Method Article

الليزر التقاط Microdissection RNA تسلسل لتحليل التعبير الجيني المكاني والزماني محددة في النباتات

DOI:

10.3791/61517

⸱

August 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, 2Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, 3Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو بروتوكول لالتقاط الليزر microdissection (LCM) من الأنسجة النباتية. LCM هي تقنية مجهرية لعزل مناطق الأنسجة بطريقة خالية من التلوث. ويشمل الإجراء تثبيت الأنسجة، التضمين البارافين، والتجزئة، LCM واستخراج الحمض النووي الريبي. يتم استخدام الحمض النووي الريبي في تحليل الأنسجة المصب محددة، حل مؤقتا من transcriptomes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويخضع تطوير كائن معقد متعدد الخلايا لأنواع خلايا مختلفة لها ملامح مختلفة. لتحديد الشبكات التنظيمية النسخية التي تحكم العمليات التنموية من الضروري قياس ملامح التعبير الجيني المكاني والزماني لهذه الأنواع من الخلايا الفردية. ولذلك، فإن التبصر في الرقابة الوُقتائية على التعبير الجيني أمر ضروري لفهم كيفية تنظيم العمليات البيولوجية والإنمائية. هنا، نحن وصف طريقة التقاط الليزر microdissection (LCM) لعزل عدد صغير من الخلايا من ثلاثة أعضاء جنين الشعير على مدى فترة زمنية خلال عملية الإنبات تليها التنميط النص. وتتألف هذه الطريقة من تثبيت الأنسجة، وتجهيز الأنسجة، والبارافين تضمين، والقسم، LCM و RNA استخراج تليها في الوقت الحقيقي PCR أو RNA-seq. وقد مكنتنا هذه الطريقة من الحصول على ملامح مكانية والزمنية من نسخ أعضاء البذور من أعداد مختلفة من الخلايا (من عشرات إلى مئات)، مما يوفر خصوصية الأنسجة أكبر بكثير من التحليلات النموذجية لالأنسجة السائبة. من هذه البيانات كنا قادرين على تحديد ومقارنة الشبكات التنظيمية النسخية وكذلك التنبؤ بعوامل النسخ التنظيمية المرشحة للأنسجة الفردية. وينبغي أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على الأنسجة النباتية الأخرى مع الحد الأدنى الأمثل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشمل تطوير النبات ونموه العمل المنسق للشبكات التنظيمية النسخية داخل خلايا مختلفة موجودة في بيئة خلوية معقدة. لفهم نشاط هذه الشبكات التنظيمية، نحن بحاجة إلى معرفة التعبير الجيني المكاني والزماني داخل أنواع الخلايا المختلفة عبر مراحل النمو. ومع ذلك، فإن تحليلات التعبير الجيني تجري بشكل أكثر شيوعا في أعضاء كاملة أو عينات الأنسجة السائبة بسبب التحدي التقني المتمثل في عزل وتحليل أعداد صغيرة من الخلايا. وقد سمحت الطريقة التي نصفها هنا الحصول على تحليل نسخي مكاني وزمني من خلال اقتران LCM مع RNA-seq.

