هنا، نقدم طريقة لتسجيل الاستجابات الكهربائية التي تثير الضوء من ظهارة صبغ الشبكية (RPE) في الفئران باستخدام تقنية تعرف باسم DC-ERGs التي وصفها لأول مرة مارمورشتاين، بيتشي، وزملاؤه في أوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تخطيط كهربائي مباشر مقرونة (DC-ERG) لتسجيل الاستجابات الكهربائية ذات الضوء المُثار من ظهارة صبغ الشبكية الماوس
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي أحادية متخصصة من الخلايا التي تقع بشكل استراتيجي بين الشبكية و choriocapillaris التي تحافظ على الصحة العامة والسلامة الهيكلية للمقبرات الضوئية. وRPE هو الاستقطاب، وعرض مستقبلات أو قنوات apically وبسيقل، ويؤدي النقل المتجه من المياه، الأيونات، المستقلبات، ويفرز العديد من السيتوكينات.
في القياسات غير الباضعة الدالة RPE يمكن إجراء باستخدام ERGs مباشرة مقرونة (DC-ERGs). كانت المنهجية وراء DC-ERG رائدة من قبل مارمورشتاين ، بيتشي ، وزملاؤه باستخدام نظام تسجيل التحفيز المصنوع خصيصًا ، وأظهر لاحقًا باستخدام نظام متاح تجاريًا. تستخدم تقنية DC-ERG الشعيرات الدموية الزجاجية المليئة بمحلول الملح المخزن (HBSS) من هانك لقياس الاستجابات الكهربائية الأبطأ لـ RPE التي تم الحصول عليها من تغيرات التركيز التي تثيرها الضوء في الفضاء دون الجانتري بسبب نشاط المستقبلات الضوئية. إن التحفيز الضوئي المطول وطول تسجيل DC-ERG يجعلانها عرضة للانجراف والضوضاء مما يؤدي إلى انخفاض العائد من التسجيلات القابلة للاستخدام. هنا، نقدم طريقة سريعة وموثوق بها لتحسين استقرار التسجيلات مع تقليل الضوضاء باستخدام ضغط الفراغ لتقليل / القضاء على الفقاعات الناتجة عن الـ هبلسزز و حامل القطب. بالإضافة إلى ذلك، يتم تخفيف التحف خط الطاقة باستخدام منظم الجهد / مكيف الطاقة. نحن نشمل بروتوكولات تحفيز الضوء اللازمة لنظام ERG المتاحة تجاريا، فضلا عن النصوص لتحليل مكونات DC-ERG: c-موجة، التذبذب السريع، ذروة الضوء، والاستجابة قبالة. نظراً لسهولة التسجيلات المحسنة وسير العمل السريع للتحليل، فإن هذا البروتوكول المبسط مفيد بشكل خاص في قياس التغيرات المرتبطة بالعمر في وظيفة RPE، وتطور المرض، وفي تقييم التدخل الدوائي.
المقدمة
ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا المتخصصة التي تصطف في الجزء الخلفي من العين وتمارس وظائف حاسمة للحفاظ على التوازن الشبكية1. RPE يدعم فوتوراسيدات من خلال تجديد الصباغ البصري التقاط الفوتون في عملية تسمى الدورة البصرية2, من خلال المشاركة في البلعومات النهارية من سقيفة الجزء الخارجي نصائح3, وفي نقل المواد الغذائية والمنتجات الأيضية بين مستقبلات فوتونية و choriocapillaris4,5. تشوهات في وظيفة RPE يكمن وراء العديد من أمراض الشبكية البشرية, مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر6,اعورة لوبير الخلقية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية الحيوانات الموضحة في بروتوكول دراسة الحيوانات الذي وافقت عليه لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في المعهد الوطني للعيون.
