مقالة منهجية

تحليل نظم الاستجابة العصبية الالتهابية والديناميكا الدموية لإصابات الدماغ الرضحية

DOI:

10.3791/61504

⸱

مايو 27, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طرقا لتوصيف الاستجابة العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة ودمج هذه البيانات كجزء من تحليل الأنظمة متعددة المتغيرات باستخدام الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs) مشكلة صحية عامة كبيرة. يمكن أن يؤدي التعرض المتكرر ل mTBI إلى عجز وظيفي تراكمي طويل الأمد. أظهرت العديد من الدراسات التي أجرتها مجموعتنا وغيرها أن mTBI يحفز التعبير عن السيتوكين وينشط الخلايا الدبقية الصغيرة ، ويقلل من تدفق الدم الدماغي والتمثيل الغذائي ، ويضعف التفاعل الدماغي الوعائي. علاوة على ذلك ، أبلغت العديد من الأعمال عن وجود ارتباط بين الاختلالات في هذه العلامات العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية والإعاقات المعرفية. هنا نفصل طرق لتوصيف استجابة الأنسجة العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية ل mTBI في الفئران. على وجه التحديد ، نصف كيفية إجراء نموذج انخفاض الوزن من mTBI ، وكيفية قياس تدفق الدم الدماغي طوليا باستخدام تقنية بصرية غير غازية تسمى التحليل الطيفي للارتباط المنتشر ، وكيفية إجراء مقايسة مناعية متعددة الإرسال من Luminex على عينات أنسجة المخ لتحديد كمية السيتوكينات وبروتينات الفوسفو المناعية (على سبيل المثال ، ضمن مسارات MAPK و NFκB) التي تستجيب وتنظم نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا المناعية العصبية الأخرى. وأخيرا، نفصل كيفية دمج هذه البيانات باستخدام نهج تحليل النظم متعددة المتغيرات لفهم العلاقات بين كل هذه المتغيرات. إن فهم العلاقات بين هذه المتغيرات الفسيولوجية والجزيئية سيمكننا في النهاية من تحديد الآليات المسؤولة عن mTBI.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظره عامه
تؤثر إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs) على حوالي 1.6-3.8 مليون رياضي سنويا1. هذه الإصابات، بما في ذلك الإصابات تحت الارتجاج والارتجاج، يمكن أن تترك المرضى مع أعراض جسدية وعاطفية ونفسية ومعرفية عابرة2. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي mTBI المتكرر (rmTBI) الذي يتم الحفاظ عليه داخل "نافذة الضعف" إلى شدة تراكمية ومدة العواقب المعرفية التي تستمر لفترة أطول من آثار mTBI واحد وحده3 ، وفي النهاية حتى إلى فقدان دائم للوظيفة 4,5,6. على الرغم من أن العديد من المرضى يتعافون في إطار زمني قصير نسبيا (<1 أسبوع) ، إلا أن 10-40٪ من المرضى يعانون من آثار أطول أمدا ل mTBI لمدة شهر واحد > ، مع استمرار بعضها لمدة تصل إلى سنة واحدة 3,7,8,9. وعلى الرغم من ارتفاع معدل انتشار هذه الإصابات وعواقبها الدائمة، فإن آليات الإصابة غير مفهومة بشكل جيد ولا توجد استراتيجيات علاجية فعالة.

وبالنظر إلى التباين الكبير في النتائج بعد mTBI/rmTBI، فإن أحد التحديات في تحديد المحفزات الجزيئية في المراحل المبكرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها في دراسات mTBI/rmTBI الطرفية هو عدم وجود بيانات طولية تظهر "روابط جزيئية حادة" نهائية لهذه المحفزات الجزيئية إلى نتائج طويلة الأجل. للتغلب على هذا التحدي ، اكتشفت مجموعتنا أن انخفاض تدفق الدم الدماغي بشكل حاد تم قياسه بشكل حاد باستخدام أداة بصرية تسمى التحليل الطيفي للارتباط المنتشر (DCS) ، يرتبط ارتباطا وثيقا بالنتيجة المعرفية طويلة الأجل في نموذج الماوس من rmTBI10. باستخدام هذه العلامة الحيوية الديناميكية الدموية ، أظهرنا أن الفئران ذات التدفق الدماغي المنخفض بشكل حاد (وبالتالي ، النتيجة المتوقعة على المدى الطويل الأسوأ) لديها زيادات حادة مصاحبة في إشارات الفوسفو العصبية داخل كل من مسارات MAPK و NFκB ، وزيادات في التعبير العصبي للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وزيادات في التعبير عن البلعمة / علامة الخلايا الدبقية الدقيقة Iba111 . تشير هذه البيانات إلى دور محتمل لإشارات الفوسفو العصبية ، والتعبير عن السيتوكين ، وتنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة في كل من التنظيم الحاد لتدفق الدم الدماغي بعد الإصابة وكذلك في إطلاق سلسلة إشارات تؤدي إلى خلل وظيفي عصبي ونتائج معرفية أسوأ. هنا ، نفصل نهجنا في التحقيق في وقت واحد في كل من البيئة الديناميكية الدموية والعصبية بعد rmTBI وكيفية دمج مجموعات البيانات المعقدة هذه. على وجه التحديد ، نوجز إجراءات لأربع خطوات رئيسية لهذا النهج الشامل: (1) نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة ، (2) تقييم تدفق الدم الدماغي مع التحليل الطيفي للارتباط المنتشر ، (3) تحديد كمية البيئة الالتهابية العصبية ، و (4) تكامل البيانات (الشكل 1). أدناه ، نقدم مقدمة موجزة لكل خطوة من هذه الخطوات الرئيسية للمساعدة في توجيه القراء من خلال الأساس المنطقي وراء أساليبنا. يوفر الجزء المتبقي من المخطوطة بروتوكولا مفصلا لكل خطوة من هذه الخطوات الرئيسية.

نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة
على الرغم من وجود العديد من النماذج الممتازة قبل السريرية ل TBI الخفيف المتكرر 12،13،14،15،16،17،18 ، فإننا نستخدم نموذجا راسخا ومناسبا سريريا لإصابات الرأس المغلقة لانخفاض الوزن. تشمل السمات الرئيسية لهذا النموذج (1) التأثير الحاد للجمجمة / فروة الرأس السليمة متبوعا بدوران غير مقيد للرأس حول الرقبة ، (2) عدم وجود إصابة هيكلية علنية في الدماغ ، وذمة ، تلف حاجز الدم في الدماغ ، موت الخلايا الحاد ، أو فقدان أنسجة المخ المزمن ، و (3) العجز المعرفي المستمر (حتى عام واحد) الذي يظهر فقط بعد ضربات متعددة19 (الشكل 2).

تقييم تدفق الدم الدماغي باستخدام التحليل الطيفي للارتباط المنتشر
التحليل الطيفي للارتباط المنتشر (DCS) هو تقنية بصرية غير جراحية تقيس تدفق الدم5،20،21. في DCS ، يتم وضع مصدر ضوء قريب من الأشعة تحت الحمراء على سطح الأنسجة. يتم وضع كاشف على مسافة ثابتة من المصدر على سطح النسيج للكشف عن الضوء الذي يتكاثر المتناثر عبر الأنسجة (الشكل 3). يؤدي تشتت خلايا الدم الحمراء المتحركة إلى تقلب شدة الضوء المكتشفة مع مرور الوقت. يستخدم نموذج تحليلي بسيط يعرف باسم نظرية انتشار الارتباط لربط تقلبات الشدة هذه بمؤشر تدفق الدم (CBFi ، الشكل 4). على الرغم من أن وحدات CBF i (سم2 / ثانية) ليست وحدات التدفق التقليدية (مل / دقيقة / 100 جم) ، فقد أظهرت دراسة سابقة أجريت على الفئران أن CBFi يرتبط ارتباطا وثيقا بتدفق الدم الدماغي الذي يقاس بالدوران الشرياني المسمى التصوير بالرنين المغناطيسي21.

للإشارة ، تم بناء أداة DCS المستخدمة هنا داخليا وتتكون من ليزر بطول تماسك طويل 852 نانومتر ، ومجموعة من 4 صمامات ثنائية ضوئية لحساب الفوتون ، ولوحة ارتباط تلقائي للأجهزة (تاو واحد ، 8 قنوات ، 100 نانو ثانية الحد الأدنى لوقت العينة) 21,22. يتم الحصول على البيانات باستخدام برنامج محلي الصنع مكتوب في LabView. تتكون الواجهة الحيوانية للجهاز من ألياف مصدر متعددة الأوضاع 400 ميكرومتر (نطاق الطول الموجي 400-2200 نانومتر ، نواة السيليكا النقية ، تكسية TECS الصلبة) وألياف كاشف أحادية الوضع 780 نانومتر (نطاق الطول الموجي 780-970 نانومتر ، نواة السيليكا النقية ، الكسوة الصلبة TECS ، قطع الوضع الثاني 730 ± 30 نانومتر) متباعدة 6 مم ومدمجة في مستشعر أسود مطبوع 3D (4 مم × 8 مم ، الشكل 3).

تحديد كمية البيئة العصبية الالتهابية
على الرغم من أن الالتهاب العصبي يتم تنظيمه من خلال عمليات خلوية متنوعة ، إلا أن هناك آليتين رئيسيتين ذات صلة هما الإشارات خارج الخلية بواسطة السيتوكينات / الكيموكينات والإشارات داخل الخلايا بواسطة بروتينات الفوسفو. للتحقيق في البيئة العصبية الالتهابية للدماغ بعد الإصابة ، يتم استخراج الأدمغة من الفئران ، والتشريح المجهري ، ويتم تحديد كمية السيتوكينات / الكيموكينات والبروتينات الفوسفو باستخدام Luminex (الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7). تتيح المقايسات المناعية متعددة الإرسال من Luminex التحديد الكمي المتزامن لمجموعة متنوعة من هذه البروتينات عن طريق اقتران مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) بالخرز المغناطيسي الموسوم بالفلورسنت. يتم استخدام علامات الفلورسنت المميزة لكل بروتين ذي أهمية ، ويتم تشغيل حبات كل علامة مع جسم مضاد التقاط ضد هذا البروتين المحدد. يتم خلط مئات الخرز لالتقاط كل بروتين معا ، وتوضع في طبق بئر 96 ، وتحضن مع العينة. بعد حضانة العينة ، يتم استخدام مغناطيس لحبس الخرز في البئر أثناء غسل العينة. بعد ذلك ، يرتبط الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل بالتحليل ذي الأهمية لتشكيل شطيرة مستضد الأجسام المضادة على غرار ELISA التقليدي ، ولكن مع ELISA لكل بروتين يحدث على حبة مختلفة موسومة بالفلورسنت. إضافة الستربتافيدين المقترن بالفيكويريثرين (SAPE) يكمل كل تفاعل. ثم تقوم أداة Luminex بقراءة الخرز وفصل الإشارة وفقا لكل علامة / بروتين فلورسنت.

