يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كشف دور المناطق المنفصلة من دماغ الفئران في تنظيم الإباضة من خلال تعطيل عكسها بواسطة الميكروبيكشنات التيترودوتوشين

2.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61493

⸱

سبتمبر 3, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chronobiology of Reproduction Research Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Developmental Biology Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Neuroendocrinology Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 4Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, 5Department of Basic Research, Instituto Nacional de Geriatria, Ministry of Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول بناء نظام حقن دقيق منخفض التكلفة ، وزرعه الاستريوتاكسيكي في هياكل الدماغ العميق وإجراء التجسيد الدقيق في الوقت المناسب من التيترودوتوشين في الفئران المستيقظة وغير المقيدة. والهدف من ذلك هو الكشف عن مشاركة هياكل تحت المهاد في تنظيم الإباضة عن طريق تثبيط نشاطها العصبي.

الملخص

وقد استخدمت العديد من النهج التجريبية لدراسة دور الدماغ في تنظيم الإباضة. ومن الأمثلة على ذلك آفة وصمم الآذان من المجموعات العصبية، وكلاهما أساليب الغازية التي تضعف بشكل دائم سلامة المنطقة المستهدفة. وترافق هذه الأساليب آثار جانبية يمكن أن تؤثر على تحليل الآليات التنظيمية الحادة والزمنية. يسمح الزرع المجسم للقنية المرشدة التي تستهدف مناطق معينة في الدماغ ، تليها فترة نقاهة ، للباحثين بتنقيح أدوية مختلفة بعد اختفاء الآثار غير المرغوب فيها للجراحة. وقد استخدم التيترودوتوشين لتحديد أدوار العديد من مناطق الدماغ في العمليات الفسيولوجية المتنوعة لأنه يمنع بشكل عابر إمكانات العمل المعتمدة على الصوديوم، وبالتالي منع جميع الأنشطة العصبية في المنطقة المستهدفة. يجمع هذا البروتوكول بين هذه الطريقة واستراتيجيات تقييم دورة استروس والإباضة للكشف عن دور مناطق الدماغ المنفصلة في تنظيم الإباضة في أوقات معينة من أي مرحلة معينة من دورة استروس. استخدمت الفئران مستيقظا وغير المقيد(Rattus norvegicus)لتجنب آثار الحجب التي التخدير وهرمونات الإجهاد تمارس على الإباضة. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع الأنواع الأخرى وأهداف الدماغ والعوامل الدوائية لدراسة العمليات الفسيولوجية المختلفة. وتشمل التحسينات المستقبلية لهذه الطريقة تصميم نظام الاقتصاص الدقيق باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الصغير بدلا من القنية المرشدة. وهذا يقلل من كمية الأنسجة التالفة أثناء الزرع ويقلل من انتشار الأدوية المشبعة خارج المنطقة المستهدفة.

المقدمة

الإباضة هي العملية التي يتم من خلالها إطلاق بويضة واحدة أو أكثر من البويضات الناضجة من المبيضين مرة واحدة في كل دورة استرال/الحيض. وبما أن جميع أنواع الثدييات تعتمد على إنتاج الأمشاج للتكاثر، فإن فهم الآليات التي تنظم الإباضة له تأثير كبير في مجالات تتراوح بين الطب الحيوي وصناعة الماشية وصيانة الأنواع المهددة بالانقراض. وينظم الإباضة محور ما تحت المهاد- الغدة النخامية - المبيض، والذي ينطوي على عدة مناطق تحت المهاد وخارج المهاد، وغدد الغونادوتروبي في الغدة النخامية الأمامية وخلايا الثكا والجرانولوزا التي تشكل، جنبا إلى جنب مع البويضات، بصيلات المبيض داخل المبيضين1.

بصيلات المبيض تنمو وتتطور وتبيض في نهاية المطاف استجابة للإفراز منشط وتدرجي من هرمون تحفيز الجريب والهرمون اللوتين، واثنين من gonadotropins يفرزها gonadotropes. نمط إفراز gonadotropin أمر محوري للتنمية الجريبي السليم والإباضة وينظمه هرمون إطلاق gonadotropin (GnRH)1،2. يتم تصنيع هذا الببتيد العصبي من قبل الخلايا العصبية المنتشرة في جميع أنحاء الدماغ القاعدي ثم يفرز إلى الأوعية الدموية البوابة التي تربط تحت المهاد والغدة النخامية الأمامية. النشاط إفرازي للخلايا العصبية GnRH-هو بدوره تحوير مدخلات متشابك الناشئة عن هياكل الدماغ المتنوعة. تنقل هذه الهياكل معلومات عن حالة البيئة الخارجية والداخلية للكائن الحي بما في ذلك توافر الطعام وطول الخلايا الضوئية وتركيز الهرمونات في الدم. وبهذا المعنى، فإنها تشكل النمط الإنجابي لكل نوع ويجب تحديد الأدوار المحددة لهذه الهياكل من أجل فهم الآليات التي تحكم الإباضة فهما سليما. وكمثال على ذلك، تبين أن التذبذب في مستويات استراديول خلال دورة استروس ينظم إفراز GnRH؛ ومع ذلك، GnRH-الخلايا العصبية لا تعبر عن ايزوفورم مستقبلات استراديول اللازمة للكشف عن مثل هذه التغييرات. وتقع مجموعتان من الخلايا العصبية التي تعبر عن هذه المستقبلات في المنطقة المحيطة بالبطين الوردي من البطين الثالث وفي نواة أركوات، على التوالي، ونقاط الاشتباك العصبي الطعنية مع الخلايا العصبية GnRH. هناك أدلة تشير إلى أن هذه الخلايا العصبية تفسير تركيز استراديول ومن ثم تحفيز نشاط الخلايا العصبية GnRH عن طريق الإفراج kisspeptin, محث قوية من إفراز GnRH3.

