الإنتاج الآلي من الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المشتقة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية القشرية والدوبامين مع المتكاملة مراقبة الخلايا الحية

Ashutosh Dhingra; Joachim Täger; Elisangela Bressan; Salvador Rodriguez-Nieto; Manmeet-Sakshi Bedi; Stefanie Bröer; Eldem Sadikoglou; Noémia Fernandes; Melissa Castillo-Lizardo; Patrizia Rizzu; Peter Heutink

doi:10.3791/61525

مقالة منهجية

الإنتاج الآلي من الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المشتقة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية القشرية والدوبامين مع المتكاملة مراقبة الخلايا الحية

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61525

⸱

أغسطس 6, 2020

Ashutosh Dhingra^*¹ , Joachim Täger^*¹ , Elisangela Bressan^*¹ , Salvador Rodriguez-Nieto¹ , Manmeet-Sakshi Bedi¹ , Stefanie Bröer¹ , Eldem Sadikoglou¹ , Noémia Fernandes² , Melissa Castillo-Lizardo¹ , Patrizia Rizzu² , Peter Heutink¹^,³

¹Genome Biology of Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), ²Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), ³Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نظهر أتمتة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC) والثقافات والتمايزات العصبية المتوافقة مع التصوير الآلي والتحليل.

الملخص

من الصعب توحيد الثقافات اليدوية وبروتوكولات التمايز للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من البشر ، وإظهار التباين العالي ، وهي عرضة للتمايز التلقائي في أنواع الخلايا غير المرغوب فيها. وهذه الأساليب كثيفة العمالة ولا يسهل أن تكون قابلة للتجارب الواسعة النطاق. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير نظام ثقافة الخلايا الآلي مقرونًا بنظام تصوير عالي الإنتاجية وبروتوكولات تنفيذها للحفاظ على خطوط hiPSC متعددة في التمايز المتوازي والخلوي. نحن نصف أتمتة بروتوكول التمايز على المدى القصير باستخدام Neurogenin-2 (NGN2) الإفراط في التعبير لإنتاج الخلايا العصبية القشرية المستمدة من hiPSC في غضون 6\u20128 أيام، وتنفيذ بروتوكول التمايز على المدى الطويل لتوليد الخلايا العصبية الدوبامين منتصف البرية المشتقة من hiPSC (mDA) في غضون 65 يوما. أيضا، طبقنا نهج NGN2 على خلايا السلائف العصبية الصغيرة المشتقة من الجزيء (smNPC) التي تم تحويلها مع فيروس العدس GFP وأنشأنا مقايسة نيوريت الأوتوماتيكية الحية. نقدم نظامًا آليًا مع بروتوكولات مناسبة لثقافة hiPSC الروتينية والتمايز إلى الخلايا العصبية القشرية والدوبامينية. منصتنا مناسبة لثقافة طويلة الأجل خالية من اليدين وعالية المحتوى / عالية الإنتاجية المركب القائم على hiPSC ، RNAi و CRISPR / Cas9 فحص لتحديد آليات الأمراض الجديدة وأهداف المخدرات.

المقدمة

الخلايا الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات (hiPSC) هي تجديد ذاتي ويمكن أن تفرق في أي نوع خلية بالغ تقريبا. هذه الخصائص تجعل hiPSC أداة مفيدة لنمذجة الأمراض في البحوث الأساسية واكتشاف المخدرات¹. يحتفظ iPSC الإنسان الخلفية الوراثية المانحة التي تسمح اشتقاق أنواع الخلايا ذات الصلة بالأمراض التي هي الأكثر تضررا / المشاركة في مسار المرض، على سبيل المثال، الأنواع الفرعية العصبية المختلفة للأمراض العصبية²^،³. أيضا، hiPSC يتغلب على بعض القيود على نماذج الإفراط في التعبير الحيواني والخلوي من خلال نموس الأمراض في سياق الإنسان ومستويات التعبير عن البروتين الفسيولوجية، وقد ثبت أن رصيدا قيما في النمذجة الأمراض التي تتراوح بين اضطرابات أحادية الحساسية، معقدة و اللاجينية، فضلا عن الأمراض في وقت متأخر من الظهور⁴.

وعلى الرغم من هذه الفوائد والفرص، لا تزال هناك عدة قيود على الإعاقة التي لا تزال بحاجة إلى معالجة. إن الثقافة الحالية للبروتوكولات الخاصة بالهون اPsc والتمايز ليست فعالة من حيث التكلفة، ويصعب توحيدها، وهي كثيفة العمالة. خطوات الثقافة اليدوية يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع في التغير في الغلة والأنماط الظاهرية بسبب الاختلافات في النمو والتمايز التلقائي من hiPSC. ولذلك، تحتاج إلى تقليل التباين المعتمد على التجربة عن طريق تنفيذ تقنيات معالجة أكثر توحيدا وتبسيط البروتوكولات التي يمكن تحقيقها باستخدام الأتمتة^5. وسيحدد إنشاء بروتوكولات للثقافة والتمايز الآليين للـهيبسك معايير مشتركة لكل من مشاريع البحوث الأكاديمية والصناعية، ويسمح بتوليد نماذج للأمراض ذات الصلة بيولوجياً ونتائج أكثر قابلية للتكرار.

وقد حاول العمل السابق أتمتة الثقافات hiPSC⁶^،⁷^،⁸ ولكن تم تقييد بروتوكولاتها إلى صيغ لوحة ثقافة الخلية محددة تعتمد على النظام وتفتقر إلى القدرة على التكيف مع مختلف أشكال المقايسة. هذه الأنظمة مفيدة في يستكثر من الخلايا ولكن قد لا تكون مناسبة للتمايز الآلي في أنواع الخلايا المطلوبة، وفرز المرض، وأغراض الفرز. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف منصة آلية واسعة النطاق لاشتقاق الخلايا الليفية ، وتوليد hiPSC والتمايز⁹ ولكن على نطاق لا يمكن تحقيقه إلا من قبل المختبرات عالية الإنتاجية المخصصة لإنتاج خطوط التي تبدو جذابة ولكن يمكن أن تكون غير محتملة بالنسبة للعديد من المختبرات الأكاديمية.

لقد طورنا نظامًا آليًا بالكامل لثقافة الخلايا استنادًا إلى محطة معالجة سائلة في بيئة مصفاة للهواء الجسيمات عالي الكفاءة (HEPA) بالتزامن مع حاضنة CO₂ ذات سعة كبيرة ، ومقياس هواء التصوير المضيء وذراعًا روبوتيًا لنقل الألواح. وتوفر هذه المكونات الأساس لثقافة وتمايز hiPSC مستقرين ويمكن استنساخه. أكملنا النظام مع نظام تخزين آلي -20 درجة مئوية لتخزين المركب أو الفيروسات وصورة قرص غزل عالية السرعة كونفوكال الخلايا الحية. تم إنشاء بروتوكولات مصنوعة حسب الطلب تسمح بذر الخلايا الآلي ، وتغييرات الوسائط ، وفحوصات الالتقاء ، وتوسيع الخلايا ، وتوليد لوحة الفحص مع معالجة العينات وتصوير الألواح ، مما يجعل النظام متوافقًا مع فحوصات عالية المحتوى / عالية الإنتاجية. يتم تشغيل نظام الخلايا وثقافة التصوير الآلي باستخدام برنامج التحكم وواجهة المستخدم الرسومية المصنوعة حسب الطلب (GUI). تسمح واجهة المستخدم الرسومية للمستخدمين باستيراد ملفات CSV التي تحتوي على معلمات خاصة بخط الخلية المطلوبة لتنفيذ الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، تمكن واجهة المستخدم الرسومية من جدولة العديد من التجارب في أي تسلسل باستخدام طريقة عرض التقويم المضمنة مما يسمح بالتحكم الكامل في الوقت الذي يبدأ فيه كل أسلوب.

يستخدم نظام ثقافة الخلايا الآلي لدينا سرعات الأنابيب القياسية ، وأوقات المرور ، وعتبات الالتقاء ، وكثافات البذر ، والأحجام المتوسطة مع المرونة لخلايا الثقافة في مجموعة متنوعة من تنسيقات الألواح (96 -، 48 - ، 24 - ، 12 - ، 6 - أو تنسيق لوحة 1 well). نحن تكييفها نشرت مؤخرا بروتوكول التمايز على المدى القصير لتحويل hiPSC إلى الخلايا العصبية التي يمكن أن تسفر عن الخلايا العصبية إيجابية TUBB3 في 6 أيام¹⁰^,¹¹. أنشأنا أيضا التمايز الآلي والتصوير من الخلايا جزيء صغير السلائف العصبية (smNPC) في الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP تحت EF1a المروج¹² و iPSC في الخلايا العصبية الدوبامين منتصف القرنية (mDA) ، والتكيف مع بروتوكول تثبيط المزدوج SMAD المنشورة سابقا¹³ أن تسفر عن الخلايا العصبية mDA في غضون 65 يوما.