تكامل البيانات
نظرا للعدد الكبير من التحليلات (على سبيل المثال ، السيتوكينات) التي تم قياسها في فحص Luminex ، قد يكون من الصعب تفسير تحليل البيانات إذا تم تحليل كل بروتين كمي على حدة. لتبسيط التحليل والتقاط الاتجاهات التي لوحظت بين التحليلات، نستخدم طريقة تحليل متعددة المتغيرات تسمى الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى (PLSR، الشكل 8)23. يعمل PLSR من خلال تحديد محور الأوزان المقابلة لكل بروتين تم قياسه (أي السيتوكينات أو بروتينات الفوسفو ، والتي يشار إليها باسم "متغيرات التنبؤ") التي تفسر معا على النحو الأمثل التباين المشترك للبروتينات المقاسة مع متغير الاستجابة (على سبيل المثال ، تدفق الدم الدماغي). يشار إلى الأوزان باسم "الأحمال" ويتم تجميعها في متجه يعرف باسم المتغير الكامن (LV). من خلال إسقاط (يشار إليها باسم "تسجيل") بيانات البروتين المقاسة على كل من LVs اثنين ، يمكن إعادة رسم البيانات من حيث هذه LVs. بعد حساب PLSR ، نستخدم دوران varimax لتحديد LV جديد يزيد من التباين المشترك بين إسقاطات العينة على LV ومتغير التنبؤ24. يسمح لنا هذا النهج بتعريف LV1 على أنه المحور الذي يتم فيه شرح تباين متغير الاستجابة بشكل أفضل. يزيد LV2 من التباين المشترك بين متغير الاستجابة والبيانات المتبقية LV1 ، والتي قد تكون مرتبطة بالتباين البيولوجي أو التقني بين العينات. أخيرا ، نجري التحقق من صحة Leave One Out Cross (LOOCV) للتأكد من أن نموذج PLSR لا يعتمد بشكل كبير على أي عينة واحدة23.

في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل طرق لتوصيف استجابة الأنسجة العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية ل mTBI. ويرد في الشكل 1 موجز لسير العمل العام. في هذا البروتوكول ، تخضع الفئران لواحد أو أكثر من mTBIs باستخدام نموذج إصابة الرأس المغلق بانخفاض الوزن. يتم قياس تدفق الدم الدماغي طوليا قبل الإصابة وفي نقاط زمنية متعددة بعدها. في الوقت المناسب نقطة الاهتمام للاستجواب من التغيرات الالتهابية العصبية ، يتم القتل الرحيم للحيوان ، ويتم استخراج الدماغ. يتم عزل مناطق الدماغ ذات الأهمية عن طريق التشريح المجهري ثم يتم تحليلها لاستخراج البروتين. ثم يتم استخدام الليزات لكل من المقايسات المناعية متعددة الإرسال من لومينكس للسيتوكين وتعبير بروتين الفوسفو وكذلك اللطخة الغربية. وأخيرا، يتم دمج مجموعة البيانات الشاملة هذه باستخدام تحليل انحدار جزئي للمربعات الصغرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة إيموري (IACUC) واتباع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة

  1. قم بإعداد إعداد خفض الوزن. قم بتركيب وجه على سطح مستو باستخدام أنبوب توجيه بطول 1 متر (قطر داخلي 2.54 سم) محاذاة رأسيا (تحقق باستخدام مستوى). استخدم مسمارا بوزن 54 جم (قطر الجسم الأساسي 0.95 سم ، قطر الرأس 2 سم ، طول 10.2 سم) للتأثير.
  2. تخدير الماوس لفترة وجيزة. حث الماوس مع 4.5 ٪ من الايزوفلوران في الأكسجين 100 ٪ لمدة 45 ثانية. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم.
  3. الحث على الإصابة.
    1. قم بإزالة الماوس بسرعة من التخدير ووضع الماوس عرضة على وسط غشاء رقيق (نسيج 11.2 سم × 21.3 سم).
    2. استخدم كلتا يديك لتثبيت الأنسجة المشدودة مع وجود الماوس في المنتصف. قم بتأمين ذيل الماوس تحت الإبهام. ضع رأس الماوس تحت أنبوب التوجيه (الشكل 2).
    3. قم بإسقاط الترباس من أعلى أنبوب التوجيه على الجانب الظهري من رأس الماوس ، بهدف التأثير بين الجزء الخلفي من العينين والجزء الأمامي من الأذنين. عند الاصطدام ، سوف يخترق الماوس الأنسجة ، مما يسمح بالتسارع السريع للرأس حول الرقبة (الشكل 2).
  4. الانتعاش
    1. بعد الاصطدام ، ضع الماوس ضعيفا على وسادة تسخين 37 درجة مئوية في هواء الغرفة. راقب التعافي لمدة 1 ساعة بعد الإصابة. في غضون 1 ساعة ، يجب أن تكون الفئران قادرة على التجول بشكل طبيعي ، والعثور على الطعام والماء ، وعدم إظهار عجز حركي جسيم.
      ملاحظة: لا يتم استخدام التسكين وفقا لموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، وهو أمر مبرر بسبب التأثير المربك للتسكين على المعلمات ذات الاهتمام (أي تدفق الدم الدماغي ، علامات الالتهاب). من المتوقع فقدان الوعي ، الذي يعرف بأنه الوقت من الإزالة من التخدير إلى وقت استعادة رد الفعل التصحيحي ، ويستمر عادة من 20 ثانية إلى 3 دقائق (الجدول التكميلي 1). يمكن ملاحظة نوبات قصيرة (<30 ثانية) من انقطاع النفس و / أو النشاط الشبيه بالنوبات ، خاصة بعد إصابات الرأس المتكررة المتباعدة مرة واحدة يوميا.
  5. كرر حسب الحاجة. قد تتكرر هذه الإصابة مرة واحدة يوميا أو أسبوعيا أو شهريا. يعتمد عدد الإصابات وتباعدها على شدة الإصابة المطلوبة. عادة ، نستخدم خمس ضربات متباعدة مرة واحدة يوميا للحث على عجز قوي في التعلم المكاني والذاكرة.
    ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة أن خمس ضربات متباعدة مرة واحدة يوميا كافية للحث على العجز في التعلم المكاني والذاكرة التي تستمر لأكثر من 1 سنة بعد الإصابة دون وذمة أو نزيف أو إصابة هيكلية علنية للدماغ19. يتم وزن الفئران يوميا ومراقبتها عن كثب بحثا عن علامات الجفاف والعجز الحركي وفقدان الشهية. إذا كانت الفئران تعاني من الجفاف ، يتم إعطاء تشاو رطب وحقن تحت الجلد من 1 مل من المياه المالحة مرة واحدة يوميا. من أجل منع المعاناة غير الضرورية وضمان نقطة نهاية إنسانية ، يتم القتل الرحيم للفئران إذا: استمر الجفاف أو تفاقم >24 ساعة بعد العلاج الملحي تحت الجلد ، وانخفض وزن الجسم بأكثر من 20٪ من خط الأساس قبل الإصابة ، ويظهر العجز الحركي مثل الدوران أو سحب الكفوف ويستمر >1 ساعة بعد الإصابة.