وقد وضعت LCM قبل عقدين من قبل Emmert باك وزملاؤه1. وقد مكنت هذه التقنية الباحثين من عزل الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا بدقة عن بيئتهم باستخدام التصور المجهري المباشر والتلاعب بأشعة الليزر الضيقة1. ومنذ ذلك الحين تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في علم الأحياء السرطان وعلم الأمراض2,3. كما قامت العديد من مجموعات البحوث النباتية بتكييف LCM للاستخدام مع أنواع النباتات المختلفة وأنواع الأنسجة المختلفة4،5،66،7،8،9،10،11. في الآونة الأخيرة، استخدمت العديد من الأوراق أيضا LCM على بذور eudicot و monocot لدراسة الجنين، endosperms وغيرها من هياكل البذور أثناء تطوير البذور والإنبات10،12،13. معظم غيرها من أساليب العزل خلية واحدة شائعة الاستخدام مثل الأنابيب الدقيقة، وفرز الخلايا، وفصل المغناطيسي ومنصات microfluidic تعتمد على الهضم الأنزيمي أو التجانس الميكانيكية لفصل الخلايا. هذا قد يربك تعبير الجينات، وإدخال التحف الفنية التي تربك تفسير البيانات14،15. وتتطلب هذه الطرق أيضا المعرفة السابقة للجينات علامة لكل نوع الخلية لربط الخلايا المنفصلة إلى موقعها المكاني ونوع الخلية الحقيقية. وهناك مجموعة أخرى من التقنيات يعتمد على العزلة على أساس تقارب من الهياكل دون الخلوية بدلا من الخلايا الكاملة، على سبيل المثال سليمة (عزل نوكلي الموسومة في أنواع الخلايا) و TRAP (ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم)16،17. ومع ذلك، فإن وضع العلامات على القرابة وتنقية النوى أو الريبوسومات أمر صعب تقنياً في الأنواع النباتية التي ليس لديها بروتوكولات تحويل راسخة. LCM يستفيد من تثبيت الأنسجة السريعة للحفاظ على مستويات النص وتحديد الأنسجة التقليدية عن طريق التصور المباشر للخلايا داخل سياقها الأنسجة / الجهاز الطبيعي، والذي يسمح للخلايا منفصلة لتكون معزولة في فترة قصيرة من الوقت18،19.

البروتوكول المقدم هنا هو طريقة محسنة لعزل خلايا محددة أو أنواع الخلايا من أقسام الأنسجة من بذور الحبوب، والتي يمكن تطبيقها على معظم الخلايا التي يمكن تحديدها من الناحية النسيجية. يوفر LCM طريقة خالية من الاتصال لعزل الخلايا ، مما يقلل إلى حد كبير من التلوث وزيادة سلامة الحمض النووي الريبي المستعاد. وعلاوة على ذلك، توضح هذه الطريقة قوة LCM على الدراسات واسعة النطاق الجينوم بدءا من كميات صغيرة من المواد البيولوجية. كما أننا نُصف التضخيم الخطي للرنا لتوليد مواد إدخال كافية لتحليلات النسخ/النسخ.

هناك عشر خطوات رئيسية في هذا البروتوكول LCM RNA-seq لـ transcriptomes المكانية والزمانية الخاصة بالأنسجة، بما في ذلك تثبيت عينات الأنسجة، والجفاف، وتسرب البارافين، والتضمين، والقطع، واللمس، واستخراج الحمض النووي الريبي، والتضخيم RNA، والكمية RNA وqRT-PCR و /أو RNA-seq(الشكل 1).

figure-introduction-1
الشكل 1: مخطط انسيابي من LCM متبوعاً بـ RNA-seq أو qRT-PCR. LCM هو تقنية دقيقة مكانيا وخالية من الاتصال لجمع الخلايا من أقسام الأنسجة الثابتة باستخدام شعاع الليزر تحت التصور المجهري. تبدأ العملية مع تثبيت عينات الأنسجة ، تليها الجفاف باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول والزيلين ، وانتهت مع تسلل البارافين. يمكن أن تكون العملية مؤتمتة بالكامل باستخدام معالج الأنسجة. مرة واحدة يتم اختراق الأنسجة مع البارافين، يتم تضمينه في قالب مع البارافين المنصهر باستخدام محطة تضمين. يتم إجراء اقطع باستخدام microtome تعيين إلى سمك المطلوب. يتم إعداد الشرائح وLCM التي أجريت مباشرة قبل RNA هو أن تستخرج من الخلايا التي تم التقاطها. ويتبع استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة من قبل جولتين من تضخيم الحمض النووي الريبي قبل qRT-PCR و / أو RNA-seq. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما المنتج النهائي هو RNA، والحرص على تجنب تلويث العمل مع RNases. ارتداء القفازات أمر لا بد منه. استخدام ديثيل بيروكاربونات (DEPC) - المياه المعالجة، والمخازن، الخ. مخازن الأوتوكلاف وخبز الأواني الزجاجية قبل الاستخدام.