البروتوكول

1. الإجراءات الأساسية لأتمتة الثقافات الخلية والتصوير

تحميل لوحات ونصائح جديدة
1. افتح واجهة المستخدم الرسومية وانقر على زر عرض عملية المورد/الأداة. لتشغيل أي عملية مورد / أداة ، حدد عملية المورد / الصك وانقر على زر تشغيل أداة العملية.
2. تشغيل عملية الموارد RunHepaHood وإعادة تحميل (راجع الخطوة 1.1.1). فتح الباب، تحميل لوحات ثقافة الخلية والنصائح المتاح في الموقف المقابل كما هو مبين في الصورة المنبثقة على جهاز الكمبيوتر المسيطر.
3. امسح الباب بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة التلوث وإغلاقه. تشغيل عملية أداة إزالة التلوث من واجهة المستخدم الرسومية (انظر الخطوة 1.1.1). يحصل على تعقيم النظام بواسطة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
إعادة ملء وسائل الإعلام الثقافة و / أو مُشفر الانفصام
1. تنفيذ خطوة أداة RunHepahood (راجع الخطوة 1.1.1). افتح الباب الأمامي لمحطة معالجة السوائل. خزانات إزالة التلوث (تحتوي على وسائل الإعلام، برنامج تلفزيوني و / أو معجون تفكك) مع 70٪ الإيثانول ووضعها على سطح السفينة إلى بوزيتون المعين (كما هو محدد في cfg.csv ملف). -فكّوا غطاء الخزانات
2. إزالة التلوث الباب مع 70٪ الإيثانول وإغلاقه. السلطة أسفل غطاء محرك السيارة HEPA من خلال تشغيل عملية الموارد / الصك "InitHepaHood" من واجهة المستخدم الرسومية.
إنشاء "خط الخلية" ومشروع جديد في واجهة المستخدم الرسومية
1. إنشاء/تعديل ملفات "خط الخلية" المعرفة من قبل المستخدم التي تتكون من ملفات التكوين (*.cfg.csv) ، الاستيراد (*.imp.csv) ، المورد (*.rsv.csv) وملفات سير العمل (*.wfl.csv).
2. فتح واجهة المستخدم الرسومية وإنشاء جديد "خط الخلية" عن طريق النقر فوق الزر إضافة خط الخلية في طريقة العرض "محرر خط الخلية". يتم فتح معالج حيث يجب تحديد ملف التكوين كما يجب إدخال اسم مشروع له وصف قصير.
3. التنقل عبر هذا المعالج باستخدام رأس السهم الأخضر وتأكيد الإعدادات بالنقر فوق علامة الاختيار الخضراء. إنشاء مشروع جديد "خط الخلية" التي تم إنشاؤها عن طريق النقر فوق الزر إضافة مشروع.
4. أدخل اسم المشروع ووصفه وحدد لون مشروع سيكون مرئياً في طريقة عرض التقويم الخاصة بواجهة المستخدم الرسومية. انتقل إلى الصفحة التالية من المعالج بالنقر فوق رأس السهم.
5. إنشاء دفعة جديدة عن طريق النقر على زر إضافة دفعة وإعطاء اسم قصير ووصف في النافذة المنبثقة. حدد كافة خطوات العملية وقم بجدولة وقت البدء لكل خطوة من خطوات العملية. إغلاق النافذة بالنقر على موافق.
تنفيذ أسلوب تلقائي باستخدام واجهة المستخدم الرسومية
1. انتقل إلى طريقة عرض التقويم الخاصة بواجهة المستخدم الرسومية وانقر على الزر "إضافة خطوة عملية".
2. حدد خط الخلية وبعد الانتقال إلى الصفحة التالية من المعالج اختر المشروع. وضع علامة على الدفعة التي سيتم استخدامها وانقر على رأس السهم مشيرا إلى اليمين. اعتمادا على الطريقة المستخدمة، يجب أن تكون دفعات إما فارغة (لاستقبال لوحات جديدة)، أو تحتوي على لوحات الثقافة أو لوحات المقايسة (جميع العمليات الأخرى).
3. انتقل إلى الصفحة التالية من المعالج وحدد خطوة العملية التي يجب تنفيذها. انتقل إلى الصفحة الأخيرة من هذا المعالج وقم بجدولة التجربة. في المقطع يمكن تعديل المتغيرات "تفاصيل معلمة" التي تحتاج إلى تشغيل الأسلوب. تأكيد بالنقر فوق موافق.
تحميل لوحات الثقافة والمكاة في حاضنة CO₂
ملاحظة: يتم تعريف لوحات 1-well كلوحات الثقافة منذ أنها تستخدم عادة إلى الخلايا الكبيرة. يتم تعريف جميع لوحات متعددة جيدا كما لوحات فحص.
1. تنفيذ عملية أداة "RunHepaHood" من واجهة المستخدم الرسومية كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. وفتح الباب أمام الذراع الروبوتية.
2. امسح الجزء السفلي من لوحات الفحص مع الإيثانول بنسبة 70٪ وأنسجة خالية من الوبر إذا تم تحميل اللوحات للتصوير الآلي. وضع ثقافة أو لوحات فحص على الرف الأيسر. تأكد من أن اتجاه لوحة الصحيح. للوحات فحص، وأيضا A1 أن نشير نحو الذراع الروبوتية في حين أن حواف لوحات الثقافة يجب أن تشير إلى اليمين.
3. امسح الباب بنسبة 70٪ من الإيثانول لإزالة التلوث وإغلاقه.
4. تنفيذ الأسلوب "تحميل لوحات الثقافة" لاستيراد ألواح 1-بئر أو "تحميل لوحات مُكَلّم" لاستيراد لوحات متعددة البئر كما هو موضح في الخطوة 1.4. استخدام دفعة فارغة لتشغيل كلا الأسلوبين. إذا كانت الباركود لوحة موجودة بالفعل في هذه الدفعة، قم بإلغاء تحديدها بالنقر على خانات الاختيار.
5. نقل لوحات فردية من الرف إلى منصة حاضنة CO₂ باستخدام الذراع الروبوتية. تقوم محطة نقل اللوحات المدمجة باسترداد اللوحة وتخزينها في أحد رفوف حاضنة CO_2. يتم الاحتفاظ الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
تفريغ اللوحات من حاضنة CO₂
1. تنفيذ الأسلوب "إلغاء تحميل لوحات" (راجع الخطوة 1.4). حدد المجموعة التي تحتوي على اللوحات التي تحتاج إلى تصدير. يمكن اختيار لوحات الفردية من قبل الباركود الخاصة بهم.
2. نقل لوحات من CO₂ حاضنة إلى الرف الأيسر باستخدام الذراع الروبوتية.
3. بدء تشغيل غطاء محرك السيارة HEPA باستخدام عملية الصك "RunHepaHood" كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. وفتح الباب أمام الذراع الروبوتية. إزالة لوحات، وإزالة التلوث الباب مع 70٪ الإيثانول قبل إغلاقه والسلطة أسفل غطاء محرك السيارة HEPA.