التجارب التي تنطوي على الآفات الثيرمية أو الكيميائية، وكذلك الصمم الميكانيكي، سمحت للباحثين بتحديد تورط العديد من هياكل الدماغ في تنظيم الإباضة4،5،6،7،8،9،10،11،12 . ومع ذلك ، فإن هذه التجارب لها عيب كونها الغازية والصدمة ، التي تتطلب عدة أيام من الشفاء قبل تقييم آثار العلاج ، مما يعوق تحليل الآثار الحادة للعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تؤثر بشكل دائم على المناطق المستهدفة وتعطل العمليات الفسيولوجية الأخرى على المدى الطويل. وبسبب هذه المشاكل، عادة ما تحجب الآليات التعويضية الهوستاتيكية في جسم الحيوان نتائج هذه التجارب، واستخراج معلومات دقيقة عن الديناميات التنظيمية الزمنية التي تشارك فيها المنطقة أمر صعب إلى حد ما.

الميكرويينجيكت من الأدوية التي تعطل بشكل عابر نشاط الخلايا العصبية من خلال القنية دليل هو بديل مناسب يتجاوز عيوب المذكورة أعلاه. يمكن وضع القنية في أي منطقة في الدماغ عن طريق جراحة ستيريوتاكسيك ، مما يسمح للباحث ببدء العلاج من المخدرات بعد اختفاء الآثار المحيرة للجراحة. يسمح الفحص الدقيق في الوقت المناسب للأدوية للباحثين باختبار الفرضيات المتعلقة بمساهمة المنطقة في خطوة معينة من العملية ويمكن إجراؤها في مقيدة أو حرة الحركة مستيقظة. يمكن أن يتم حقن مجموعة متنوعة من الأدوية بما في ذلك التخدير الموضعي وناهضات ومضادات الآلام العكسية والسموم البيولوجية مثل التيترودوتوكسيين (TTX) في منطقة الاهتمام في أوقات محددة.

TTX هو السم البيولوجي توليفها من قبل البكتيريا التي تعيش في الجسم من النفخة، فضلا عن الفقاريات واللافقاريات الأخرى. TTX يسكت النشاط العصبي من خلال الحصار الانتقائي والعابرة لقنوات الصوديوم، مما يؤدي إلى تثبيط إمكانات العمل التي تعتمد على الصوديوم. في وجود TTX ، تواجه الخلايا تغييرا في مرحلة إزالة الاستقطاب وبالتالي فهي ليست مثيرة ولكنها لا تزال على قيد الحياة. يتم تفسير تأثير حجب TTX بتكوينه الجزيئي: مجموعة جوانيدينيوم قادرة على المرور عبر الجانب خارج الخلية من قناة الصوديوم ، ولكن بقية الجزيء لا يمكن أن يمر بسبب حجمه ، لذلك فهو عالق ويمنع القناة13،14،15،16،17 . سمحت آلية عمل TTX باستخدامها كأداة لدراسة الجهاز العصبي في المختبر وفي الجسم الحي. وقد استخدمت الحقن داخل الدماغ من هذا السم لدراسة دور مناطق الدماغ منفصلة في عدة عمليات مثل الاحتفاظ الذاكرة18, النوم والإثارة19, مكان الاعتراف20, الملاحة المكانية21, تعاطي المخدرات22, التنظيم الحراري23, تطورالفصام 24, السلوك الجنسي25 وتنظيم الإباضة26 من بين أمور أخرى. في هذا البروتوكول نقوم بوصف الآثار على الإباضة من تعطيل عابرة من نواة تحت المهاد بواسطة الميكرويكشن TTX في الفئران مستيقظا وغير المقيد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ووافقت لجنة الأخلاقيات التابعة لأعضاء هيئة التدريس في سرقسطة، التابعة لأعضاء هيئة التدريس في سرقسطة، على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات. وتعمل هذه المؤسسة وفقا للقواعد المكسيكية للتعامل مع الحيوانات، المعيار الرسمي: NOM-062-ZOO-1999، الذي يتفق مع المبادئ التوجيهية الدولية.

1. بناء القنية الثنائية

  1. استخراج رمح الفولاذ المقاوم للصدأ من محور اثنين من الإبر تحت الجلد 23 G باستخدام ملاقط الضغط ومن ثم إزالة أي الغراء المتبقية باستخدام شفرة مشرط.
  2. رسم خط 15 ملم وبصرف النظر عن نهاية حادة من مهاوي مع علامة دائمة غرامة. استخدام ملاقط القطع لإزالة نهايات مشطوف.
  3. عقد شرائح 15 ملم مع hemostats غرامة واضغط عليها عموديا مع قرص قطع تعلق على أداة دوارة حتى يتم الحصول على شرائح 14 ملم من الأنابيب. ويتم هذا الخطوة من أجل القضاء على الجزء المغلق من مهاوي، وخلق نهايات مفتوحة وصريحة. وأخيرا، أدخل إبرة 30 G من خلال شرائح للقضاء على أي عرقلة داخلية.
  4. تحديد المسافة بين هياكل الاهتمام في نصفي الكرة الأرضية الأيسر والأيمن من الدماغ بمساعدة أطلس الدماغ27. استخدام الطين moldering لإرفاق اثنين من شرائح 14 ملم إلى شريحة المجهر وضمان أن كلا على نفس المستوى الأفقي. مراقبة من خلال ميكرومتر العين (10x) وضبط شرائح مع ملاقط غرامة حتى يتم الحصول على المسافة المطلوبة.
  5. مزيج عجينة لحام مع حمض الهيدروكلوريك 10٪ في نسبة 2:1 وإضافة قطرة من الخليط 2 مم تحت نهاية حادة من شرائح. لحام كلا القطاعين مع نقطة واحدة باستخدام الحديد لحام وسلك لحام 0.5 ملم قطرها. تأكد من أن لحام لا يعرقل تجويف من شرائح.
  6. إنشاء دعم لإرفاق القنية إلى حامل stereotaxic عن طريق قطع قطعة 10 ملم من الأسلاك المرنة الفولاذ المقاوم للصدأ 0.3 ملم. استخدام الطين moldering لوضع 2 مم من السلك في اتصال مع نقطة لحام السابقة والباقي وضع فوق نهاية حادة من cannulas. لحام السلك إلى القنية.
  7. تنظيف سطح القنية مع الإيثانول 70٪ لإزالة فائض من عجينة لحام. تدفق المناطق الداخلية من cannulas مع الماء العقيم لإزالة الجسيمات المعدنية. كرر هذه العملية حتى لا يمكن الكشف عن أي جزيئات تحت المجهر في التكبير 10x.