1. تثبيت الأنسجة

  1. إعداد المثبت من اختيار اعتمادا على الأنواع وأنواع الأنسجة; لبذرات الشعير، استخدم المثبت المزارع (75٪ الإيثانول، 25٪ حمض الخليك الجليدي (v/v)).
  2. هدئ الثّلّي على الثلج قبل حصاد الأنسجة.
  3. جمع المواد النباتية من الفائدة وإذا لزم الأمر، تشريحه إلى قطع من الحجم المناسب لتناسب قالب التضمين المحدد. بالنسبة لبذر الشعير، قم بقطع البذور إلى نصف طولي للمساعدة في اختراق الحل المثبت ولتناسبه مع القالب المضمّن.
  4. غمر الأنسجة في حجم لا يقل عن 10x من المثبت الجليد الباردة. بالنسبة لبذورة الشعير، غمر البذور مقطعة إلى نصف إلى نصف المثبت.
  5. استخدام فراغ التسلل لتسريع تغلغل المثبت. يجب أن تغرق الأنسجة بعد تسرب فراغ المثبت. بالنسبة لبذرات الشعير، استخدم 30 دقيقة من تسرب الفراغ.
  6. استبدال المثبت واحتضان في 4 درجة مئوية للسماح المثبت لاختراق الأنسجة بشكل كامل. لبذور الشعير، احتضان العينات بين عشية وضحاها (~ 12-16 ساعة).
    ملاحظة: الأنسجة الرقيقة أو الصغيرة تتطلب وقت تثبيت أقصر بسبب ارتفاع معدل الانتشار من المثبت في الأنسجة.
  7. إزالة الأنسجة من المثبت ونقل الأنسجة إلى أشرطة الكاسيت ومن ثم البدء في تجهيز الأنسجة.
    ملاحظة: يمكن وضع الأنسجة الصغيرة أو الهشة، مثل أنسجة الأوراق، في أشرطة لتثبيتها لضمان عدم تلفها أثناء التثبيت. يمكن استخدام أكياس الخزعة أو الوسادات أو اللفائف لعقد الأنسجة بشكل آمن داخل الكاسيت أثناء تثبيت الأنسجة وخطوات معالجة الأنسجة.

2. معالجة الأنسجة

  1. استخدام معالج الأنسجة الآلي في الخطوة 2 مع الحد الأدنى من 10 غرف حل و 2 غرف البارافين ساخنة (انظر جدول المواد).
  2. تأكد من وجود كميات كافية من الحل في كل غرفة؛ استبدال الحلول بعد كل استخدامات قليلة من المعالج الأنسجة.
  3. ضع كاسيت مع الأنسجة في سلة معدنية. إرفاق سلة معدنية لحاملها فوق الغرفة 1. حامل سوف تدوير و "الغمر وتراجع" الكاسيت في الغرف، بعد البرنامج المعين.
  4. تعيين البرنامج عن طريق تنفيذ زر النقرات على لوحات التحكم في المعالج الأنسجة التي تنطوي على تحديد طول الوقت لكل غرفة.
  5. اضغط على زر "ابدأ" لبدء برنامج المعالجة. تم تصميم البرنامج التالي لبذور الشعير ويعمل بين عشية وضحاها (~ 18 ساعة)
    1. أداء الجفاف عن طريق غمس كاسيت لمدة 1 ساعة 30 دقيقة كل في سلسلة التدرج من الإيثانول (75٪ ، 85 ٪ ، 100 ٪ ، 100 ٪ ، و 100 ٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول).
    2. أداء المقاصة باستخدام الإيثانول: تدرج الزيلين لمدة 1 ساعة 30 دقيقة لكل من الساعة 75:25، 50:50، 25:75 (الإيثانول: الزيلين، v/v). ثم تراجع كاسيت لمدة 1 ساعة 30 دقيقة كل من 100٪ زيلين ثم 100٪ إكسيلين.
    3. أداء تسرب البارافين في 55-60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة 30 دقيقة مرتين في البارافين المنصهر.
      ملاحظة: يمكن تعيين درجة حرارة غرف سخان البارافين في الجزء الخلفي من معالج الأنسجة.
  6. في صباح اليوم التالي، وإزالة أشرطة من المعالج الأنسجة والمضي قدما في تضمين البارافين.
    ملاحظة: قد يختلف وقت البرنامج بين نوع مختلف من الأنسجة. يمكن استخدام فراغ و / أو التحريض أثناء معالجة الأنسجة لتسريع تسلل الحلول المختارة عن طريق الضغط على "V" و / أو "الانفعالات" الأزرار على لوحة التحكم في معالج الأنسجة.