2. بروتوكولات التشغيل الآلي

بذر من لوحات من أنابيب
1. بدء غطاء محرك السيارة HEPA عن طريق تنفيذ عملية الصك RunHepaHood (انظر الخطوة 1.1.1). افتح الباب أمام محطة المناولة السائلة. إدخال أنبوب 50 مل تحتوي على تعليق الخلية وفك غطاء الأنبوب.
2. افتح الباب أمام الذراع الروبوتية وحمّل لوحات الثقافة المغلفة لاستقبال الخلايا على الرف. تطهير وإغلاق كلا البابين. تنفيذ طريقة "بذر لوحات من أنابيب" (انظر الخطوة 1.4).
3. عد الخلايا في مقياس الخلايا التصوير brightfield باستخدام وظيفة العد الخلية المباشرة. بالنسبة لعد الخلايا، استخدم 16 بئرًا كمحاكاة في تنسيق لوحة 384 well.
4. نقل لوحة العد 384 جيدا من سطح السفينة إلى المقياس الهوائي التصوير brightfield عبر القرص الدوار باستخدام الذراع الروبوتية وبدء عملية التصوير. يحدد مقياس الخلايا تلقائيًا رقم الخلية لكل ملليلتر. إعادة لوحة العد إلى موقعها الأصلي باستخدام الذراع الروبوتية.
5. نقل ثقافة المغلفة أو لوحة فحص من الرف إلى سطح الأنابيب باستخدام الذراع الروبوتية. إزالة الطلاء والخلايا البذور في عدد المعرفة من قبل المستخدم، وحجم مناسبة لتنسيق لوحة (انظر الجدول 1). حرك اللوحة إلى الشاكر على السطح لمدة 10 ق في 500 دورة في الدقيقة لتوزيع الخلايا ونقلها إلى CO₂ حاضنة.
تقييم الالتقاء الآلي
1. تنفيذ الأسلوب "التحقق من التقاء" كما هو موضح في الخطوة 1.4. حدد دفعة تحتوي على لوحة ثقافة واحدة على الأقل ولا توجد لوحات مقايسة. في قسم "تفاصيل المعلمة" إدخال "iPSCf_2020" للحصول على الصور وإعدادات تحليل التصوير.
2. نقل اللوحة الأولى من حاضنة CO₂ إلى مقياس التصوير في الملعب الساطع عبر القرص الدوار باستخدام الذراع الروبوتية.
3. إجراء تصوير الخلايا في مقياس الخلايا التصوير brightfield للتحقق من التقاء المستعمرات hiPSC. استخدام "التقاء" وتطبيق صورة 13 حقول من 1-جيدا pate وحساب تلقائيا متوسط المساحة التي تحتلها الخلايا.
4. نقل لوحة العودة إلى CO₂ حاضنة باستخدام الذراع الروبوتية. كرر الخطوات 2.2.2. إلى 2.2.4. للوحات المتبقية.
تغيير وسائل الإعلام لوحات الثقافة أو لوحات المقايسة
1. تنفيذ الأسلوب "وسائط تغيير لوحات الثقافة" كما هو موضح في الخطوة 1.4. وحدد دفعة تحتوي على لوحات البيانات الموروثة فقط. تعيين المتغير يشير إلى ما إذا كانت النصائح أو الإبر تستخدم لخطوات الأنابيب في القسم "تفاصيل المعلمة". لتغيير وسائل الإعلام من أي لوحة متعددة جيدا، تنفيذ طريقة "تغيير وسائل الإعلام من لوحات مقايسة" وحدد دفعة تحتوي على لوحات المقايسة.
2. نقل لوحات الفردية من CO₂ حاضنة إلى سطح السفينة باستخدام الذراع الروبوتية وفك غطاء لوحات. إمالة لوحات تلقائيا وpirate الوسائط القديمة والتخلص منه في وحدة جمع النفايات. إضافة 12 مل من وسائل الإعلام الطازجة. إعادة غطاء لوحة ونقل لوحات العودة إلى CO₂ حاضنة باستخدام الذراع الروبوتية.
التّجَلّج الفرعي
ملاحظة: تنفيذ عملية الصك "RunHepaHood" من واجهة المستخدم الرسومية كما هو موضح في 1.1.1. وفتح الباب الأمامي لمحطة معالجة السائل. تحميل وسائل الإعلام والتفكك كاشف في المواقف المطلوبة (انظر الخطوة 1.2). إذا كان يلزم إعادة ملء التلميحات، استخدم "إعادة التحميل" كما هو موضح في الخطوة 1.1. إدخال أنبوب 50 مل لتلقي تعليق الخلية وفك غطاء الأنبوب.
1. تنفيذ الأسلوب "subcultivation من الخلايا المنضمة" (راجع الخطوة 1.4). حدد المجموعة التي تحتوي على لوحات البيانات الموروثة التي تحتاج إلى زراعة فرعية.
2. نقل لوحات من CO₂ حاضنة إلى سطح السفينة باستخدام الذراع الروبوتية وفك غطاء لوحات. إمالة لوحات تلقائيا وإزالة الوسائط القديمة والتخلص منه في وحدة جمع النفايات. غسل الخلايا مرة واحدة مع 8 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 8 مل من 0.5 mM EDTA لتمريم كتلة على أساس. احتضان على سطح السفينة لمدة 8 دقائق.
3. إزالة حل EDTA من اللوحات والتخلص منه في وحدة جمع النفايات. إضافة 12 مل من المتوسطة الطازجة ونقل لوحات إلى شاكر. يهز في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة لطرد المستعمرات.
4. إعادة التورث تعليق الخلية لخمس دورات من الأنابيب لكسر المستعمرات iPSC إلى حجم أصغر (~ 50\u201280 μm). نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل على سطح السفينة. خلايا البذور تلقائياً كما هو موضح في الخطوة 2.1.5 باستخدام نسبة تقسيم 1 في 7.
  ملاحظة: اختياري، تمرير خلية واحدة. إنشاء تعليق خلية واحدة باستخدام كاشف تفكك خلية واحدة (انظر جدول المواد). بدلاً من 0.5 mM EDTA في الخطوة 2.4.2., استخدم 8 مل من خلية واحدة انفصام كاشف واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 مل وإضافة حجم متساو من وسائل الإعلام. التفكك باستخدام كاشف تفكك الخلية واحد يتطلب خطوة يدوية ل بيليه الخلايا. خلايا الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق. إزالة افرنح وإعادة فرض بيليه الخلية في 12 مل من وسائل الإعلام المطلوبة والمضي قدما مع "بذر لوحات من الأنابيب" (انظر الخطوة 2.1). تكملة وسائل الإعلام مع 2 μM ثيازوفيفين في يوم البذر عند استخدام تعليق خلية واحدة من هيبس.
التصوير الآلي عالي المحتوى وعالي الإنتاجية
ملاحظة: يجب أن يكون إعداد القياس متاحًا (راجع الملف التكميلي 1:الخطوة 1.1). لوحات المقايسة التي سيتم تصويرها متوفرة في الحاضنة.
1. تنفيذ الأسلوب "Imaging" (راجع الخطوة 1.4). حدد دفعة تحتوي على لوحة فحص واحدة على الأقل ولا توجد لوحة ثقافة. في القسم "تفاصيل المعلمة"، أدخل نوع اللوحة، وتعريفات اللوحة (للوحات التصوير القياسية 96-جيداً: "Plate-96-20170918113842") واسم إعداد القياس.
2. نقل لوحة المقايسة عبر القرص الدوار إلى المجهر confocal الآلي باستخدام الذراع الروبوتية لبدء عملية التصوير. استعادة لوحة في نهاية التصوير من المجهر ونقلها مرة أخرى إلى CO₂ حاضنة. كرر عملية اللوحات المتبقية في المجموعة.

3. الصيانة الآلية والتوسع في hiPSC

تسلسل عمليات الالتقاء الآلي، وتغييرات الوسائط وتفرعات
1. خلايا البذور على لوحات 1-بئر باستخدام "البذر من لوحات من أنابيب" طريقة (انظر الخطوة 2.1). بدلاً من ذلك، استيراد يدوياً بذر 1-آبار لوحات باستخدام طريقة "تحميل لوحة الثقافة" (انظر الخطوة 1.5).
2. جدولة الشيكات التقاء الآلي يوميا لمراقبة نمو مستعمرة من يوم 1 إلى 6 من ثقافة ل iPSC (انظر الخطوة 2.2).
3. تحديث الوسائط كل يوم الثاني باستخدام أسلوب "تغيير الوسائط لوحات الثقافة" (راجع الخطوة 2.3). يتم استخدام 12 مل من المتوسطة لكل لوحة.
4. في اليوم 6 بدء عملية "subcultivation" (راجع الخطوة 2.4.).