2. بناء العناد والقبعات

  1. لبناء القواطع قطع اثنين من شرائح 16 ملم من الأسلاك الناعمة الفولاذ المقاوم للصدأ جولة (0.35 ملم من القطر). عقد cannula الثنائية مع hemostats، عمودي على مقاعد البدلاء مختبر، وإدراج واحدة من هذه الأجزاء في كل قنية حتى تصل إلى مقاعد البدلاء. ثني بقايا في زاوية 90 درجة.
  2. للقبعات قطع اثنين من شرائح 2 ملم من أنابيب السيليكون (القطر الداخلي = 0.76 ملم) وتطبيق قطرة من الغراء السيليكون في واحدة من نهايات كل قطعة. لا تدع الغراء للدخول إلى الأنابيب. يترك لتجف لمدة 24 ساعة على الأقل.

3. بناء المفاعلات الدقيقة

  1. كرر الخطوة 1.1، وذلك باستخدام الإبر تحت الجلد 30 غرام بدلا من ذلك لإنشاء مهاوي.
  2. رسم خط 18.5 ملم وبصرف النظر عن نهاية حادة من مهاوي وإزالة بقايا نهايات مشطوف مع ملاقط القطع.
  3. كرر الخطوة 1.1 بإبرة واحدة 23 G لبناء محولات عن طريق قطع جزأين بطول 6 مم بدءا من النهاية الحادة.
  4. القضاء على الأجزاء المغلقة من شرائح 6 ملم عن طريق الضغط عليها عموديا ضد القرص قطع حتى يتم الحصول على محولات 4 ملم اثنين. القضاء على أي عرقلة داخلية.
  5. أدخل الطرف المجسم من شرائح 30 G في المحولات. ننظر من خلال مجسم لضمان أن نهاية كل من, شرائح والمحولات, هي في نفس المستوى. تطبيق الغراء سيانواكريلات على المفصل القاصي باستخدام مسحة القطن والسماح لتجف لمدة 15 دقيقة.
  6. نقع اثنين من موصلات أنابيب تفلون في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق ومن ثم إرفاقها بالموصلات الدقيقة من خلال المحولات. انتظر حتى يتقلص قطر الموصلات لمدة 24 ساعة على الأقل ثم قم بتعقيم المميكرونكتور بطريقة درجة حرارة منخفضة لتجنب تلف الموصلات (يوصى بتعقيم أكسيد الإيثيلين).

4. صيانة الحيوانات ومسحات المهبل

  1. استخدام الجرذان الإناث الإناث مقنعين دوري(Rattus norvegicus, CIIZ-V سلالة) وزنها بين 230 و 260 غرام. منزل الفئران في مجموعات من أربعة في أقفاص البولي بروبلين القياسية في غرفة مع 14:10 ضوء الظلام photoperiod. حدد درجة الحرارة والرطوبة عند 22 ± 2 درجة مئوية و40٪ على التوالي. توفير الغذاء والماء الإعلانية libitum.
  2. تناولي مسحات مهبلية كل يوم بين الساعة 10:00 و12:00 س.
    1. تعقيم حلقة البكتريولوجية المعدلة مع قطر داخلي من 1 ملم باستخدام مصباح الكحول وتبريده بالماء العقيم. عقد الجرذ مع قبضة آمنة وإدخال 5 ملم من حلقة البكتريولوجية في المهبل، ولمس جدرانه الداخلية. إزالة الحلقة البكتريولوجية. إذا نجحت، سيتم رؤية قطرة غائمة في الطرف. ضع هذه القطرة على شريحة المجهر.
    2. كرر هذه العملية لكل الفئران تعقيم وتبريد الحلقة بين كل.
    3. بعد قطرات تجف، وصمة عار مع hematoxylin-eosin ومراقبة العينات تحت المجهر في 10x.
    4. تحديد نسبة الكريات البيض والخلايا الظهارية النواة والخلايا الكيراتينية على كل تشويه وتصنيفها وفقا لمعايير مراحل دورة استروس المبلغ عنها في الشكل 1، والذي يتفق مع الأدب السابق28،29.

5. زرع ستيريوتاكسيك من cannulas

ملاحظة: إجراء زرع القنية بعد عملية جراحية ستيريوتاكستيك مطهر العادية والالتزام بالمعايير المؤسسية.