3. البارافين تضمين

  1. استخدم جهاز تضمين في هذه الخطوة (راجع جدول المواد).
  2. قم مسبقاً بتشغيل الجهاز المضمّن مسبقًا قبل ساعات قليلة على الأقل من التضمين لإتاحة الوقت للبارافين في الخزانات للذوبان تمامًا.
  3. بدوره على لوحة الباردة قبل البدء.
  4. تضمين العينات في قوالب من خلال عقد العينات في الموقف باستخدام ملقط غرامة وصرف البارافين المنصهر في القالب. ضمان التوجيه السليم للعينات لكل غرض تجريبي. بالنسبة لبذر الشعير، توجه طولية البذور إلى اتجاه القطع للحصول على أقسام طولية.
    ملاحظة: القوالب التضمين تأتي في أحجام مختلفة. حدد حجم مناسب للسماح للعينة أن يتم وضعها و تضمينها بشكل صحيح. وينبغي النظر في توجيه العينات تبعا للاحتياجات التجريبية. إذا كانت هناك حاجة إلى أقسام طولية ، يجب أن تكون العينة موجهة طولية إلى اتجاه القطع في حين أن الأقسام العرضية يجب أن تكون موجهة العينة بالتوازي مع اتجاه القطع.
  5. ضع كاسيتًا نظيفًا على القالب وتأكد من تغطية البارافين بالكامل للكاسيت بأكمله للاحتفاظ بالعينة على الكاسيت.
  6. ضع القالب على لوحة باردة والسماح للparffin لتعيين تماما (10-20 دقيقة) قبل الإفراج عن كتلة من العفن.
  7. انتقل إلى قسمة أو نقل الكتل إلى 4 درجة مئوية للتخزين.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن تخزين الكتل المضمنة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.

4. إعداد شرائح غشاء البولي إيثيلين (PEN)

  1. غمر شرائح غشاء PEN في محلول تعطيل RNase لمدة 3 s متبوعة بغسلات موجزتين في المياه المعالجة DEPC لإزالة RNases على الشرائح. جفف الشرائح في حاضنة 37 درجة مئوية لإزالة اليسار أكثر من حل.
  2. UV علاج الشرائح باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء تدفق لارينار لمدة 30 دقيقة لتعزيز خصائص هيدروفيلي لتحسين التصاق البارافين.