4- التمايز الآلي

iPSC الإنسان إلى الخلايا العصبية NGN2 القشرية
ملاحظة: إعداد hiPSC يدوي. ويتضمن البروتوكول التعبير المفرط عن الجيل الثاني NGN2 باستخدام ناقلات النيسايفيرال للتسليم. عبر هبس مع NGN2 إلى rTTA3 العدسي في نسبة 1:2 (> ~ 10⁷ TU / مل). ثم يتم اختيار الخلايا لممر واحد مع 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين. يوجد بروتوكول مفصل لتوليد خطوط hiPSC-NGN2 مستقرة في الملف التكميلي 1: الخطوة 2.
1. متابعة عملية "subcultivation" كما هو موضح باستخدام كاشف تفكك خلية مفردة الموصوفة في ملاحظة الخطوة 2.4.4. عندما hiPSC تصل إلى 70\u201280٪ التقاء
2. إزالة فائقة و resuspend بيليه الخلية في 12 مل من وسائط NGN2(جدول المواد)التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين (دوكس) و 2 μM الثيازيفوفيفين.
3. بدء التمايز باستخدام "بذر لوحات منأنابيب" طريقة (انظر الخطوة 2.1). تعيين كثافة البذر المطلوبة من iPSC إلى 30،000/cm² (انظر الجدول 1). يتم طلاء iPSC على لوحات مغلفة مسبقًا بـ 0.1 ملغم/مل بولي-إل-أورنيثين (PLO) و5 ميكروغرام/مل لامين.
  ملاحظة: يفضل ألواح 1-well للدراسات المستندة إلى RNA و البروتيوم بينما يفضل تنسيق لوحة 96 جيدا لتجارب التصوير. ويمكن أيضا أن تستخدم غيرها من صيغ لوحة المقايسة مثل 48-، 24-، 12- أو 6-جيدا لوحات.
4. في اليوم 1 من التمايز، تحديث الوسائط باستخدام "تغيير الوسائط للوحات الفحص (انظر الخطوة 2.3) باستخدام وسائط NGN2، تستكمل مع 2.5 ميكروغرام / مل دوكس و 10 μM N-[2S-(3،5-difluorophenyl)أسيتيل]-L-alanyl-2-phenyl-glycine، 1،1-dimethylethyl استر (DAPT). استمر في تغيير الوسائط كل 2\u20123 يوم حتى اليوم المطلوب من التمايز (انظر الخطوة 2.3).
5. في اليوم 4 من التمايز، قم بإجراء تغيير آخر في الوسائط (انظر الخطوة 2.3.) باستخدام متوسط NGN2 مكمّل بعامل نوتري مشتق من 10 نانوغرام/مل (BDNF)، 10 نانوغرام/مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا (GDNF) وعامل التغذية العصبية 10 نانوغرام/مل (NT-3) لتعزيز النضج. في نهاية التجربة، تصدير لوحات الثقافة من النظام للتجارب المصب (انظر الخطوة 1.6).
خلايا جزيء صغيرة السلائف العصبية (smNPC) إلى الخلايا العصبية NGN2
ملاحظة: اشتقاق smNPC التالية الإصدار المكيّف من بروتوكول^{منشور 12} (راجع الملف التكميلي 1: الخطوة 5). تعديل smNPC مع فيروس NGN2 و rTTA3 (انظر الملف التكميلي 1: الخطوة 2). جولة واحدة من NGN2 و rTTA transduction كافية لتوليد سكان مستقرة. مزيد من تعديل smNPC مع pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 العدسي يسمح لأداء مراقبة الخلايا الحية. يتم استخدام تعدد العدوى (MOI) من 10 لـ GFP في تحويل فيروسات الجهاز.
1. smNPC مرور على الوصول إلى التقاء باستخدام كاشف تفكك خلية واحدة كما هو موضح في الخطوة 2.4. ملاحظه.
2. خلايا البذور باستخدام نظام زراعة الخلايا الآلي بكثافة خلية 50000/cm² باستخدام طريقة "بذر الصفائح من الأنابيب" (انظر الخطوة 2.1.) على لوحات مسبقة المغلفة مع 0.1 ملغ/مل PLO، و5 ميكروغرام/مل لامين في المتوسط NGN2 مكمّل بـ 2.5 ميكروغرام/مل دوإكس.
3. في اليوم الثالث، قم بإجراء تغيير في الوسائط (انظر الخطوة 1.3.) باستخدام 1.3.) باستخدام 1.3 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بعد اليوم 3، إجراء تغييرات الوسائط كل ثلاثة أيام مع 10 نانوغرام 2 المتوسطة الطازجة التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل دوكس، BDNF، GDNF وNT-3 في 10 نانوغرام / مل لكل من.
4. خلايا الصورة يوميا باستخدام "المحتوى الآلي عالية، عالية الإنتاجية التصوير طريقة " (انظر الخطوة 2.5) لرصد حالة التمايز باستخدام GFP كمطالعة لبثقة neurite. تعيين قوة الليزر إلى 80٪ واستخدام وقت التعرض من 30 مللي ثانية. الحصول على عدد كبير من الحقول (مثل 25 حقلا) باستخدام الهدف 20x.
تحليل صورة الدفعة
1. إجراء تحليل الصور مع برنامج تحليل الصور 1، وذلك باستخدام قالب نوريتج.
2. افتح البرنامج. حدد الخيار "البيانات" وتصفح إلى مجلد بيانات التصوير، انقر فوق موافق لتحميل البيانات لتحليلها. انقر فوق فتح ومن شريط القائمة العلوي، حدد البروتوكول ومن قائمة التطبيق حدد neurite outgrowth. انتقل إلى "الخوارزميات" واستخدم قناة "488" لتحديد النواة، جسم الخلية ونيوريت. ضبط معلمات العتبة لكل منها.
3. حدد الآبار التي سيتم استخدامها لتحليل الصور. على أسفل فوق الزر الأيمن الارتباط وحدد الميزات التي سيتم تحليلها مثل متوسط عدد الخلايا، مجموع إجمالي طول الهيكل العظمي. المضي قدما مع "تحليل ما قبل" تليها "معاينة".
4. تحقق مما إذا كانت إعدادات المعاينة مقبولة، ثم ابدأ التحليل في وضع الدفعة. تتوفر النتائج في المجلد الأصل ضمن "تقارير" بتنسيق ملف .csv يمكن فتحه في excel.
  ملاحظة: برنامج نصي لتحليل الصور متوفر عند الطلب.
5. رسم متوسط طول neurite التي تم الحصول عليها من قبل الطول الكلي neurite تطبيعها إلى رقم الخلية.

5. التمايز الآلي من hiPSC في الخلايا العصبية في منتصف الفقرات (mDA)

إعداد hiPSC يدوي
1. افصل 70\u201280٪ التقاء hiPSC في خلايا واحدة باستخدام كاشف تفكك الخلية واحد. لفترة وجيزة، والخلايا الحاضنة مع كاشف تفكك خلية واحدة (100 ميكرولتر/سم²⁾لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي، الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق و resuspend خلية بيليه في iPSC ثقافة المتوسطة.
2. بذور 200،000 خلية / سم² على خارج الخلية مصفوفة المغلفة 1-آبار لوحات و iPSC ثقافة المتوسطة تكملها 10 μM Y-27632. الخلايا الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
التمايز الآلي: المرحلة الأولى
1. إعداد نظام الثقافة التلقائي كما هو موضح في الخطوة 1.1\u20121.2.
2. قم بتحميل لوحات الثقافة التي تحتوي على خلايا في حاضنة CO₂ لنظام الثقافة الآلي (انظر الخطوة 1.5).
3. إعداد KSR المتوسطة (انظر جدول المواد)والملحق مع جزيئات صغيرة (انظر الجدول 2)اللازمة لبدء يوم 0 من التمايز. استخدام وسائل الإعلام فقط حديثا مع الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو.
4. إجراء تغييرات الوسائط لوحات الثقافة كما هو موضح في الخطوة 2.3 في أيام 0 و 1 من التمايز ثم كل يوم ثاني حتى يوم 25.
5. من اليوم الخامس، تحول صياغة الوسائط تدريجيا كما هو موضح بالتفصيل في الجدول 3.
6. في يوم 11، إضافة mDA العصبية تمايز المتوسطة تكملها CHIR (حتى اليوم 13)، BDNF، AA1، GDNF، DB-cAMP، TGFß3 وDAPT (انظر جدول المواد).
7. في يوم 25 إلغاء تحميل لوحات (راجع الخطوة 1.6.)
إعادة طلاء يدوي 1
1. افصل يوم 25 السلائف mDA في خلايا واحدة باستخدام كاشف تفكك خلية واحدة. لفترة وجيزة، والخلايا احتضان مع كاشف تفكك خلية واحدة (100 ميكرولتر/سم²⁾لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية، وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي، الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق و resuspend خلية بيليه في mDA تمايز الخلايا العصبية المتوسطة.
2. البذور 400،000 الخلايا / سم² في 1-جيدا لوحات ثقافة المغلفة مسبقا مع 0.1 ملغ / مل منظمة التحرير الفلسطينية، 10 ميكروغرام / مل اللامينين و 2 ميكروغرام / مل fibronectin في mDA تمايز الخلايا العصبية المتوسطة تكملها 10 μM Y-27632 (حتى اليوم 26) والجزيئات الصغيرة وعوامل النمو الموصوفة في الجدول 2. الخلايا الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
التمايز الآلي: المرحلة 2
1. تحميل لوحات الثقافة التي تحتوي على الخلايا العصبية mDA في حاضنة CO₂ من نظام الثقافة الآلي كما هو موضح في الخطوة 1.5
2. إعداد mDA العصبونية التمايز المتوسطة (انظر جدول المواد)والمكمل مع جزيئات صغيرة وعوامل النمو اللازمة للتمايز النهائي من اليوم 26 فصاعدا (انظر الجدول 2).
3. إجراء تغييرات الوسائط لوحات الثقافة كما هو موضح في الخطوة 2.3 في يوم 26 من التمايز ثم كل 3\u20124 أيام حتى يوم 65.
  ملاحظة: لأغراض التصوير عالية الإنتاجية، فمن المستحسن إعادة الخلايا العصبية mDA في 96-جيدا لوحات في الكثافة المنخفضة في يوم 32 من التمايز، كما هو موضح في الخطوة 5.5.
إعادة طلاء يدوي 2
1. إلغاء تحميل لوحات البيانات الموروثة كما هو موضح في الخطوة 1.6. فصل يوم 32 الخلايا العصبية mDA في خلايا واحدة كما هو موضح في الخطوة 5.3.1.
2. البذور 100،000 الخلايا / سم² في 96-جيدا لوحات المغلفة مسبقا مع 0.1 ملغ / مل PLO، 10 ميكروغرام / مل لامينين و 2 ميكروغرام / مل في الليفية mDA التمايز المتوسطة تكملها 10 μM Y-27632 (حتى اليوم 33) والجزيئات الصغيرة وعوامل النمو (انظر الجدول 2). الخلايا الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
3. في اليوم 33، استبدال المتوسطة من قبل الخلايا العصبية DA أعدت حديثا التمايز المتوسطة تكملها جزيئات صغيرة وعوامل النمو (دون Y-27632). تغيير متوسطة يدوياً كل 3\u20124 أيام حتى يوم 65.