2. تقييم تدفق الدم الدماغي مع التحليل الطيفي للارتباط المنتشر

  1. الحصول على بيانات DCS
    1. إزالة الشعر على فروة الرأس. نظرا لأن DCS يعمل بشكل أفضل في غياب الشعر ، فمن الضروري إزالة الفراء على الرأس قبل بدء التجارب. عادة ، تتم إزالة الشعر قبل 1-3 أيام من بدء الدراسة.
      1. حث الفئران مع 4.5 ٪ من الايزوفلوران في 100 ٪ من الأكسجين لمدة 45 ثانية والحفاظ على 1-2 ٪ من الايزوفلوران في الأكسجين 100 ٪.
      2. حلق الرأس بين العينين والأذنين. ثم ، استخدم كريم إزالة الشعر لإزالة الفراء على الرأس كما في الشكل 3.
      3. اسمح للحيوان بالتعافي من التخدير على وسادة الاحترار ثم العودة إلى القفص.
    2. قياس تدفق الدم الدماغي مع DCS. لتقليل القطع الأثرية المتحركة أثناء القياس ، قم بدراسة الفئران تحت تخدير إيسوفلوران قصير.
      ملاحظة: راقب بصريا التنفس واستجابة قرصة إصبع القدم طوال القياسات واضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الحاجة لضمان عمق ثابت للتخدير. الاختلافات الكبيرة في عمق التخدير يمكن أن تغير تدفق الدم بالنظر إلى الآثار الوعائية المعروفة للإيسوفلوران25.
      1. حث مع 4.5 ٪ isoflurane في 100 ٪ من الأكسجين لمدة 45 ثانية ، ثم الحفاظ على 1.0-1.75 ٪ isoflurane في 100 ٪ من الأكسجين. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم والتنفس الطبيعي (بين ~ 60-80 نفسا في الدقيقة).
      2. بعد فترة 2 دقيقة من التثبيت ، ضع مستشعر DCS برفق فوق نصف الكرة الأيمن بحيث تصطف الحافة العلوية للمستشعر البصري مع الجزء الخلفي من العين ويصطف جانب المستشعر على طول خط الوسط (الشكل 3). ضع يده على المستشعر للحماية من ضوء الغرفة. احصل على 5 ثوان من البيانات (اكتساب 1 هرتز).
      3. أعد وضع المستشعر فوق نصف الكرة الأيسر، واحصل على 5 ثوان من البيانات.
      4. كرر 3 مرات / نصف الكرة الأرضية لحساب عدم التجانس المحلي تحت سطح الأنسجة.
    3. الانتعاش
      1. قم بإزالة الماوس من التخدير وضعه على وسادة الاحترار.
      2. بعد أن يستعيد الماوس منعكس التصحيح ، أعده إلى القفص.
  2. تحليل بيانات DCS
    1. إجراء مراقبة الجودة الأولية. يتكون كل إطار من بيانات DCS من دالة ارتباط تلقائي للشدة الطبيعية المقاسة ، (الشكل 4A) ، figure-protocol-1 ومعدل عدد الفوتون (kHz).
      1. لإزالة إطارات البيانات ذات القطعة الأثرية ذات الحركة الهامة، تجاهل إطارات البيانات التي تبلغ القيمة المتوسطة لذيل المنحنى figure-protocol-2 (أي figure-protocol-3) > 1.005.
      2. لإزالة إطارات البيانات ذات النسبة الضعيفة للإشارة إلى الضوضاء، تجاهل إطارات البيانات إذا كان معدل عدد الفوتونات المكتشف < 20 كيلو هرتز.
    2. استخراج مؤشر تدفق الدم الدماغي. باستخدام fminsearch في Matlab ، تناسب كل إطار figure-protocol-4بيانات تم قياسه ل CBF i (i). تقييد يناسب figure-protocol-5، والعثور على قيمة CBFi التي تقلل من دالة التكلفة التالية:
      figure-protocol-6
      حيث يكون المجموع فوق جميع أوقات التأخير المقاسة،figure-protocol-7figure-protocol-8 وهو الحل المتجانس شبه اللانهائي لمعادلة انتشار الارتباط (الشكل 4B):
      figure-protocol-9
      هنا β هو عامل تماسك يحدده الإعداد التجريبي ، ، ، ، ، ، figure-protocol-10figure-protocol-11figure-protocol-12figure-protocol-13Reff = 0.493 لمؤشر الأنسجة المفترض للانكسار البالغ 1.4 ، ρ هو 6 مم ، μ a و μ هما معامل الامتصاص وانخفاض التشتت للأنسجة (يفترض أن يكون 0.25 و 9.4 / سم ، على التوالي10،26،figure-protocol-1427).
      ملاحظة: نظرا لأن β يمكن أن تختلف بنسبة 10٪ تقريبا بمرور الوقت ، فقم باحتواء كل إطار بيانات β و CBFi في وقت واحد.
    3. أداء مراقبة الجودة الثانوية. داخل كل تكرار (يتكون من 5 إطارات بيانات) ، تجاهل القيم المتطرفة. يتم تعريف القيم المتطرفة على أنها قيم CBF i التي تقع خارج الانحرافات المعيارية 1.5 لمتوسط CBFi لهذا التكرار. إذا تم تحديد أكثر من 1 نقطة بيانات على أنها شاذة، فتجاهل التكرار بأكمله.
    4. تقدير متوسط مؤشر تدفق الدم الدماغي: تقدير متوسط CBFi لكل نصف كرة عن طريق أخذ المتوسط عبر جميع إطارات البيانات لجميع التكرارات (الشكل 4C). إذا لم تلاحظ فروق كبيرة في نصف الكرة الأرضية ، فقم بالمتوسط عبر نصفي الكرة الأرضية للحصول على تقدير لمتوسط CBF العالميi.