5- قسمة

  1. استخدم ميكروموم في خطوة التقسيم (راجع جدول المواد).
  2. وضع شفرة جديدة في حامل السكين، والحفاظ دائما سكين الحرس حتى عندما لا نشط قسم
    تنبيه: شفرات المايكروتوم حادة للغاية ويمكن أن تسبب ضررًا كبيرًا عند التعامل معها بشكل غير لائق.
    ملاحظة: هناك اثنين من آليات التأمين على microtome، واحد هو في جانب الجهاز والآخر هو على مقبض العجلة. وكلاهما يجب أن يشاركا عندما لا يكون القسمة بنشاط.
  3. ضبط كتلة سكين لتكون أقرب إلى العينة ممكن دون لمس. تأكد من أن الذراع microtome أبدا يأتي في اتصال كامل مع كتلة سكين لأن هذا سوف يسبب ضررا هيكليا كارثية لmicrotome.
  4. بدوره على لوحة الباردة قبل البدء. الحفاظ على كتل البارافين على لوحة الباردة قبل قسمة وإعادة بارد كتل عند الضرورة أثناء القطاعات لمنع كتل من تليين.
  5. ملء حمام الماء مع المياه المعالجة DEPC والحرارة إلى 42 درجة مئوية قبل البدء.
  6. كتل تقليم إلى العمق المطلوب (حيث القسم كنت مهتما) والقطع كتل البارافين في سمك المطلوب (6-10 ميكرومتر) باستخدام microtome؛ كتلة مقطعة بشكل جيد سوف تشكل 'الشريط' على حافة النصل. لبذر الشعير، قسم بسمك 8 ميكرومتر.
  7. نقل شرائط بلطف من microtome إلى حمام الماء باستخدام فرشاة الطلاء غرامة أو ملقط غرامة، وضمان أن الشريط هو مسطحة على سطح الماء.
  8. أمسك شريحة بزاوية 45 درجة، باستخدام حركة تصاعدية، ارفع الشريط من الماء إلى الشريحة وقم بإزالة الماء الزائد بعناية باستخدام نسيج خال من الوبر.
  9. الشرائح الجافة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية للقضاء على أي ماء المتبقية تحت البارافين.
  10. انتقل إلى إزالة البارافين أو تخزينها عند 4 درجات مئوية في صندوق مغلق تحت ظروف الجفاف (لاستخدامها في غضون عدة أيام).
  11. إزالة البارافين عن طريق غسل الشرائح 3x لمدة 20 s كل في إكسيلين، تليها يغسل 2x من 30 s في 100٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول و 2x يغسل من 30 s في 70٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول.
  12. المضي قدما على الفور لالتقاط الليزر microdissection بعد إزالة البارافين.
    ملاحظة: Cryosectioning هو أسلوب بديل تم بنجاح إلى جانب LCM. سوف تختلف إعداد العينة لتكريب.