  1. قبل الجراحة
    1. تعقيم الأدوات الجراحية، القنية، مسامير الجراحية، العناد، الشاش ومسحات القطن الخشبي 24 ساعة قبل الجراحة باستخدام الأوتوكلاف البخار. تعقيم نصائح من الأدوات المعدنية بين العمليات الجراحية المتتالية عن طريق تنظيفها مع بيروكسيد الهيدروجين 10٪ تليها المياه ومن ثم وضعها في معقم حبة ساخنة.
    2. إعداد مناطق العمل وأداة ستيريوتاكسيك قبل إزالة الحيوان من المنزل. إعداد الحيوان للجراحة في منطقة تقع إلى أقصى حد ممكن من طاولة الجراحة لتجنب التلوث أثناء العملية.
    3. تنظيف مناطق التحضير والجراحة مع الإيثانول 70٪ تليها تطبيق محلول كلوريد 10٪ لمدة عشر دقائق. تنظيف قاعدة, الإطار والمتلاعبين من الصك ستيريوتاكسيك مع الإيثانول 70٪ وتعقيم نصائح من قضبان الأذن باستخدام معقم حبة ساخنة والهواء تبريد لهم قبل الجراحة.
    4. إجراء الجراحة مرتديا معطف مختبر مخصص، قناع الوجه، غطاء الرأس، الأكمام الجراحية، أغطية الأحذية والقفازات الجراحية. اطلب من المساعد إعداد الحيوانات للجراحة والتحقق من حالتها العامة أثناء العملية.
    5. إرفاق القنية إلى حامل ستيريوتاكسيك. اطلب من المساعد إحضار أول يتم تشغيله في الغرفة. حدد الفئران في ديستروز لعملية جراحية، منذ الملاحظات من مختبرنا تشير إلى أن هذه الحيوانات استرداد دورات استروس السليم أسرع من الفئران التي تعمل في مراحل أخرى، وربما لأن الاستجابة للتغيرات الإجهاد جنبا إلى جنب مع دورة استروس.
    6. وزن الحيوان، والحث على التخدير مع 4٪ isoflurane في الأكسجين 100٪ داخل غرفة التعريفي للفئران متصلة المبخر isoflurane. لتجنب الضغط على الحيوانات، لا تملأ الغرفة مسبقا. تأكد من وجود مستوى جراحي للتخدير عن طريق التحقق من تمدد البؤبؤ وفقدان الألم كما يقاس باختبارات قرصة الذيل والأذن بعد ملاحظة فقدان رد الفعل الأيمن.
      1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط من الكيتامين (100 ملغ / كغ) وإكسيلازين (10 ملغ / كغ) إذا لم يتوفر مرذاذ ايزوفلوران.
    7. إزالة الفئران من غرفة التعريفي واستخدام مخروط الأنف في الجدول إعداد للحفاظ على آثار التخدير مع 2.5٪ isoflurane في الأكسجين 100٪. تقليم شعر فروة الرأس مع مقصات وإزالة الشعر فضفاضة مع بكرة الوبر. حقن جرعة تحت الجلد قبل الجراحة من 2 ملغم / كغ من ميلوكسيكام و 5 ملغم / كغ من إنروفلوكساسين كمضاد للالتهابات غير الستيرويدية / مسكن والمضادات الحيوية، على التوالي.
      1. ضعي الدموع الاصطناعية الهيبروميلوز على كل عين لتجنب الجفاف أثناء الجراحة.
    8. جبل الحيوان في الصك ستيريوتاكسيك فوق لوحة الاحترار باستخدام قضبان الأذن غير تمزق وقناع التخدير. ضبط المشبك الأنف لضمان أن رأس الحيوان هو شقة. إجراء فرك الجراحية في منطقة حلق بالتناوب بين بوفيدوني اليود مع الصابون و 70٪ الإيثانول مرة واحدة ومن ثم استخدام بوفيدوني اليود و 70٪ الإيثانول مرتين. أدخل ميزان حرارة المستقيم لتسجيل درجة حرارة الحيوان أثناء العملية ثم قم بتغطيته بمجال جراحي معقم.
  2. أثناء الجراحة
    1. استخدم مشرط لإجراء شق 2 سم في الجلد والعضلات في منتصف منطقة حلق. إزالة periosteum من الجمجمة باستخدام مسحة القطن المغلفة مع بيروكسيد الهيدروجين 2٪ للكشف عن bregma أو لامبدا، والمعالم التي سيتم استخدامها لحساب الإحداثيات المستهدفة. جفف الجمجمة بالهواء للحصول على تصور أفضل للمعلم.
    2. استخدام المتلاعبين من أداة ستيريوتاكسيك لنقل cannula إلى موقف مباشرة فوق المعلم المفضل. تسجيل الخلفي الأمامي والإحداثيات الجانبية الوسيطة من أداة ستيريوتاكسيك واستخدامها لحساب إحداثيات المنطقة المستهدفة وفقا لأطلس الدماغ27.
    3. تعيين الإحداثيات المحسوبة في أداة ستيريوتاكسيك ووضع غيض من القنية على سطح الجمجمة. تسجيل تنسيق الظهر والبطين واستخدامه لحساب العمق إلى المنطقة المستهدفة.
    4. قم بإزالة ذراع المتلاعب عن طريق فكه من الإطار. استخدمي نتوء أسنان موصولا بأداة دوارة بسرعة 15,000 دورة في الدقيقة لوضع علامة في المكان الذي سيتم فيه إجراء عملية استئصال القحف. ثم استخدم التجشؤ لإجراء ثلاثة ثقوب ، وتشكيل مثلث متساوي الأضلاع حول العلامة. هذه الثقوب يجب أن لا تخترق الجمجمة. أدخل البراغي الجراحية في الثقوب، وضمان وضعها بإحكام.
    5. جعل استئصال القحف واسعة بما يكفي لاستيعاب المسافة بين المناطق المستهدفة في كل نصف الكرة الأرضية. وينبغي أن يكون صغيرا في القطر ممكن ولكن كبيرة بما يكفي للسماح لخفض القنية دون لمس حدود الجمجمة، لأن هذا سوف يعدل المسار. إجراء عملية استئصال القحف تدريجيا، وتطبيق أدنى ضغط ممكن. جمجمة القوارض ليست سوى بضعة ملليمترات سميكة وأنه من المحوري للحفاظ على سلامة الأنسجة أدناه.
    6. مرة واحدة في ماتر دورا مرئية، واستخدام إبرة عقيمة 21 G مع طرف منحني في زاوية 90 درجة لإزالة شظايا العظام وجعل قطع الأمامي الخلفي في السحاي. استخدام Wirtshafter والزملاءتقنية 30 لتجنب الأضرار التي لحقت الجيوب الأنفية القوس متفوقة إذا كانت المنطقة المستهدفة تقع بالقرب من خط الوسط.
      1. ضع الحامل مع القنية في الإطار واستخدم المتلاعب الظهري البطني للوصول إلى التنسيق البطني. تأكد من أن الإبرة لا تلمس الحدود أثناء النزول وزيادة قطر فغر القحف إذا لزم الأمر.
        ملاحظة: من المهم أن تستهدف أطراف قنية الدليل منطقة تتراوح بين 0.5 إلى 2.0 مم فوق منطقة الاهتمام. ويرجع ذلك إلى رد الفعل الالتهابي للدماغ استجابة لإدخال أجسام غريبة وتدمير الأنسجة. وهذا أمر بالغ الأهمية بصفة خاصة إذا كانت منطقة الاهتمام صغيرة ويجب حساب مسافة العمل تجريبيا مسبقا.
    7. تطبيق الاسمنت الأسنان لإرفاق القنية إلى الجمجمة والسماح لها الجافة. تأكد من أن الاسمنت الأسنان لا تغطي نهاية حادة من القنية لأن هذا سوف عرقلة لا رجعة فيه. انتظر حتى يتماسك الإسمنت تماما.
    8. أدخل العناد لتجنب المزيد من العوائق وضمان الباحة أثناء الدراسة. وضع على غطاء السيليكون لتجنب التلوث.
  3. بعد الجراحة
    1. استبدل السوائل المفقودة بحقن داخل الصفاق بمقدار 1.0 مل من المحلول الملحي المعقم في درجة حرارة فسيولوجية. ضع الحيوان في قفص الإنعاش مع الدعم الحراري حتى يتعافى من التخدير. تحقق من درجة الحرارة ومعدل الموقد / الجهاز التنفسي للحيوان بشكل دوري. آثار Isoflurane تستمر لبضع دقائق بعد انقطاع تدفق الغاز في حين أن آثار الكيتامين / xylazine يستمر لمدة 40-50 دقيقة.
    2. توفير حقن ما بعد الجراحة من المضادات الحيوية والمسكنات والأدوية المضادة للالتهابات (بنفس الجرعات والطرق المذكورة من قبل) لمدة 48-72 ساعة وفحص الحيوانات عن كثب على أساس يومي لبقية التجربة. الإبلاغ عن أي علامة على الألم أو الإجهاد أو فقدان الوزن إلى الخدمات البيطرية أو إلى عضو مدرب في المختبر. لا تؤدي أي تلاعب آخر للفئران خلال هذه الفترة.
    3. ابدأي في أخذ اللطاخات المهبلية بعد العلاج بعد الجراحة و استمري في القيام بذلك حتى يظهر الحيوان ثلاث دورات استروس متتالية من أربعة أيام.
      ملاحظة: يمكن زرع القسطرة الوداجية المزمنة جراحيا، مما يسمح للباحث بأخذ عينات دم متسلسلة لتحليل إفراز هرمونات مثل استراديول وبروجيستيرون وتستوستيرون وهرمون اللوتين وهرمون تحفيز الجريبات والكورتيكوسترون. نوصي بوضع مثل هذه القسطرة بمجرد تعافي الحيوان من جراحة الدماغ ، لأن هذا سيحسن معدل البقاء على قيد الحياة مع تجنب انسداد القسطرة الذي قد ينتج عن فترة نقاهة ممتدة.