3. القياس الكمي المتعدد للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو باستخدام مقايسات لومينكس

  1. استخراج الأنسجة
    ملاحظة: يتطلب التحديد الكمي للسيتوكينات الدماغية وبروتينات إشارات الفوسفو باستخدام Luminex استخراج الأنسجة.
    1. تخدير الفأر باستخدام 4.5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين بنسبة 100٪ لمدة 1-2 دقيقة. تحقق من وجود مستوى عميق من التخدير عن طريق عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم. القتل الرحيم عن طريق قطع الرأس.
    2. حصاد الأنسجة.
      1. إزالة الدماغ. عادة ، قم بإصلاح نصف الكرة الأيسر لعلم الأنسجة والتشريح المجهري لعدة مناطق من نصف الكرة الأيمن داخل القشرة والحصين (الشكل 5).
      2. ضع عينات تشريح في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. لتحليل البروتينات الحساسة للتجميد ، من الأفضل تقسيم أقسام الأنسجة قبل التجميد السريع لتجنب ذوبان الجليد لاحقا.
        ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا، ويمكن تخزين عينات الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لتحليل العينات. بدلا من ذلك ، يمكن تحليل العينات ، ثم تخزينها عند -80 درجة مئوية.
    3. عينات ليز.
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق إضافة مثبط الأنزيم البروتيني وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل 2 mM إلى المخزن المؤقت للتحلل.
      2. أضف 150 ميكرولتر من مخزن التحلل المختلط لكل 3 ميكروغرام تقريبا من الأنسجة الحيوانية. كمرجع ، عينات أنسجة القشرة البصرية للفأر حوالي 3 ميكروغرام.
      3. لتجانس الأنسجة ، قم بترقيم الأنسجة ميكانيكيا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 15-20 مرة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. للحصول على العينة المثلى ، يمكن استخدام مدقة مجانسة.
      4. ضع أنابيب العينة على دوار لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      5. الطرد المركزي للعينات في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند حوالي 15000 × غرام ، وجمع supernatant. يمكن معالجة العينات على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
        ملاحظة: تتوافق عينات المحللات المعدة باستخدام هذا البروتوكول مع اللطخة الغربية ، والتي يمكن من خلالها تحليل علامة البلعمة / الخلايا الدبقية الدقيقة Iba1 و / أو علامة تنشيط الخلايا النجمية GFAP لاستكمال تحليل السيتوكين وبروتين الفوسفو لدراسات التهاب الأعصاب11.
  2. بروتوكول الفحص المناعي متعدد الإرسال للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو
    ملاحظة: على الرغم من التشابه بشكل عام ، إلا أن هناك بعض الاختلافات الطفيفة في بروتوكولات مجموعات السيتوكين وبروتين الفوسفو. يتم ملاحظة الاختلافات في كل خطوة. يتم توضيح خطوات إعداد العينات لفحص Luminex أدناه.
    1. تحضير الكواشف (اليوم 1 ، نفس الشيء بالنسبة للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو)
      1. اسمح للكواشف بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة).
      2. سونيكات زجاجة الخرز المغناطيسي متعدد الإرسال لمدة 30 ثانية تليها 1 دقيقة من الدوامة. تأكد من حماية الخرز المغناطيسي متعدد الإرسال من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم أو استخدام زجاجات واقية من الضوء مقدمة.
      3. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل عن طريق خلط 0.1٪ Tween20 في 1xPBS أو بدلا من ذلك استخدم المخزن المؤقت للغسيل الموجود في المجموعة.
    2. تحضير عينات الأنسجة المحللة (اليوم 1 ، نفس الشيء بالنسبة للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو)
      1. إذا تم تجميدها سابقا ، فقم بإزالة عينات الأنسجة المحللة من الفريزر واتركها تذوب على الجليد (~ 20 دقيقة). عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 9,167 × g لإزالة الراسب.
      2. تحضير 25 ميكرولتر من العينة عند تركيز البروتين الأمثل الذي يحدده تحليل المدى الخطي (انظر القسم 3.3). لتطبيع الحجم الإجمالي لجميع العينات، قم بتخفيف العينات في مخزن الفحص المخزن المؤقت المتوفر في المجموعة.
    3. تحضير 96 صفيحة بئر (اليوم 1 ، نفس الشيء بالنسبة للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو)
      1. استخدم لوحة البئر 96 المضمنة في المجموعة أو لوحة ذات قاع رقيق (على سبيل المثال ، Brand Tech).
      2. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (أو 1x PBS ، 0.1٪ Tween) في كل بئر واخلطه على شاكر الطبق لمدة 10 دقائق عند 750 دورة في الدقيقة.
      3. المخزن المؤقت لغسل الملصقات واضغط على الطبق على منشفة ورقية لإزالة البقايا.
    4. إجراء المقايسة المناعية للسيتوكينات (اليوم 1)
      1. أضف ما يلي إلى كل بئر بالترتيب.
        1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى جميع الآبار.
          1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإضافي للمقايسة فقط إلى آبار الخلفية. لكل تشغيل تجريبي ، لديك بئران خلفيتان على الأقل. لا تحتوي الآبار الخلفية على عينة محملة وتحدد كثافة الفلورسنت التي يقرأها الجهاز بدون عينة.
          2. أضف 25 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى آبار العينة المقابلة.
          3. أضف 25 ميكرولتر من 1x حبات مغناطيسية متعددة الإرسال إلى جميع الآبار (الشكل 6). تأكد من دوامة الخرز لمدة 1 دقيقة قبل الإضافة إلى الآبار.
      2. ختم لوحة مع لوحة مانعة للتسرب وتغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم. احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) في 2-8 درجة مئوية.
    5. إجراء المقايسة المناعية للسيتوكينات (اليوم 2)
      1. ضع 96 صفيحة بئر على الفاصل المغناطيسي ، مع التأكد من محاذاة الآبار مع المغناطيس. اتركيه لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر بينما لا تزال اللوحة متصلة بالفاصل المغناطيسي.
      2. اغسل اللوحة 2 مرات باستخدام الخطوات التالية.