6. الليزر التقاط microdissection

  1. استخدام مجهر التقاط الليزر microdissection (انظر جدول المواد)إلى الخلايا microdissect من أقسام الأنسجة المجففة وفك.
  2. تحميل الشرائح على فتحات الثلاثة المتاحة.
  3. استخدام قبعات لاصقة خاصة من أنابيب جمع لجمع العينات التي تم التقاطها. التقاط دون السائل ("الجافة" جمع) يقلل من نشاط RNase. قم بتحميل أنابيب التجميع في الفتحات المتوفرة.
  4. نقل المرحلة لتحديد موقع المنطقة من العينة التي تحتاج إلى قطع. ويمكن القيام بذلك باستخدام الماوس أو عصا التحكم من الجهاز LCM ، أو مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح.
  5. لتحسين سرعة القطع، وقطع الطاقة والتركيز، والضغط بالليزر المندفع (LPC) الطاقة والتركيز، وقطع أولا على قطعة فارغة خالية من الأنسجة على الشريحة الغشاء. بالنسبة لبذر الشعير، سرعة القطع = 18، CutEnergy = 52 CutFocus = 63، LPCEnergy = 78، LPC التركيز = 61 في التكبير 10x.
    ملاحظة: قطع التركيز والطاقة يجب تعديلها للحصول على شرائح مختلفة، والأنسجة المختلفة، والمنطقة القبض ولكن القواعد العامة هي قوة المنجنيق أعلى من قوة القطع و الليزر يجب أن يكون مزيل لقذف. كلما ارتفع التكبير من عدسة الهدف، أصغر تركيز الليزر وارتفاع الطاقة.
  6. استخدم أدوات الرسم لتحديد الخلايا عن طريق تحديد المنطقة موضع الاهتمام.
  7. حدد وظيفة RoboLPC من شريط الأدوات وظيفة إلى الخلايا المنجنيق في قبعات لاصقة على أساس المعلمات الأمثل التي تم الحصول عليها عن طريق قطع على قطعة سوداء أعلاه.
    ملاحظة: المعلمات LCM تختلف بين أنواع الأنسجة، فضلا عن سمك القسم، صلابة الأنسجة والعدسات الهدف. لذلك، فمن الأفضل لتحسين كل شريحة على منطقة غشاء عادي دون عينة الأنسجة قبل قطع العينة الفعلية.
  8. استخدم أدوات العلم لوضع علامة على المناطق ذات الأهمية لتحديد موقعها مباشرةً عن طريق تحديد تلك العلامة من قائمة العناصر.
  9. تحقق من قبل "CapCheck" زر لفحص غطاء لاصق للتأكد من العينات تم القبض عليها. عادة، LCM من 10-15 أقسام (~ 200 خلية) لكل غطاء مطلوب لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  10. احتفظ بالعينات الملتقطة على الجليد. المضي قدما على الفور لاستخراج الحمض النووي الريبي لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: بعض المجهر LCM مجهزة ضوء الفلورسنت الذي يسمح التقاط الخلايا التي تحمل علامات الفلورسنت.

7. RNA استخراج

  1. استخدام انخفاض إدخال RNA العزل (انظر جدول المواد)عدة لاستخراج RNA بعد LCM. هذه المجموعات مصممة لاستعادة عالية الجودة RNA إجمالي باستمرار من أقل من عشر خلايا.
  2. عزل RNA الكلي من أنواع الخلايا الملتقطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بما في ذلك معالجة DNase على العمود.
    ملاحظة: الخطوة الأولى لاستخراج الحمض النووي الريبي حيث يتم عكس أنبوب ونفض الغبار أمر بالغ الأهمية لضمان العينات التي تم التقاطها على الغطاء هي في اتصال مع الحاجز استخراج المضافة.

8. تضخيم RNA

  1. استخدام المضادة للانتهاز الحمض النووي الريبي (أرنا) تضخيم عدة (انظر جدول المواد) لتضخيم آرنا من الجيش الملكي النيبالي المستخرجة من النسخ في المختبر لإنتاج ما يكفي من آرنا تخليق مكتبة RNA- seq.
  2. تنفيذ جولتين من التضخيم باستخدام مجموعة تضخيم آرنا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: من المهم تسخين دورة الحرارة وغطاء لدرجة الحرارة التي يرشدها عدة (انظر جدول المواد)الصانع. نهج بديل بدلا من تضخيم RNA هو استخدام مجموعة إعداد مكتبة المدخلات منخفضة لتجميع المكتبة مباشرة من RNA المستخرج.

9. RNA كم

  1. تحديد وتحديد الحمض النووي الريبي (آرنا) باستخدام نظام كهربائي آلي (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يفضل نظام الكهرباء الآلي لأنه يتطلب عينة أقل (1-2 ميكرولتر) ويوفر صورة تشبه الجل وكهربية لكل عينة على حدة.