6. المناعة ، الآلي عالية الإنتاجية اقتناء الصور وتحليلها

تلطيخ الفلوريسنس
1. تنفيذ الحساسية المناعية الفلورية كما هو موضح في الملف التكميلي 1: الخطوة 4.
2. خلايا الصورة كما هو موضح في الملف التكميلي 1: الخطوة 1.2.
3. تحميل ملفات التصوير التي تم إنشاؤها بواسطة نظام التصوير إلى برنامج تحليل الصور 2 (راجع جدول المواد)لمزيد من تحليل الصور، كما هو موضح في الخطوة 6.2.
تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور 2
1. مرة واحدة يتم تحميل ملفات التصوير في برنامج تحليل الصور 2، انتقل إلى وظيفة "تحليل الصور" وبناء خوارزمية التحليل باستخدام القائمة المنسدلة.
2. حدد نوى باستخدام مهمة "العثور على النوى" ، والتي تكشف المناطق على الصورة التي تنتمي إلى نواة الخلية (هنا ملطخة Hoechst). استبعاد النوى من الخلايا الميتة (النوى الـpyknotic) عن طريق تحديد عتبة للمنطقة النووية أو القطر.
3. حدد سيتوبلازم الخلية باستخدام مهمة "العثور على السيتوبلازم". هذه المهمة بالكشف عن المناطق حول النوى التي تنتمي إلى سيتوبلازم الخلية. قم بتضمين الخلايا ذات الأجزاء المجزّأة بشكل جيد فقط. استبعاد الخلايا الميتوتيكية، المبرمجة وجزئية بشكل سيئ. إزالة الخلايا التي تلمس حدود الصورة.
4. إضافة المهام "حساب خصائص مورفولوجيا" و "حساب خصائص الكثافة". وتشمل معلمات مورفولوجيا حساب خصائص المورفولوجيا مثل المنطقة التي تهمها. وتشمل بارامترات الكثافة حساب خصائص الكثافة مثل شدة المتوسط لمنطقة ذات أهمية (مثل سيتوبلازم الخلايا العصبية).
5. حدد مجموعة فرعية (مثل الخلايا العصبية الإيجابية TH) من السكان المدخلات (جميع السيتوبلازمات المختارة) باستخدام واحد أو أكثر من الشروط، مورفولوجيا و / أو كثافة.
  ملاحظة: عادة، يتم اختيار كثافة للخلايا العصبية. استناداً إلى الضوابط السلبية, فمن الممكن لتحديد فوق أي عتبة كثافة تعتبر الخلايا العصبية إيجابية لTH.
6. تعريف نتائج المخرجات. هذا هو آخر لبنة بناء لكل تحليل. وهو يحدد قيم القراءة المقايسة لكل بئر من لوحة الثقافة (النتائج في البئر).
7. قم بتشغيل تحليل الدُفعة وتصدير النتائج. تطبيع عدد الخلايا الإيجابية إلى العدد الإجمالي للنيات وتمثل البيانات كنسبة مئوية من الخلايا الإيجابية.

7. كمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR)

تنفيذ بروتوكول qRT-PCR كما هو موضح في الملف التكميلي 1: الخطوة 3.

النتائج

تم تصميم نظامنا الآلي لثقافة الخلية والتصوير لتقليل التدخل البشري مما يسمح لنا بتوحيد زراعة hiPSC والتمايز في أنواع الخلايا المختلفة مثل الخلايا العصبية الدوبامين القشرية أو المتوسطة (mDA). يتم تصوير نظرة عامة تخطيطية لنظام ثقافة الخلايا الآلي مع أجهزة التصوير المتكاملة في الشكل 1. يمكن أن يتم الإدخال الأولي لثقافات الخلايا إلى نظام ثقافة الخلية الآلي هذا إما عن طريق زرع الخلايا تلقائيًا من أنبوب 50 مل أو باستخدام طريقة "تحميل لوحات الثقافة" أو "تحميل لوحات المعايرة" لاستيراد لوحات الثقافة أو الفحص. أحد المكونات المركزية لنظامنا هو محطة المناولة السائلة حيث يتم تنفيذ جميع خطوات نقل السوائل مثل تغييرات الوسائط أو عمليات التفاضل الفرعية. يتم تمثيل تخطيط سطح السفينة المخصصة من معالج السائل في الشكل 2. محطة المناولة السائلة مجهزة بأربعة مواقع. يمكن نقل ما يصل إلى أربع لوحات من الحاضنة إلى سطح السفينة ، مما يسمح بتغييرات الوسائط المتوازية. وبما أنه في طريقة التنمّج الفرعي، يجب استيعاب لوحات ثقافة الوالدين والابنة على سطح السفينة، ويقتصر الحد الأقصى لعدد لوحات الثقافة المعالجة بالتوازي على اثنين. ومن السمات الهامة لمحطة المناولة السائلة إمكانية إمالة اللوحات أثناء تغيير الوسائط من أجل الإزالة الكاملة لثقافة الخلية الفائقة. أيضا، تم تجهيز محطة معالجة السائل مع الهزازات لصالح تفكك انزيمي من الخلايا أثناء تنفيذ بروتوكول subcultivation. كما تم تجهيز نظام الثقافة الآلي لدينا مع اثنين من أنظمة التصوير: مقياس الخلايا التصوير brightfield لأداء عمليات فرز الخلايا والالتقاء، وبالتالي، رصد نمو الخلايا مع مرور الوقت، والمجهر المزدوج الغزل القرص confocal لمحتوى سريع، وارتفاع التصوير عالية الدقة من الخلايا.

يتم رصد الثقافات hiPSC يوميا للنمو في مقياس التصوير brightfield وتحليلها بالنسبة المئوية من التقاء. صورة brightfield في اللوحة اليسرى وفي اللوحة اليمنى قناع أخضر من تحليل الصورة brightfield التي تم الحصول عليها مع مقياس المقاييس (الشكل 3A). ويلاحظ نمو متجانس للهيبسك على مر الزمن، كما يتضح من النسب المئوية للالتقاء من خطين hiPSC (ن = 4 لوحات) نمت بالتوازي وتخضع لشيكات التقاء من يوم 1 إلى اليوم 6(الشكل 3B). عند الوصول إلى عتبة مجموعة، يتم تمرير هيبسك. وكانت خطوط الخلية مثقف يدويا (م) أو عن طريق الأتمتة (أ) نظام وراقبت لصيانة مورفولوجيا الخلايا الجذعية نموذجية لمقاطعين على الأقل، تمثيل صور brightfield(الشكل 4A). و هيبسك مثقف يدويا (لا يظهر) أو في النظام الآلي عرضت علامة الخلايا الجذعية النموذجية OCT4 (الأحمر) و SSEA4 (الأخضر)، كما هو مبين في مقايسة immunofluorescence(الشكل 4B). كما تم تقييم التعبير عن علامات تعدد الأطراف OCT4و NANOG و REX1 على مستوى مرنا من قبل qRT-PCR(الشكل 4C). وأجريت عمليات القياس الكمي النسبية مع عينات جمعت من خط خلية واحد تم زراعتها يدوياً (m) وفي نظام الثقافة الآلي (أ) في نسخ مكررة (النسخ المتماثلة 1 و2). مستويات التعبير من جميع علامات متعددة الأطراف الثلاثة في النسخ المتماثل المزروعة في نظام الثقافة الآلي مماثلة للتعبير علامة بعد الثقافة اليدوية. في اليوم 8 (D8) ، كان التعبير عن علامات تعدد القدرات غائبًا في الخلايا العصبية القشرية المتمايزة (Diff) عن hiPSC.

أحد التطبيقات الهامة لنظام الثقافة الآلي هو تمايز hiPSC في أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية. هنا نعرض تمايز hiPSC في الخلايا العصبية باستخدام استراتيجية NGN2 ، والتي تنتج ثقافة الخلايا العصبية القشرية النقية في وقت قصير جدا (ما يقرب من 6 أيام). الخلايا العصبية متباينة في نظام الثقافة الآلي (أ) قدم مورفولوجيا مماثلة وتنظيم شبكة الخلايا العصبية والخلايا العصبية المزروعة يدويا (م) (الشكل 5A). كانت الخلايا العصبية القشرية المؤيّدة المتمايزة إيجابية لـ TUBB3 (الفئة الثالثة الخاصة بالخلايا العصبية β-tubulin، الأحمر) وBRN2 (علامة الطبقة القشرية العليا، الأخضر)(الشكل 5B)،قابلة للمقارنة مع الخلايا العصبية المتمايزة يدويًا (البيانات غير المعروضة). التعبير عن علامات الخلايا العصبية بما في ذلك البروتين المرتبطة microtubule 2 (MAP2), جزيء التصاق الخلايا العصبية (NCAM1) وSnapsin-1 (SYN1), وكذلك علامات الخلايا العصبية القشرية BRN2 و CUX1 (الطبقة القشرية العليا) تم إثراء في الخلايا العصبية في اليوم 8 (D8) من التمايز (الشكل 5C). ولوحظت في hiPSC منخفضة جدا أو لا التعبير عن أي. وأجريت عمليات القياس الكمي النسبية مع عينات جمعت من خط خلية واحد تم زراعتها يدوياً (m) وفي نظام الثقافة الآلي (أ) في نسخ مكررة (النسخ المتماثلة 1 و2). تظهر مستويات التعبير في النسخ المتماثل تباينات مشابهة بين التمايزات اليدوية و التلقائية.

