا حاقن مركب
PBS درجة الحموضة 7.4Gibco10010-023خلية NK عازلة الفصل
بيرس BCA اختبار البروتينThermoFisher Scientific23225لتحديد تركيز البروتين
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115تحلل الخلايا
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II مثبط / تحلل السكر واختبار إجهاد الميتوكوندريا حاقن مركب
Wave ControllerSoftware Agilentوحدة تحكم لبرنامج سطح المكتب Seahorse XFe96 Seahorse XFe96
SeahorseWave Agilentلتحليل البيانات
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100قاعدة فحص التدفق خارج الخلية متوسطة
Seahorse XFe96 محللAgilentExtracell
XFe96 FluxPakAgilent102416-100يتضمن 20 لوحة زراعة خلايا XF96 ، و 18 خرطوشة مستشعر XFe96 ، وأدلة تحميل لنقل المركبات إلى خرطوشة الفحص ، وزجاجة واحدة من محلول العيار (500 مل).
بيكربونات الصوديومMilliporeSigmaS5761لتحضير محلول Cell-Tak
بيروفات الصوديوم (100 مليمتر)ThermoFisher Scientific11360-070مكون من وسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا
المغناطيسية كيت Seahorse Flux

المراجع

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016(2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا القاتلة الطبيعيةمحلل التدفق خارج الخلويقياس تحلل السكرالتنفس الميتوكوندريتحفيز الإنترلوكين-15فصل اللمفاوياتقياس التدفق الخلويمعدل استهلاك الأكسجينالتحميض خارج الخلويتحليل التمثيل الغذائي الخلوي
تحليل استقلاب الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.