        1. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر وضعه على الخلاط لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        2. ضع لوحة البئر على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        3. صب محتويات البئر بينما لا تزال لوحة البئر متصلة بفاصل مغناطيسي.
      3. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف لكل بئر (الشكل 6). يغطى بورق القصدير. احتضان لمدة 1 ساعة على شاكر لوحة (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      4. اترك الجسم المضاد للكشف وأضف 25 ميكرولتر من الستربتافيدين فيكويريثرين (SAPE) إلى كل بئر (الشكل 6). يغطى بورق القصدير. احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      5. ضع صفيحة البئر على فاصل مغناطيسي واتركها لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر وفصلها عن الفاصل المغناطيسي.
      6. اغسل الطبق جيدا مرتين (انظر الخطوة 3.2.5.2).
      7. أضف 75 ميكرولتر من سائل محرك Luminex (في حالة استخدام أداة MAGPIX) إلى كل بئر أو مخزن مؤقت للفحص (إذا كنت تستخدم أداة 200 أو FlexMap 3D). أعد تعليق الخرز على شاكر الطبق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      8. اقرأ على Luminex Instrument (MAGPIX أو 200 أو FlexMap 3D) ، في إشارة إلى دليل المستخدم للتشغيل السليم (الشكل 6).
    6. إجراء المقايسة المناعية لبروتينات الفوسفو (اليوم 1)
      1. أضف ما يلي إلى كل بئر بالترتيب.
        1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى جميع الآبار.
          1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإضافي للمقايسة فقط إلى آبار الخلفية. لكل تشغيل تجريبي ، يوصى بالحصول على بئرين خلفيين على الأقل. لا تحتوي الآبار الخلفية على عينة محملة وتحدد كثافة الفلورسنت التي يقرأها الجهاز بدون عينة.
          2. أضف 25 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى كل عينة بشكل جيد.
          3. أضف 25 ميكرولتر من 1x حبات مغناطيسية متعددة الإرسال إلى جميع الآبار (الشكل 6).
            ملاحظة: توفر مجموعة مقايسة Luminex حبة مغناطيسية متعددة الإرسال في حل مخزون 20x. تأكد من دوامة 20x مخزون حل الخرزة المغناطيسية متعددة الإرسال لمدة 2 دقيقة ، ثم تخفيفه في المخزن المؤقت للفحص إلى محلول 1x. دوامة 1x تعليق حبة مغناطيسية متعددة الإرسال لمدة 1 دقيقة قبل إضافتها إلى الآبار.
        2. ختم لوحة مع لوحة مانعة للتسرب وتغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم. احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) في 2-8 درجة مئوية.
    7. إجراء المقايسة المناعية لبروتينات الفوسفو (اليوم 2)
      1. ضع صفيحة البئر على فاصل مغناطيسي ، مع التأكد من محاذاة صفيحة البئر بالكامل مع الفاصل المغناطيسي. اتركيه لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر بينما لا تزال لوحة البئر متصلة بالفاصل المغناطيسي.
      2. اغسل الصفيحة مرتين (انظر الخطوة ب في اليوم 2 من إجراء المقايسة المناعية للسيتوكين).
      3. قم بتخفيف الجسم المضاد للكشف عن المخزون 20x إلى محلول 1x في المخزن المؤقت للفحص. أضف 25 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن 1x لكل بئر (الشكل 6). يغطى بورق القصدير. احتضان لمدة 1 ساعة على لوحة الاهتزاز (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      4. ضع لوحة البئر 96 على الفاصل المغناطيسي ، واتركها لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر ، وفصل عن الفاصل المغناطيسي.
      5. تمييع 25x الأسهم SAPE في المخزن المؤقت المقايسة إلى 1x المخزن المؤقت. أضف 25 ميكرولتر من 1x SAPE (الشكل 6). يغطى بورق القصدير ويحضن لمدة 15 دقيقة على شاكر الطبق (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      6. اترك SAPE في الآبار ، وأضف 25 ميكرولتر من مخزن التضخيم المؤقت إلى كل بئر. يغطى بورق القصدير.
      7. احتضن لمدة 15 دقيقة على شاكر الطبق (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      8. ضع لوحة البئر على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر والانفصال عن الفاصل المغناطيسي.
      9. أضف 75 ميكرولتر من Luminex Drive Fluid (في حالة استخدام أداة MAGPIX) أو مخزن مؤقت للفحص (في حالة استخدام أداة 200 أو FlexMap 3D). أعد تعليق الخرز على شاكر الطبق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      10. اقرأ على جهاز Luminex (MAGPIX أو 200 أو FlexMap 3D) ، في إشارة إلى دليل المستخدم للتشغيل السليم (الشكل 6).
  3. خطية منحنى تخفيف العينة
    1. تحضير العينات: عينات اختبار مخففة بشكل متسلسل بتركيز مختلف من البروتين الكلي. بالنسبة لأنسجة المخ السائبة ، قم بتحميل التخفيفات التسلسلية من 0-25 ميكروغرام للسيتوكينات و 0-12 ميكروغرام لبروتينات الفوسفو. يمكن قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك (BCA).
    2. المقايسة المناعية متعددة الإرسال: قم بإجراء فحص Luminex (انظر القسم 3.2) على عينات مختارة.
    3. تحليل البيانات
      1. كثافة الفلورسنت لكل بروتين مقابل كمية البروتين المحملة (الشكل 7).
      2. لكل تحليل، حدد نطاق البروتين الكلي المحمل الذي تكون العلاقة بين البروتين الكلي وقراءة كثافة الفلورسنت خطية (الشكل 7).
      3. لتحديد كمية البروتين الكلي التي يجب تحميلها لتشغيل الفحص الكامل ، حدد الجزء الخطي من المنحنى لكل تحليل ثم حدد تركيز البروتين الذي يقع ضمن النطاق الخطي لمعظم التحليلات.
        ملاحظة: على الرغم من أن معظم البروتينات تشترك في نطاق خطي مماثل، إلا أن النطاقات الخطية قد لا تتداخل مع جميع البروتينات. إذا كان هذا هو الحال ، فقد يكون من الضروري تشغيل كل عينة عدة مرات بكميات مختلفة من البروتين الكلي الذي يتم تحميله. بدلا من ذلك ، قد يتم استبعاد العينات غير الخطية من التحليل. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يكون لبعض البروتينات نطاق خطي على الإطلاق.

4. الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى

ملاحظة: يتم توفير نموذج التعليمات البرمجية R ونموذج جدول بيانات البيانات لإجراء التحليل الجزئي للمربعات الصغرى.

  1. إعداد البيانات: تنسيق البيانات كما هو موضح في جدول بيانات عينة البيانات المقدم ، "MyData". قم بتضمين أسماء المتغيرات في الصف 1، وأسماء العينات في العمود A، ومتغير الاستجابة في العمود B، وجميع متغيرات التنبؤ في الأعمدة C+. املأ الصفين الأخيرين ببيانات الخلفية، واضبط كلا الاسمين النموذجيين على "الخلفية".
  2. الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى في RStudio
    1. قم بتثبيت R من www.r-project.org (مجاني ومفتوح المصدر).
    2. قم بتثبيت RStudio Desktop من www.rstudio.com (ترخيص مجاني مفتوح المصدر).
    3. قم بتنزيل نموذج التعليمات البرمجية R المتوفرة مع هذا المنشور "PLSR_Sample_Code.R" واحفظه في نفس المجلد الذي يحتوي على جدول بيانات البيانات. افتح ملف التعليمات البرمجية في RStudio.
    4. في قسم إدخال المستخدم، قم بتغيير "dataFileName" إلى اسم جدول بيانات البيانات.
    5. نفذ الخطوات التالية عن طريق تمييز قسم التعليمات البرمجية المراد تشغيله والنقر فوق تشغيل في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج النصي.
      1. قم بتحميل حزم R الضرورية والوظائف وعنوان دليل العمل وقيم إدخال المستخدم في RStudio (القسم الفرعي "Preliminaries").
      2. قم بتحميل البيانات في RStudio وقم بإعداد البيانات الخام للمعالجة عن طريق طرح متوسط إشارة الخلفية من جميع القياسات وتسجيل z لكل تحليل (القسم الفرعي "قراءة البيانات وطرح الخلفية") (الشكل 8A).
      3. إجراء الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى في RStudio باستخدام حزمة plsRglm v1.2.528 المتوفرة على شبكة أرشيف R الشاملة (CRAN). قم بإجراء دوران varimax (حزمة الإحصائيات v3.6.2)23 في المستوى LV1-LV2 لتحديد محور أفقي جديد يفصل العينات بشكل أفضل بواسطة متغير الاستجابة (القسم الفرعي "PLS") (الشكل 8B).
      4. قم بإجراء التحقق المتقاطع (LOOCV) الذي يتم فيه استبعاد عينة واحدة بشكل متكرر من البيانات وإعادة حساب نموذج PLSR. حساب الانحراف المعياري لعمليات تحميل التحليل عبر جميع عمليات تشغيل LOOCV (القسم الفرعي "LOOCV").
  3. إنشاء مخططات تمثيلية: قم بتشغيل نموذج التعليمات البرمجية المقدم كما هو مفصل أعلاه لإنشاء مخططات تمثيلية يتم تصديرها تلقائيا كملفات pdf إلى دليل العمل (المجلد الذي يحتوي على البيانات وملفات التعليمات البرمجية).
    1. إنشاء خريطة حرارية للبيانات المعالجة كما هو موضح في الشكل 8A (القسم الفرعي "PLS"). قم بتلوين كل إدخال على طول طيف محدد بواسطة z-score. فرز التحليلات حسب الترتيب المحسوب في المتغير الكامن للفائدة.
    2. قم بإنشاء مخطط درجات مع درجات LV1 مرسومة على طول المحور الأفقي ودرجات LV2 مرسومة على طول المحور الرأسي ، كما هو موضح في الشكل 8B (القسم الفرعي "PLS"). قم بتلوين كل نقطة بيانات وفقا لقياس متغير الاستجابة الخاص بها لتصور العلاقة بين كل متغير كامن ومتغير الاستجابة.
    3. قم بإنشاء مخطط شريط يعرض الأحمال لكل متغير من متغيرات التنبؤ الخاصة بك لتصور كيفية مساهمة كل محلل في المتغيرات الكامنة ، كما هو موضح في الشكل 8C (القسم الفرعي "LOOCV").
    4. قم بإنشاء مخطط يتراجع درجات LV1 مقابل متغير الاستجابة الخاص بك لتصور مدى جودة فصل نموذج PLSR بين العينات ، كما هو موضح في الشكل 8D (القسم الفرعي "PLS").