وتتيح قدرة التصوير المتكاملة لنظام الثقافة الآلي جمع بيانات بدون استخدام اليدين لصحة الثقافات مما يتيح الحصول الآلي على قراءات فينتيبيك على المدى الطويل. باستخدام نهج NGN2 إلى جزيء صغير مشتق من السلائف العصبية (smNPC) خط عبر مع GFP العدس، أنشأنا خلية حية الآلي تحليل النور الذي تم قياس طول neurite أكثر من 11 يوما من التمايز دون أي تدخل يدوي. ازداد تعقيد نيوريت مع مرور الوقت، كما يتضح من المنطقة المحتلة مع نيوريت في اليوم 1 و 3 و 11، GFP التعبير والصور ملثمين من التحليل (الشكل 6أ، ب). تم تحديد الزيادة في طول نيوريت من اليوم 1 إلى 11 من التمايز كميا وأظهرت تطورا مماثلا عبر آبار مختلفة. من أجل البساطة ، يتم تصوير البيانات من 3 أعمدة فقط مع 6 آبار من كل لوحة 96-well في الرسم البياني التمثيلي على الرغم من تحليل جميع الآبار الداخلية 60(الشكل 6C).

تطبيق آخر لنظام الثقافة الآلي هو موضح هنا هو تمايز hiPSC في الخلايا العصبية mDA. ويستند هذا التفريق على التغييرات في وسائل الإعلام بعد بروتوكول تم تحديدها مسبقا، وكان يتم تنفيذها على نظام الثقافة الآلي من 0 إلى 65 يوما. لم تتسبب التغييرات التلقائية في الوسائط في انفصال الخلايا أو أي تغييرات أخرى يمكن اكتشافها بصريًا في التمايز. في نهاية التمايز، في اليوم 65، تظهر الخلايا العصبية mDA التنظيم الخلوي والمورفولوجيا (سوما كروية، التشعبات الطويلة والزهمية) مماثلة للتمايز اليدوي(الشكل 7A، B). على مستوى مرنا، تظهر الخلايا العصبية mDA متباينة في نظام الثقافة الآلي التعبير عن علامات الخلايا العصبية و mDA، MAP2 و TH (التيروزين هيدروكسيلاس)، على التوالي(الشكل 7C). كل من التمايزات ولدت كميات كبيرة من الخلايا العصبية TH و MAP2 إيجابية(الشكل 7D).

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لثقافة الخلية الآلية ومنصة التصوير.
وقد تم تصميم النظام مع السكن البولي واثنين من غطاء HEPA (A و B) مجهزة بأربعة مصابيح الأشعة فوق البنفسجية ضمان بيئة معقمة لتطبيقات ثقافة الخلية. يتم تحميل لوحات الخلية ثقافة على الرفوف أمام الذراع الروبوتية التي يمكن الوصول إليها عن طريق الباب الأمامي (C). يتم تحميل اللوحات في حاضنة CO₂ (D) بسعة 456 لوحة. يستخدم مقياس الخلايا المضيء (E) للتدقيق في الالتقاء وعد الخلايا أثناء إجراءات الالتقاء الفرعي. محطة معالجة السائل هو أقل من واحدة من أغطية HEPA (B). ويرد وصف تخطيط سطح السفينة من معالج السائل في الشكل 2. ذراع الأنابيب من محطة المناولة السائلة يحمل 96 قناة أنبوب الرأس، ثمانية قنوات الأنابيب 1 مل وأربع قنوات الأنابيب 5 مل. في حالة قنوات الأنابيب 1 مل، يمكن استخدام نصائح أو الإبر لنقل السائل. لأغراض الفحص، يمكن معالجة الخلايا المصنفة في ألواح الفحص بالعينات المخزنة عند -20 درجة مئوية في نظام التخزين الآلي -20 درجة مئوية (F) بعد ذوبان هذه العينات في حاضنة ثانية (G). يتم تنفيذ التصوير عالي الإنتاجية في المجهر الثقوفي الآلي (H) الذي يعرض الحصول على الصور في وضع الالتقاء باستخدام قرصين غزليين أو في وضع epifluorescence. غرفة الخلايا الحية المدمجة في المجهر تسمح بإجراء تصوير طويل الأجل للخلايا المستزرعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تخطيط سطح السفينة لمحطة المناولة السائلة.
يشار إلى مواقف التلميح من قبل "50 ميكرولتر" لنصائح 50 ميكرولتر، من خلال "المعيار" لنصائح 300 ميكرولتر، عن طريق "عالية" لنصائح 1 مل و "5 مل" لنصائح 5 مل. مكونات سطح السفينة: (A) أربعة مواقف شاكر ساخنة (السرعة القصوى: 2500 دورة في الدقيقة) والتي يمكن استخدامها لأي لوحة الثقافة أو شكل لوحة المقايسة. وقد تم تجهيز مواقف شاكر مع القابضين clampable التي تستخدم أيضا لمحاذاة لوحة بعد وسائل النقل إلى سطح السفينة. وعلاوة على ذلك، فإن وظائف شاكر وظيفة موقف غطاء وقوف السيارات لوحات خلال خطوات نقل السائل. لأغراض تمثيلية، تشغل جميع مواقع شاكر من قبل 96 لوحات فحص جيدا. (B) أربعة وحدات الميل لمعالجة أربع لوحات من أي شكل في وقت واحد يتم وضعها على القمة. أدنى موقف علامات غرفة جمع النفايات لثقافة ولوحات الفحص ورأس أنبوب القناة 96. لأغراض تمثيلية، يتم احتلال جميع وحدات الميل من قبل لوحات 96-جيدا. (C)على أعلى الموقف، ويقع لوحة 384-جيدا لفرز الخلايا. وفيما يلي وضعين للألواح التي تشغلها لوحات 96-جيدا لأغراض تمثيلية ورف لأربعة 50 مل وأربعة 15 مل أنابيب. يشغل أدنى موقف من قبل نصائح 5 مل. (د)ثلاثة خطوط إعلامية ذات مواقف للخزانات الإعلامية. تمتلك خطوط الوسائط أجهزة استشعار مستوى السائل التي تسمح بملء خزان الوسائط تلقائيًا بما يصل إلى 250 مل من الوسائط. (E) تستند وحدتان من وحدات النفايات السائلة مع استنزاف نشط على الجزء العلوي، تحت وحدة التحكم في درجة الحرارة مع وضع لحاوية واحدة (أبيض) ورف تلميح 5 مل تقع. (F) خمسة مواقف ل 1 نصائح مل. (G) يتم وضع وحدتين للتحكم في درجة الحرارة في الأسفل ووضعية لوقوف أحد أغطيةها على القمة. (H) مواقف لرفين تلميح 50 ميكرولتر متداخلة (NTR) في الأعلى متبوعاً بمواضعين لقناة واحدة و96-قناة التقاط من 300 μL نصائح ورف تلميح 5 مل في الجزء السفلي. (I) مكدس للوحات العد 384-جيدا في الجزء العلوي تليها ثلاثة 300 μL NTR ورف تلميح 5 مل في الجزء السفلي. (J) محطة تخزين وغسل لمدة ثلاث مجموعات من ثماني المعادن القابلة لإعادة الاستخدام 1 مل الإبر. (K) موقف النفايات ل1 مل و 5 قنوات الأنابيب مل وNTR فارغة (رمادي) وكذلك كتلة القابض للقنوات 1 و 5 مل (أبيض) تستخدم لخطوات النقل على سطح السفينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحقق الآلي من الالتقاء من hiPSC.
(أ)ممثل برايتفيلد (BF) صور hiPSC التي اتخذتها الخلية الخلوية (يسار) وبعد تحليل الالتقاء الآلي (يمين) تشير إلى المنطقة النسبية التي تشغلها الخلايا باللون الأخضر؛ (ب)نسب التقاء المسجلة من خطين hiPSC (iPS #1 #2) من اليوم 1 إلى 6 من الثقافة، ن = 4 1-1-1 لوحات جيدا لكل خط الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تمرير من hiPSC.
(A) BF صورة لخط hiPSC واحد نمت يدويا (يسار) واستخدام نظام الثقافة الآلي (يمين). تم التقاط الصور بعد 6 أيام من تمرير الثاني؛ (B) صور تمثيلية من hiPSC ملطخة لعلامات متعددة الأطراف OCT4 و SSEA4 ، ومواصفة مع Hoechst 33342 (نوكلي) ؛ (C)نتائج qRT-PCR لعلامات متعددة الأطراف OCT4، NANOG و REX1 في خط واحد hiPSC المزروعة في التكرارات (1 و 2) يدويا (م) وفي نظام الثقافة الآلي (أ) ، والخلايا العصبية القشرية ذات الصلة hiPSC المستمدة (Diff) في اليوم 8 (D8) من التمايز. يتم تمثيل البيانات ككمية نسبية (RQ) باستخدام iPS_a_1 كعيّنة مرجعية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD) من 3 نسخ متماثلة تقنية من تفاعل qRT-PCR. واستخدمت جابد، RPL13A1 وRPLPO كما الجينات التدبير المنزلي. شريط مقياس: 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: الخلايا العصبية القشرية المشتقة من iPSC البشرية.
(أ)صور برايتفيلد لليوم 6، يدويا (م) والآلية (أ) الخلايا العصبية القشرية المتباينة التي تظهر شبكات الخلايا العصبية مماثلة؛ (ب) صور تمثيلية للخلايا الملطخة لـ TUBB3 (العصبون العصبوني) و BRN2 (الخلايا العصبية القشرية) و هويشست 33342 (نوات) في اليوم 8 من التمايز؛ (C) نتائج qRT-PCR لمورثات علامة الخلايا العصبية القشرية(MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 و SYN1) المخصب في اليوم 8 (D8) من التمايز. يتم تمثيل البيانات ككمية نسبية (RQ) باستخدام iPS_a_1 كعيّنة مرجعية. تمثل أشرطة الخطأ SD من 3 نسخ متماثلة تقنية من تفاعل qRT-PCR. واستخدمت جابد، RPL13A1 وRPLPO كما الجينات التدبير المنزلي. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مقايسة عالية الإنتاجية لـ نوريتج النمو.
(أ)صور تمثيلية لـ GFP تعبر عن خلايا في الأيام 1 و 3 و 11 من التمايز؛ (B) تمثيل الصور الثنائية من نيوريت في أيام 1 و 3 و 11 من التمايز. تم قياس نمو النورية باستخدام برنامج تحليل الصور عالي المحتوى 1 ويتم تمثيله كطول neurite ؛ (ب) يعرض الرسم البياني الزيادة في طول نيوريت في الخلايا العصبية NGN2 المشتقة من المجلس الوطني للصحافة وتشكيل شبكة كثيفة. يتم تصوير ثلاث لوحات 96-well مع الخلايا في الآبار الداخلية 60. وللبساطة، لا تظهر سوى ثلاثة أعمدة من الآبار لكل لوحة 96 بئراً كمثال على ذلك مع n = 6 آبار لكل عمود. تم تحليل متوسط 1308 خلية في البئر. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للـ (S.E.M.). شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: الخلايا العصبية mDA المشتقة من iPSC البشرية.
الخلايا العصبية DA Midbrain متباينة يدويا (م) وفي الآلي (أ) نظام الثقافة. (أ، ب) صور الفلورسنت التمثيلية للخلايا العصبية mDA الملطخة للهيدروكسيلات التيروزين (TH، علامة الخلايا العصبية mDA؛ الأخضر)، MAP2 (علامة الخلايا العصبية؛ الأحمر) وHoechst 33342 (نوات؛ أزرق)؛ (C) ممثل نتائج qRT-PCR لجينات علامة من الخلايا العصبية mDA متباينة يدويا وفي نظام الثقافة الآلي. يتم تمثيل مستويات التعبير TH و MAP2 كمية نسبية (RQ) تطبيعها إلى جينات التدبير المنزلي (OAZ1 و GAPDH); (D) النسب المئوية للخلايا العصبية الإيجابية TH و MAP2 التي تم إنشاؤها بواسطة التمايز اليدوي والآلي. تمثل أشرطة الخطأ SD من اثنين من التمايزات مستقلة تنفيذها مع اثنين من خطوط iPSC متميزة (#1 #2). شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نوع الخلية	الغرض	خطوة البروتوكول	كثافة الخلية	شكل لوحة	رقم الخلية/جيد
تمايز NGN2
iPSC	الجيل خط NGN2 مستقرة	س-2-3	30,000 خلية/سم²	12-جيدا	1,17,000
iPSC	تمايز الخلايا العصبية NGN2	3.1.3.	30,000 خلية/سم²	1-جيدا	25,20,000
iPSC	تمايز الخلايا العصبية NGN2	3.1.3.	30,000 خلية/سم²	96-جيدا	9,600
smNPC جيل
smNPC	إعادة طلاء اليوم 12 و 16	S5.9. و S5.11.	70,000 خلية/سم²	6-جيدا	6,72,000
smNPC	إعادة الطلاء من المقطع 5	5.11.	50,000 خلية/سم²	6-جيدا	4,80,000
smNPC	smNPC إلى الخلايا العصبية NGN2	3.2.2	50,000 خلية/سم²	96-جيدا	16,000
mDA التمايز
iPSC	mDA تمايز الخلايا العصبية	4.1.2.	200,000 خلية/سم²	1-جيدا	1,68,00,000
الخلايا العصبية DA	اليوم 25 إعادة الطلاء	4.3.2.	400,000 خلية/سم²	1-جيدا	3,36,00,000
الخلايا العصبية DA	اليوم 25 إعادة الطلاء	4.5.2.	100,000 خلية/سم²	96-جيدا	32,000