6. معالجة التيترودوتوشين وإعداد الحلول

تنبيه: TTX هي واحدة من المواد الأكثر سمية المعروفة. وهو يعمل على عضلات الهيكل العظمي والأنسجة العصبية. التسمم عن طريق الاتصال غير محتمل ولكن أي جرح مفتوح هو مسار محتمل للتلقيح في الجسم. المخاوف الرئيسية عند العمل مع TTX هي ثقب الجلد بأدوات حادة كانت على اتصال مع السم وتوليد الهباء الجوي الذي قد يصل إلى الفم والعينين والأغشية المخاطية. اعتمادا على الجرعة، قد تكون TTX قاتلة إذا تم استنشاقها أو ابتلاعها أو تلقيحها من قبل الجلد. وسوف يسبب تهيج قوي في العينين. وقد تم اختبار LD50 في الفئران عن طريق الحقن عن طريق الفم والوريد وهو 334 ميكروغرام / كجم و 7.3 ميكروغرام / كجم ، على التوالي. لا يوجد مضاد للسموم في هذا الوقت.

ملاحظة: مادة تعطيل هو NaOCl 1.0٪ مع أو بدون 0.25 N NaOH، أو محلول التبييض 10٪. يحدث تعطيل كامل بعد التعرض 30 دقيقة. لا يمكن تعطيل TTX تماما بأي مشتق كلوريد بتركيز أقل من 10٪، عن طريق الالاستعباد التلقائي أو عن طريق التعقيم بالحرارة الجافة في درجة حرارة أقل من 500 درجة فهرنهايت. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على TTX من قبل اثنين من الأفراد المطلعين يرتدون أزواج داخلية وخارجية من قفازات النتريل، معطف المختبر مخصصة، ونظارات السلامة، قناع الوجه المتاح، والأحذية المغلقة والسراويل كاملة الطول.