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم أخذ البيانات التي تم جمعها سابقا من العمل السابق الذي تعرضت فيه مجموعة من ثمانية فئران C57BL/6 لثلاث إصابات مغلقة الرأس (الشكل 2) متباعدة مرة واحدة يوميا11. في هذا العمل ، تم قياس تدفق الدم الدماغي باستخدام التحليل الطيفي المنتشر للارتباط 4 ساعات بعد الإصابة الأخيرة (الشكل 3 ، الشكل 4). بعد تقييم CBF بعد الإصابة ، تم قتل الحيوانات الرحيم ، وتم استخراج أنسجة المخ لتحديد كمية السيتوكينات والبروتينات الفوسفو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيما يلي تفاصيل طرق تقييم استجابة الدورة الدموية والالتهابات العصبية لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة المتكررة. علاوة على ذلك ، أظهرنا كيفية دمج هذه البيانات كجزء من تحليل الأنظمة متعددة المتغيرات باستخدام الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى. في النص أدناه ، سنناقش بعض الخطوات والقيود الرئيسية المرتبطة بالبروتوكول بالإضافة إلى مزايا / عيوب الأساليب على الطرق الحالية.

نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة. هذه الطريقة في تحريض إصابات الدماغ الرضحية مفيدة من حيث أنها تتميز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة R21 NS104801 (EMB) و R01 NS115994 (LBW / EB) وجائزة الرعاية الصحية للأطفال في أتلانتا للكلية المبتدئة (EMB). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل وزارة الدفاع الأمريكية من خلال برامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس بموجب الجائزة رقم. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلف ولا تؤيدها بالضرورة وزارة الدفاع. تستند هذه المواد إلى العمل المدعوم من قبل برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم 1937971. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ماصاتأي ماصة قابلة للتعديل
رقائق الألومنيومVWR89107-726
طقم تحلل الخلايا Bio-PlexC Bio-Rad171304012
العلامة التجارية BRANDplates PureGrade Microplates ، NonsterileBrandTech781602 96
قرص مثبط بروتاز صغيركامل Sigma-Aldrich11836153001
كريم مزيل الشعرAmazonNair
DiH2OVWRVWRL0200-1000
فاصل مغناطيسي محمولة ل 96 لوحة قاع مسطح بئركتالوج Millipore Sigma40-285
لوحة Autocorrelatorللأجهزة www.correlator.com< / u>Flex05-8ch
Isoflurane 250 ملMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
Kimwipe (11.2 × 21.3 سم)VWR21905-026
خلاط دوامة مختبرVWR10153-838
LabViewNational InstrumentsLabعرض
Luminex 200 أو HTS أو FLEXMAP 3D أو MAGPIX مع برنامج xPONENTLuminex Corporation
Luminex Drive FluidLuminexMPXDF-4PK
سائل غمد LuminexEMD MilliporeSHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP لوحة حبة مغناطيسية للسيتوكين / كيموكين - مخلوطة مسبقا 32 Plex - فحص المناعة المتعددMillipore SigmaMCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK / SAPK إشارات 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex AssayMillipore Sigma48-660MAG
Mini LabRoller rotatorVWR10136-084
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريدسيجما-ألدريتشP7626-1G
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)VWR97064-158
لوحة السدادةVWR82050-992
أنابيب البولي بروبيلين المجهرةVWR20901-547
Mini LabRollerMillipore SigmaZ674591
كاشف الخزاناتVWR89094-668
R لغة
RStudiowww.rstudio.com< / u>
Sonicator
Titer لوحة شاكرVWR12620-926
Tween20Sigma-AldrichP9416-50ML
أنبوب توجيه أكريليك 1 مترMcMaster-Carr49035K85
4 فوتون عد الانهيار الجليدي الثنائي الضوئيPerkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 um مصدر متعدد الأوضاع الأليافThorlabs Inc.FT-400-EMT
54 جم بولتAce Hardware0.95 سم قطر الجسم الأساسي ، قطر الرأس 2 سم ، طول 10.2 سم
780 نانومتر كاشف أحادي الوضع أليافThorlabs Inc.780HP
852 نانومتر ليزر طويل التماسكTOPTICA PhotonicsiBeam ذكي
قابلة للتعديل كتلة البرمجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019(2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719(2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1(2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701(2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322(2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009(2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Luminex

مقالات ذات صلة