طلاء	الغرض	خطوة البروتوكول	التركيز/ التخفيف	شكل لوحة	تفاصيل الطلاء
ثقافة iPS
مصفوفة خارج الخلية	iPSC، خط NGN2، الخلايا العصبية mDA	1.5.7. و S2.3.	1 aliquot*؛ 1 25 مل DMEM/F-12	1-/12-جيدا	8/0.5 مل/ جيد; 1 ساعة في RT
تمايز NGN2
بولي-ل-أورنيثين	تمايز الخلايا العصبية NGN2	3-1-3 و3-2-2- 3-1-3	0.1 ملغم / مل; برنامج تلفزيوني	1-/96-جيدا	8/0.1 مل/ جيد؛ 12 ساعة عند 37 درجة مئوية؛ 3x PBS غسل
لامينين	تمايز الخلايا العصبية NGN2	3-1-3 و3-2-2- 3-1-3	5 ميكروغرام/مل؛ برنامج تلفزيوني	1-/96-جيدا	8/0.1 مل/ جيد؛ 4 ساعات عند 37 درجة مئوية
smNPC جيل
مصفوفة خارج الخلية	smNPC جيل والثقافة	S5.6., S5.9., S5.11.	1 aliquot*؛ 1 25 مل DMEM/F-12	6-جيدا	1 مل؛ 2 ساعة في RT
mDA التمايز
مصفوفة خارج الخلية	mDA التمايز	4.1.2.	1 aliquot*؛ 1 25 مل DMEM/F-12	1-جيدا	12 مل؛ 12 مل. 12 ساعة عند 37 درجة مئوية
بولي-ل-أورنيثين	mDA التمايز	4-3-2 و4-5-2- 4-3-2	0.1 ملغم / مل; برنامج تلفزيوني	1-/96-جيدا	12/0.1 مل / جيدا؛ 12 ساعة عند 37 درجة مئوية؛ 3x PBS غسل
لامينين	mDA التمايز	4-3-2 و4-5-2- 4-3-2	10 ميكروغرام/مل؛ برنامج تلفزيوني	1-/96-جيدا	12/0.1 مل / جيدا؛ 12 ساعة عند 37 درجة مئوية
فيبينينكتين	mDA التمايز	4-3-2 و4-5-2- 4-3-2	2 ميكروغرام/مل؛ برنامج تلفزيوني	1-/96-جيدا	12/0.1 مل / جيدا؛ 12 ساعة عند 37 درجة مئوية
*يتم تعريف aliquot مصفوفة خارج الخلية على أنه عامل التخفيف (في μL) الموجود في شهادة تحليل هذا المنتج.

الجدول 1: كثافة خلايا البذر والطلاء على شكل اللوحة.

اليوم	الكاشف
اليوم 0 - 1	100 NM LDN193189، 10 μM SB431542
اليوم 1 - 3	100 nM LDN193189، 10 μM SB431542، 1 mM SHH، 2 mM Purmorphamine، 100ng/mL FGF-8b
اليوم الثالث - الخامس	100 nM LDN193189، 10 μM SB431542، 1 mM SHH، 2 mM Purmorphamine، 100ng/mL FGF-8b، 3 μM CHIR99021
اليوم الخامس - السابع	100 nM LDN193189، 1 MM SHH، 2 MM Purmorphamine، 100ng/mLFGF-8b، 3 ميكرومتر CHIR99021
اليوم السابع - التاسع	100 nM LDN193189، 1 mM SHH، 3 μM CHIR99021
اليوم التاسع - 11	100 nM LDN193189، 1 mM SHH، 3 μM CHIR99021
اليوم 11 - 13	3 ميكرومتر CHIR99021، 20 نانوغرام/مل BDNF، 0.2 mM L-حمض الأسكوربيك (AA1)، 20 نانوغرام/مل GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT
اليوم 13 - 65	20 نانوغرام/مل BDNF، 0.2 mM L-حمض الاسكوربيك (AA1)، 20 نانوغرام/مل GDNF، 1 mM db-cAMP، 1 نانوغرام/مل TGFß3, 10 ميكرومتر DAPT

الجدول 2: إضافة جزيء صغير لتمايز الخلايا العصبية الدوبامين.