1. استيراد بروتوكولات التحفيز الضوئي لDC-ERG
ملاحظة: اتبع الإرشادات أدناه لاستيراد بروتوكولات تحفيز الضوء لـ DC-ERG في برنامج نظام ERG(جدول المواد). البروتوكول يتكون من 0.5 دقيقة قبل التحفيز الفاصل الزمني، تليها خطوة من الضوء (10 cd/m2)لمدة 7 دقائق، وتنتهي مع 1.5 دقيقة فترة ما بعد التحفيز. تم اختيار شدة الضوء من 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) لأنه يثير ما يقرب من نصف الاستجابة القصوى لجميع مكونات DC-ERG في WT الفئ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 2 هو عينة من مجموعة البيانات من miR-204 ko/ko cre/+ (KO الشرطي) وفئران النوع البري (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ هي فئران مع خروج المغلوب المشروط من ميكرورنا 204 في ظهارة صبغة الشبكية. يتم إنشاء هذه الفئران عن طريق عبور الفئران miR-204 مفلوكس (التي تنتجها NEIGEF)22 مع VMD2-CRE الفئران23. MiR-204 هو تعبير كبير في RPE حيث ينظم التعبير عن البروتينات الحرجة لوظيفة الظهارية التي تحافظ على سلامة تقاطع ضيق (على سبيل المثال، كلودين)، والحفاظ على التو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الهامة
يتطلب تسجيل DC-ERG الجيد أقطابًا كهربائية مستقرة خالية من الفقاعات التي تخلق القطع الأثرية والانجراف غير المرغوب فيه لأنها حساسة للغاية للتغيرات في درجة الحرارة والخروج. من الضروري أن يتم تحقيق خط أساس مستقر عندما يتم وضع الأقطاب الكهربائية في محلول حمام HBSS قبل المضي قدمًا بتسجيل الماوس. فقاعات صغيرة تميل إلى جمع في قاعدة القطب الشعري أو حول طوقا سيليكون ويصعب أن نرى مرة واحدة يتم تجميعها تماما حامل القطب. عندما فقاعات قليلة موجودة، سوف الخفقان طفيفة حامل تحري.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل صناديق داخل الثقافات. الكتاب نعترف بصدق الدكتور شيلدون ميلر لتوجيهه العلمي ، والمشورة التقنية ، والخبرة في علم وظائف الأعضاء RPE والمرض. يشكر المؤلفان ميغان كوبرا وموظفي رعاية الحيوانات على إدارة مستعمرات الماوس، والدكتور تارون بانسال وريموند تشو ويوان وانغ على الدعم الفني.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ag / AgCl (الفم) القطب الكهربائي | WPI Inc | EP1 | القطب المرجعي للفم للماوس |
| بلاط السيراميك | أداة Sutter | CTS | تستخدم لقطع الأنبوب الشعري الزجاجي إلى حجم مناسب |
| عصا تنظيف قطنية مقلوبة | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | لاستخدامها كمباعد لتحسين ملاءمة مجموعة حامل القطب |
| الكهربائي نظام الرسم الكهربائي (ERG) | Diagnosys LLC | E3 | نظام الفيزيولوجيا الكهربية البصرية لتشخيص أمراض العيون في أبحاث الرؤية وتجارب الأدوية |
| بنسن الموقد | Argos Technologies | BW20002460 | أو مكافئ لتشكيل الزجاج تحت اللهب |
| أنبوب شعري زجاجي (1.5 مم) | أدوات Sutter | BF150-75 | لملء HBSS والاتصال بالقرنية |
| هانك s محلول الملح المخزن (HBSS) Thermo | Fisher Scientific Inc | 14175-095 | متاح تجاريا. صيانة في RT |
| في الخط مرشح | Whatman | 6722-5001 | لحماية مضخة التفريغ من الهباء الجوي |
| كابل منخفض الضوضاء لحاملي الأقطاب الكهربائية الدقيقة | WPI Inc | 5372 | مقترح لتحسين طول ووضع الكابلات وتجميعات حامل القطب |
| الكهربائي وصلة الكرة المغناطيسية | WPI Inc | 500871 | لوضع مجموعة حامل القطب الكهربائي مغناطيسيا على المسرح |
| MatLab | Mathworks | MatLab: لتحرير برنامج التحليل | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox ل MatLab (مطلوب فقط لتحرير برنامج التحليل) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox ل MatLab (مطلوب فقط لتحرير برنامج التحليل وإعادة إصداره) | |
| MatLab Runtime الإصدار 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | مطلوب لتشغيل برنامج التحليل: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| حاملي الأقطاب الكهربائية الدقيقة (45 درجة) | WPI Inc | MEH345-15 | لحمل الشعيرات |
| إبرة (25 جا) | 8881250313 Covidien | لملء الأنابيب الشعرية بإبرة HBSS | |
| (أرضية) قطب | كهربائي Rhythmlink | 13 مم - واحد إلكترود | قطب إبرة تحت الجلد (أرضي) للماوس (بطول 13 مم ، إبرة قطرها 0.4 مم ، سلك رصاص 1.5 متر) |
| منظم / مكيف طاقة | فورمان | P-1800 | أو ما يعادله لإزالة إزاحة التيار المستمر من الضوضاء التي يتم إدخالها من خلال |
| حقنة خط الطاقة (12 مل) | أحادي التوجيه | 1181200777 | لملء الأنابيب الشعرية بمشبك HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | لتجميع حامل القطب الكهربائي |
| مجفف فراغ | Bel-Art | 420120000 | قاع وغطاء |
| من البولي كربونات <قوي > علاج دوائي < / قوي > | |||
| زيوت التشحيم جل العين | Alcon | 0078-0429-47 | يساعد على تليين سطح القرنية والحفاظ على التلامس الكهربائي مع الأقطاب |
| الشعرية فينيليفرين هيدروكلوريد 2.5٪ | Akorn | 17478-201-15 | قطرات العين ميدريا قصيرة المفعول (لتوسيع حدقة العين) |
| بروباراكائين هيدروكلوريد 0.5٪ | Akorn | 17478-263-12 | مخدر موضعي لتقطير العيون |
| تروبيكاميد 0.5٪ | Akorn | 17478-101-12 | قطرات العين الميدرياتية قصيرة المفعول (لتوسيع حدقة العين) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | مسكن ومرخي للعضلات |
| زيتامين (كيتامين هيدروكلورايدي) | VetOne | 501072 | مخدر للحقن العضلي |
المراجع
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