  1. إعداد حل المخزون
    1. ضع وسادة غارقة بالمادة المعطلة في غطاء الدخان لمنع التلوث في حالة حدوث تسرب. تأكد من أن غطاء الدخان يعمل بشكل صحيح قبل البدء. إعداد وعاء مع حل تعطيل للتخلص من نصائح ماصة.
    2. Resuspend معقم TTX citrate مسحوق lyophilized وفقا لتعليمات الشركة المصنعة من قبل المعايرة دقيقة للغاية وبطيئة مع السائل النخاعي الاصطناعي العقيم، الشطف أسفل جدران القارورة في هذه العملية. تجنب تشكيل الرغوة والهباء الجوي. اتبع تقنية مطهرة لتجنب تلوث محلول TTX لأنه سيتم حقنه في دماغ الحيوانات الحية. استخدم حقنة باستخدام إبرة بدلا من مكروبايت إذا كان لقنينات TTX غشاء خارجي لمنع تكوين الهباء الجوي.
    3. Aliquot حل الأسهم في أنابيب صغيرة معقمة. جعل aliquots صغيرة قدر الإمكان منذ تجميد / ذوبان دورات قد يغير من استقرار الجزيئات. لا تملأ أكثر من نصف الأنابيب لأن الماء يزيد في الحجم عند تجميده، مما قد يؤدي إلى فتح الغطاء وتلوث الأنبوب والعينات الأخرى المخزنة في الحاوية.
    4. إزالة التلوث من السطح الخارجي للأنابيب والأسطح حيث تم استخدام TTX مع المادة المعطلة. تخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية في مربع قارورة داخل حاوية ثانوية.
  2. تمييع محلول المخزون إلى تركيز عمل
    1. إعداد حلول مخففة حديثا في اليوم الذي سيتم استخدامها منذ حلول مخففة هي أقل استقرارا. ضع وسادة غارقة بالمادة المعطلة في غطاء الدخان ورف أنبوب صغير فوقه. إعداد وعاء مع حل تعطيل للتخلص من نصائح ماصة.
    2. ماصة محلول المخزون في الجزء السفلي من microtube معقمة ومن ثم إضافة كمية محسوبة من السائل النخاعي الاصطناعي لتحقيق تركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر. كما هو موضح لإعادة تعليق مسحوق TTX ، قم بإجراء تمييز دقيق وبطيئ للغاية ، وشطف جدران القارورة وتجنب تكوين الرغوة والهباء الجوي.
    3. إذا تم استخدام العينات التي كانت على الفريزر لإجراء التجريب الدقيق، يجب السماح لها بالتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجربة.

7. microinjection من TTX أو حلول السيارة في الفئران تتحرك بحرية

  1. تكوين مضخة microinjection مع معدل التسريب والوقت الإجمالي للحقن وفقا للتجربة. حساب هذه المعلمات مقدما بالنظر إلى حجم المحتلة من قبل الهيكل المستهدف وكمية الحل ليتم حقنها. لهذه التجربة حقن 200 nL من الحل بمعدل 50 nL في الدقيقة الواحدة لمدة ضخ مجموع 4 دقائق.
  2. ملء اثنين من المحاقن هاملتون 10 ميكرولتر مع الماء المقطر العقيم، إدراج قطعة من أنابيب تفلون العقيمة في موصل أنابيب كل microinjector، وضمان أن طول الأنابيب لا تقيد حركة الفئران (أنابيب يمكن تعقيمها باستخدام أكسيد الإيثيلين).
  3. ضع وسادة غارقة في المادة المعطلة ومربع 2 سم × 2 سم من فيلم البارافين فوقه. ماصة كمية كافية من TTX لملء إبرة من حاقن و 1 سم من أنابيب فوق الفيلم. امتصاص انخفاض TTX عن طريق التراجع بلطف المكبس. جبل المحاقن في مضخة microinjection واستخدام ضوابطها للتلاعب المكبس حتى يمكن رؤية قطرة من TTX في غيض من كل microinjector. تجاهل قطرات في لوحة غارقة مع مادة معطلة.
  4. حدد الفئران التي سيتم حقنها على متنها. استخدم الفئران فقط التي أظهرت ثلاث دورات متتالية على الأقل بعد الجراحة. النظر في مرحلة من الدورة والوقت من اليوم. كل من الوقت والمرحلة يعتمد على فرضية محددة أن تقوم باختبار, لهذه التجربة 14:00 ساعات من proestrus المحددة منذ إشارات ما قبل الإباضة العصبية التي تحكم إفراز GnRH التدريجي تحدث في هذه اللحظة. نقلهم إلى الغرفة حيث سيتم الحقن داخل أقفاص الإسكان الخاصة بهم لتجنب الضيق.
  5. عقد الجرذ مع قبضة ثابتة، وإزالة الغطاء والعناد من cannulas، إدراج المحفزات الدقيقة في cannulas دليل وإعادة الحيوان إلى القفص.
  6. تشغيل المضخة والانتظار حتى ينتهي microinjection. مراقبة الحيوان خلال هذه الفترة من أجل الكشف عن مفرزة ممكنة من microinjectors وتجنب التواء أنابيب تفلون.
  7. اترك الحاقنات الدقيقة في مكانها لمدة دقيقتين إضافيتين لتجنب ارتجاع المحلول. إزالتها، وتنظيف سطح الزرع مع محلول مطهر iodopovidone، وتجنب تدفقها داخل cannulas دليل. أدخل العنادات العقيمة، وضعت على الغطاء والعودة الحيوان إلى غرفة المستعمرة. مراقبة الحيوان دوريا للكشف عن أي آثار جانبية محتملة للدواء.
  8. قم بتشغيل المضخة بنفس المعلمات أثناء إجراء الميكرويكشن وتحقق من وجود تدفق صحيح لضمان الاحتفاظ بباتينسي النظام أثناء الإجراء.
  9. اضغط المكبس لطرد TTX / السيارة من microinjector حتى تصل فقاعة الهواء إلى طرف الإبرة. تذكر TTX في اليوتيوب الخاص بها. ملء المحقنة بالماء المقطر واستخدامها لتنظيف المناطق الداخلية من الأنابيب. تجاهل الماء في المادة المعطلة وتكرار هذه العملية ثلاث مرات على الأقل. تنظيف الجزء الخارجي من المحاقن والأنابيب والمحاقن الدقيقة بقطعة قماش غارقة في المادة المعطلة.