10. qRT-PCR و / أو RNA - ما بعد

  1. توليف cDNA من الجيش الملكي النيبالي لqRT-PCR أو لجعل المكتبات RNA-seq باستخدام مجموعات مكتبة RNA-seq القياسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ولدت المكانية والزمانية الأنسجة المحددة transcriptomes من بذور الشعير أثناء الإنبات باستخدام لدينا LCM RNA-seq بروتوكول10. وقد أجريت الدراسة من خلال تطبيق LCM RNA-seq على عدد قليل من الخلايا من ثلاثة أعضاء الجنين (بلوم، تلميح شعاعي، scutellum) كل 8 ح على مدى 48 ساعة دورة زمنية أثناء الإنبات (0-48 ساعة، 7 نقاط زمنية) (الشكل 2A، B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم الحد من العديد من دراسات التعبير الجيني الخاصة بالأنسجة عن طريق تشريح اليد للعينات ، والتي تستغرق وقتا طويلا ، والعمالة المكثفة ، لديها خطر كبير من التلوث ويمكن أن تستخدم فقط العينات التي تعمل الإنسان هو بارعة بما فيه الكفاية لحصاد. LCM هو تقنية دقيقة وخالية من الاتصال لجمع الخلايا من أقسام الأنسجة الثابتة باستخدام شعاع ليزر يعمل ميكانيكيا تحت التصور المجهري.

إعداد عينة جيدة أمر بالغ الأهمية لLCM. تعتمد العملية على تحديد العينات ودمجها بشكل سليم للحفاظ على توازن جيد بين مورفولوجيا الأنس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالية من التميز في بيولوجيا الطاقة النباتية (CE140100008) إلى JW. تم دعم M.G.L من قبل جامعة لا تروب منحة بدء. نشكر منصة لا تروب جينوميكس على دعمها في تسلسل عالي الإنتاجية وتحليل البيانات. نشكر البروفيسور المشارك ماثيو تاكر على مشورة الخبراء حول إنشاء LCM في مختبرنا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الخليك 100٪ ACS / R.AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 غير شفافZeiss415190-9181-000
قوالب قاعدة شفافة 8 × 10Leica3803015
ثنائي إيثيل بيروكربوناتSigma-Aldrich40718-25ML
شاشة RNA عالية الحساسيةAgilent5067-5579
Low & ss; الملف الشخصي disp.blades DB80LSLeica14035843489
MembraneSlide 1.0 PENZeiss415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbion (ThermoFisher)AMB17515
على العمود DNase I مجموعة الهضمSigma-AldrichDNASE70
Ovation RNA-Seq System V2NuGen (العلوم المتكاملة)7102-08
البارافين (جراحي بارابلاست)مجموعة عزل
بيكو بيورABI (ثيرموفيشر)KIT0214
إزالة التلوث RNaseZap RNaseAmbion (ThermoFisher)AM9780
XyleneAnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC28975.360
معالج الأنسجة Leica BenchtopLeica BiosystemsTP1020
Leica وحدة تضمين البارافين المسخن LeicaBiosystemsEG1150H
Leica Cold Plate LeicaBiosystemsEG1150C
Safemate Class 2 خزانات السلامة البيولوجية LAFTechnologies Pty LtdSafemate 1.5
Leica مؤتمتة بالكامل دوارة MicrotomeLeica BiosystemsRM2265مع برنامج PALMRobo v 4.6
نظام Zeiss PALM MicroBeam LCMZeiss miscroscopy
TapeStationAgilentTapeStation 2200
الحمض النووي الريبي من لايكا 39601006 محلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
  3. Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
  4. Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965(2017).
  5. Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
  6. Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
  7. Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
  8. Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
  9. Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
  10. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  11. Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
  12. Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10(2018).
  13. Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
  14. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  15. Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
  16. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56(2011).
  17. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282(2014).
  18. Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
  19. Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
  20. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  21. Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
  22. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3(2006).
  23. Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
  24. Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29(2004).
  25. Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4(2015).
  26. Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
  27. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  28. Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
  29. Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
  30. Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2(2005).
  31. Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22(2017).
  32. Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
  33. Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
  34. Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
  35. Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionRNA SequencingSpatial Gene ExpressionTemporal Gene ExpressionTissue FixationParaffin EmbeddingTissue SectioningRNA ExtractionProfilingBarley Embryo

Related Articles