8. القتل الرحيم ومعالجة الأنسجة

  1. في يوم استروس المتوقعة أو المؤكدة عن طريق المهبل، وحقن الفئران مع جرعة زائدة داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (75 ملغم /كغ). تحقق من فقدان الوعي وحقن 200 nL من محلول أزرق ميثيلين 0.5٪ من خلال قنية الدليل كما هو موضح في الخطوات 7.1 إلى 7.9. تحقق من وجود علامات الألم باستخدام إصبع القدم أو الذيل قرصة الاختبار، وإذا لم يتم الكشف عن أي منها، وقطع رأس الفئران باستخدام مقصلة القوارض.
  2. استخدم مقص لفتح تجويف البطن والعثور على المبيضين. استخدام مقص القزحية غرامة لتشريح كل المبيض، وقطع عند تقاطع الرحم البوق بمساعدة عدسة مكبرة. تجنب إتلاف المستقيم لأن هذا سيؤدي إلى فقدان البويضات.
  3. وضع المبيضين تحت مجسم واستخدام شفرة حلاقة لإزالة جميع الأنسجة الدهنية دون الإضرار بالأعضاء. إزالة المبيض من كل المبيض عن طريق قطع مع شفرة الحلاقة قدر الإمكان من منطقة أمبولا. جبل كل oviduct على شريحة مختلفة وتغطي مع قطرة من الماء. تخزين المبيضين في قارورة تحتوي على محلول بوين.
  4. جفف القنوات بلطف بمنشفة ورقية ماصة وابحث عن أمبولا تحت المنظار المجسم. مع اليد غير المهيمنة، عقد oviduct في مكان عن طريق قرص بعيدا عن أمبولا مع إبرة 23 G، ثم استخدام إبرة أخرى 23 G في اليد المهيمنة لجعل شق 1 ملم في المنطقة الوسطى من أمبولا. سوف تبرز مجمعات الركاميات البويضات من الشق كقطر من السائل اللزج(الشكل 2D). استخدام الإبرة في اليد المهيمنة لسحب بلطف وببطء قطرة بعيدا عن oviduct. اضغط على بقايا أمبولا لضمان عدم ترك البويضات في الداخل. استخراج البويضات من oviducts في أسرع وقت ممكن كما الجفاف من oviduct سوف فخ لا رجعة فيه البويضات داخل.
  5. إزالة oviduct من الشريحة والانتظار حتى قطرة من السوائل التي تحتوي على البويضات يجف. وصمة عار العينة مع الهيماتوكسيلين-إيوسين. استخدام تركيب المتوسطة إلى coverslip. مراقبة تحت المجهر (10x) لتحديد عدد البويضات التي يلقيها كل المبيض.
    ملاحظة: لا يتم إجراء التضحية عن طريق التخثر القلبي في هذا البروتوكول لأن البويضات ستكون محاصرة في القنوات القلبية وبالتالي ستكون الطرق النسيجية ضرورية لتقييم الإباضة. إذا كان يجب على المستخدم التغلغل لتحليل الأنسجة الأخرى ، يمكن إزالة المبيضين أولا والشرايين التنازلية فرضت مع hemostats سميكة تحت الكبد لتجنب تسرب المثبتة.
  6. إزالة الجلد من الرأس وغمر الجمجمة في وعاء زجاجي مع محلول 10٪ الفورمالين. السماح تثبيت الرأس لمدة عشرة أيام على الأقل قبل إزالة القنية لتجنب تشويه الأنسجة. لإزالة القنية، استخدم مقص لفصل جميع العضلات في المنطقة من الجمجمة التي تحيط به. قطع بين الأنف والعظام الأمامية مع التشذيب العظام ومن ثم إزالة العظام القذالي. إدراج غيض من التشذيب في ماغنوم foramen والبدء في قطع من خلال قمم القوس الوصول إلى بقايا عظم الأنف.
  7. يجب أن تحتوي المنطقة المعزولة في الجزء العلوي من الجمجمة على العظام الأمامية والبارية. إزالة القنية المزروعة تعلق على الجزء العلوي من الجمجمة عن طريق سحب ببطء حتى عموديا على الرأس. قطع أي جزء المرفقة من السحايا مع مقص القزحية غرامة لتجنب تشوه في الدماغ.
  8. جعل قطع الأمامي الخلفي على السحاي ووضعها جانبا لإزالة الدماغ من قاعدة الجمجمة. أدخل ملاقط حادة أسفل المصابيح الشمية وسحب بلطف حتى الدماغ حتى الأعصاب البصرية مرئية. قطع الأعصاب مع مقص القزحية غرامة وسحب الدماغ. الحفاظ على الدماغ في حل التثبيت.
  9. الحصول على 50 ميكرومتر أقسام سميكة من الدماغ باستخدام هزاز، جبل لهم في الشرائح المغلفة بولي-L-يسين (0.1٪ في الماء المقطر) وصمة عار مع تقنية نيسل. مراقبة الشرائح تحت المجهر (10x) لتحديد الموقف النهائي من cannulas (الشكل 2A - 2C) وانتشار الصبغة بمساعدة أطلس دماغ الفئران27.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم اختبار البروتوكول المذكور أعلاه من خلال تقييم آثار TTX أو مركبة واحدة (السائل النخاعي الاصطناعي؛ ACSF) microinjection في واحدة من نواتين مختلفتين معروفتين بالمشاركة في تنظيم الإباضة في الجرذ: النواة السوبراشية والنواة الأركواتية. تم اختيار النواة السوبراشية لأنها تحتوي على جهاز تنظيم ضربات القلب المركزي في الثدييات. وتشارك في تنظيم الأحداث الدورية وإفراز gonadotropins. تم اختيار نواة arcuate لأنها تحتوي على مجموعة من الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات استراديول ، مما يحفز إفراز GnRH خلال معظم الدورة الاستروس. تم إج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توضح هذه المقالة طريقة لتثبيط بشكل عابر، في أي وقت من الأوقات، منطقة منفصلة في الدماغ من الفئران مستيقظا وغير المقيد. كما يتم توفير طريقة بسيطة لتتبع دورة استروس وتقييم الإباضة. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل مباشر لمساهمة مناطق الدماغ المحددة في الآليات التي تدفع الإباضة من خلال مقارنة النتيجة الإباضة للحيوانات المعالجة ب TTX مع تلك المعالجة بالمركبات. باستثناء أداة ستيريوتاكسيك ومضخة microinjection ، والتي هي شائعة في مختبرات علم الأعصاب ، وهذه الطريقة لا تتطلب مواد باهظة الثمن. القنية التجارية والمقننات الدقيقة هي ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه فيما يتعلق بهذه المقالة.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لريمون سانشيز في جامعة واشنطن على مساعدته القيمة في تحرير المخطوطات وعلى M.Sc جورجينا كورتيس M.Sc سينتيا خافيير على دعمهما التقني في توحيد هذه التقنية. كما أننا ممتنون لأعضاء الخدمات البيطرية في كلية الدراسات العليا سرقسطة: MVZ. أدريانا ألتاميرانو، MVZ. رومان هيرنانديز وMVZ. دولوريس إليزابيث غوزمان لصيانة ممتازة ورعاية الحيوانات التجريبية. تم دعم التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول برقم منحة DGAPA-PAPIIT: IN216015 ورقم منحة كوناسيت: 236908 لروبرتو دومينغيز. كارلوس كاميلو سيلفا هو طالب دكتوراه من برنامج الدكتوراه في السيكولوجيس، جامعة ناسيونال أوتونوما دي ميكسيكو (UNAM) ويدعمه المجلس الوطني للكنسية (رقم المنحة: 294555).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 و مو ؛ محاقن L هاميلتونهاميلتون80314
21 جم × 1 بوصة إبرة مهيبة من الفولاذ المقاومللصدأ BD305165
23 جم × 1 بوصة إبرة مغناطيسية من الفولاذ المقاوم للصدأBD305145
30 جم × 1/2 بوصة إبرة مغناطيسية من الفولاذ المقاوم للصدأBD305106
السائل الدماغي النخاعي الاصطناعيBASiMD-2400
أداة تشذيب العظامأدوات العلوم الدقيقة16152-12
لدغ للحفر الصغيرأدوات العلوم الدقيقة19007-05
ClipperWahl
قطع القرصDremelSM5010
ملاقطTruper17367
Cyanocrylate الغراءكولا لوكا K-1
أسمنت الأسنانNic Tone
EnrofloxasinSenosiain
EosinSigmaE4009
EstereoscopeZeiss
مقص بون ناعمللغاية أدوات العلومالدقيقة 14084-08
قناع الوجهLanceta HG60036
ملقط Graefeأدوات العلوم الدقيقة11050-10
الهيماتوكسيلينسيجماH3136
Hemostatsأدوات العلوم الدقيقة13008-12
معقم الخرزة الساخنةأدوات العلوم الدقيقة18000-45
حمض الهيدروكلوريكسيجما320331
هيبروميلوز دموع اصطناعيةمختبرات صوفيا8950015
إيزوفلورانبيزا أجروبيكوريا
MeloxicamAranda1183
مضخة الحقن المجهريKD Scientific788380
مونومرNic Tone
MototoolDremel3000
قفازات النتريلLanceta HG69028
قضبان الأذن غير الممزقةDavid Kopf Instruments855
بولي إل ليسينسيجماP4707
بوفيدون اليودديرمو دين
بوفيدون اليود مع الصابونGermisin espuma
ملاقط الضغطTruper17371
قناع تخدير الفئرانديفيد كوبف إنسترومنتسموديل 906
محلول ملحيPISA
أدوات العلوم10004-13
شفرة مشرطأدوات العلوم الدقيقة10015-00
الصوديوم بنتوباربيتالبيزا Agropecuaria
حامل القطب القياسيديفيد كوبف إنسترومنتس1770
أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأتقويم الأسنان الأمريكي856-612
جهازStereotaxicديفيد كوبف إنسترومنتسموديل 900LS
أدوات العلوم الدقيقة الجراحية14001-12
موصلات تفلونBasiMD-1510
أنابيب تفلونBasiMF-5164
TetrodotoxinAlomone labsT-500
VaporizerKent ScientificVetFlo
قطع الدقيقة للمشرط

المراجع

  1. Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
  2. Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
  3. Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
  4. Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
  5. Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
  6. Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
  7. Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
  8. Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
  9. Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
  10. Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
  11. Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
  12. Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
  13. Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
  14. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
  15. Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
  16. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
  17. Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
  18. Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
  19. Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
  20. Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
  21. Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749(2013).
  22. Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
  23. Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
  24. Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
  25. Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
  26. Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
  27. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
  28. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  29. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538(2012).
  30. Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
  31. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
  32. Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
  33. Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
  34. Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
  35. Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
  36. James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
  37. Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
  38. Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
  39. Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
  40. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082(2010).
  41. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  42. Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716(2008).
  43. Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
  44. Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  45. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  46. de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
  47. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تعطيل مناطق الدماغتقييم دورة الشبقتنظيم الإباضةالزرع بالتوجيه المجسمالقنيات المرشدةالحصر العصبي العكوسنوى دماغ الجرذمراحل دورة الشبقرسم خرائط الدوائر العصبية
كشف دور المناطق المنفصلة من دماغ الفئران في تنظيم الإباضة من خلال تعطيل عكسها بواسطة الميكروبيكشنات التيترودوتوشين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.