اليوم	متوسط KSR	N2 متوسطة	تمايز وسط
اليوم 0 - 1	100%	0	0
اليوم 1 - 3	100%	0	0
اليوم الثالث - الخامس	100%	0	0
اليوم الخامس - السابع	75%	25%	0
اليوم السابع - التاسع	50%	50%	0
اليوم التاسع - 11	25%	75%	0
اليوم 11 - 13	0	0	100%
اليوم 13 - 65	0	0	100%

الجدول 3: تدرج الوسائط للتمايز الخلايا العصبية الدوبامينية.

الملف التكميلي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

نحن نقدم نظام ثقافة الخلايا الآلي مع قدرات التصوير المتكاملة لتوحيد ثقافة hiPSC والتمايز العصبي. بسبب الحد الأدنى من تدخل المستخدم، التباين التجريبي هو انخفاض ضمان إعادة إنتاج الأنماط الظاهرية الخلوية أثناء التمايز. ويدعم جدولة التقويم تنظيم وتوازي التجارب ويسمح بدرجة عالية من المرونة في الوقت الذي يتم فيه تنفيذ التجارب. ويمكن تكييف الأساليب القائمة بسهولة وزيادة طيف الأساليب المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام عدد كبير من تنسيقات لوحة المقايسة إضافة إلى مرونة هذا النظام. يشكل النظام الأدنى المكون من حاضنة CO_2، وذراع روبوتية، ومقياس الخلايا الساطعة، ومحطة المناولة السائلة الوحدة الأساسية اللازمة لثقافة HIPSC والتمايز، مع تكاليف معقولة لمختبرات البحوث الأكاديمية. الجمع بين نظام ثقافة الخلايا الآلي مع نظام تخزين آلي -20 درجة مئوية لتخزين المركبات ، ومكتبات RNAi أو مكتبات CRISPR / Cas9 ، وتكامل مجهر عالي المحتوى / عالي الإنتاجية يمكّن من تنفيذ عمليات فحص الظواهر الظاهرية.

في الدراسة الحالية، استخدم نظام زراعة الخلايا الآلي نصائح يمكن التخلص منها وتم إعادة ملء وسائل الإعلام الثقافية يدويًا في الخزان، مما يحد من استخدام محطة المناولة السائلة في تغييرات وسائل الإعلام والعمليات الثقافية الأخرى خاصة بين عشية وضحاها. للتحايل على هذا القيد، يمكن تعديل الأساليب لاستخدام إبرة بدلا من نصائح المتاح، وبعد تركيب وصلات أنبوب بين خطوط وسائل الإعلام وأكياس وسائل الإعلام المخزنة في الثلاجة، يمكن إعادة ملء خزانات وسائل الإعلام تلقائيا مع وسائل الإعلام الطازجة قبل تدفئة عناصر سخان. ومن شأن ذلك أن يحد من تداخلات المستخدمين الناجمة عن إعادة التعبئة اليدوية للنصائح ووسائط الإعلام الثقافية وتبادل الخزانات.

لدينا نظام ثقافة الخلية الآلي يقدم العديد من المزايا. واحد هو نظام تتبع الباركود. يتم تحديد لوحات محملة في النظام من خلال الباركود الفريد الذي يقرأ وحفظها من قبل النظام مما يسمح تتبع العينات أثناء وبعد تنفيذ الأسلوب. ميزة أخرى هي إمكانية إنشاء مشاريع خاصة بالمستخدم. هنا، يمكن تعيين لوحات الثقافة المحملة في النظام إلى مشروع محدد وتجميعها على دفعات. الهيكلة على دفعات يبسط تنفيذ نفس الإجراء إلى جميع لوحات دفعة معينة حيث لا تحتاج لوحات الفردية التي تحتاج إلى اختيار. بالإضافة إلى ذلك، يسمح محرر فئة السائل لضبط سرعة الأنابيب والارتفاع وكذلك المعلمات الطموح والاستغناء عن كل خطوة نقل السائل. يتم توثيق كل عملية في ملفات السجل مما يسمح لتتبع المهام التي تم تنفيذها لثقافة معينة أو لوحة فحص.

الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) مفيدة في الأدوات المختبرية لدراسة آليات الأمراض العصبية في مجموعات محددة من المرضى (على سبيل المثال الخلايا العصبية الدوبامينية لمرض باركنسون) تقدم إمكانية لفحوصات الأدوية الشخصية. الاستزراع hiPSC هو مكثفة جدا من الوقت وتتطلب الناس المدربين لتنفيذ بروتوكولات التمايز المعقدة، وعادة ما تقتصر على الإنتاج على نطاق منخفض. نحن تكييفها ثقافة التغذية خالية من hiPSC لثقافة مؤتمتة ونفذت بروتوكولين التمايز العصبية, بروتوكول تمايز الخلايا العصبية القشرية السريعة على أساس NGN2 الإفراط في التعبير تحت المروج tet-on¹⁰^,¹¹, وبروتوكول على المدى الطويل الصغيرة القائمة على جزيء لتوليد من الخلايا العصبية في منتصف الكبرين الدوبامين (mDA)¹³. إن النقل المباشر لاتفاقية الثقافة اليدوية وبروتوكولات التمايز و قابليتها للتكرار يجعلان نظام الثقافة الآلي مفيداً جداً. أظهر iPSC البشري المستزرع في نظام زراعة الخلايا الآلي مورفولوجيا الخلايا الجذعية المتسقة وعبّر عن علامات متعددة القدرات الهامة ، قابلة للتكرار بين التجارب المستقلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أتمتة بروتوكول ثقافة hiPSC لصالح ثقافة وتوسيع عدد أكبر من خطوط الخلايا في موازاة. وفّرت عمليات فحص الالتقاء الآلي المقرر إجراؤها بين عشية وضحاها الوقت الذي يترك النظام حراً خلال النهار لخطوات عملية المصب التي تتم عندما يكون المستخدم في المختبر (مثل حصاد الخلايا أو إعادة الطلاء اليدوي للتمايزات). عند الوصول إلى عتبة التقاء المعرفة من قبل المستخدم، يتم تمرير الخلايا وإعادة طلاءها في لوحات مكسوة بمصفوفة خارج الخلية متوفرة على مكدس نظام ثقافة الخلية التلقائي. كل جولة مرور يأخذ حوالي 70 دقيقة ويولد أربعة لوحات 1-بئر من لوحة أحد الوالدين، والذي يترجم إلى قدرة 20 الممرات في يوم واحد.

تم تنفيذ أتمتة بروتوكول التمايز NGN2 بنجاح وسمح لتوليد مجموعة متجانسة من الخلايا العصبية عبر مقاطع مختلفة وقابلة للمقارنة مع التمايزات اليدوية. وعلاوة على ذلك، فإن التكاليف التجريبية لدراسات الفرز الواسعة النطاق التي تشمل خطوطاً متعددة من الخلايا أو تجارب فحص مع آلاف من ظروف/مركبات الاختبار ستنخفض بسبب التمايزات السريعة. يمكن بسهولة تطوير القياسات الفعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية بما في ذلك القياسات التي تُحدث في الخلايا الحية ، و¹⁵^،¹⁶. وهكذا، قمنا أيضًا بتكييف بروتوكول NGN2 باستخدام خلايا السلائف العصبية المشتقة من الجزيئات الصغيرة (smNPC) التي تُبرِر بشكل مفرط GFP. وتوفر خلايا الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم مزايا إضافية بما في ذلك انخفاض التكاليف مع وسائط الإعلام الثقافية (ثلث التكلفة مع ثقافة iPSC) والوقت اللازم لتوسيع نطاق التجارب. الغلة الخلية من smNPC هي 7 إلى 10 مرات أعلى من تلك التي تم الحصول عليها مع iPSC. تم رصد الخلايا العصبية المتمايزة وصورها بنجاح لعدة أيام باستخدام عملية تصوير مؤتمتة بالكامل دون الحاجة إلى تلطيخات الأجسام المضادة اليدوية أو وضع العلامات الكيميائية ، مما يوفر التكاليف والوقت اللازم للإجراءات اليدوية بما في ذلك التصوير في حد ذاته. التصوير الحالي لـ 60 بئرًا داخليًا من لوحة 96 بئرًا يستغرق حوالي 16 دقيقة لكل لوحة عندما يتم تصوير 25 حقلًا في البئر ، مما يعني أنه يمكن الحصول على بيانات الفحص المستند إلى التصوير لـ 1000 مركب وتحليلها في يوم واحد. في المستقبل، يمكن استخدام هذه القراءة في دراسات الفحص المركب لإنقاذ عيوب النمو النوري.

وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا إثبات نقل بروتوكول التمايز اليدوي لتوليد الخلايا العصبية في منتصف الفقرات الدوبامين (mDA) من iPSC. هذا بروتوكول التمايز الصغيرة القائمة على جزيء يأخذ 65 يوما، والعمل المكثف بسبب خطوات إعادة الطلاء متعددة والتغيرات وسائل الإعلام المتكررة، ومعظمها كل 2 أيام، مما يحد من إنتاج الخلايا العصبية mDA إلى خطوط iPSC قليلة في نفس الوقت. بروتوكول التمايز mDA الآلي لديه ميزة كبيرة من رفع مستوى التمايز إلى العشرات من خطوط iPSC. ويمكن تمييز ما يصل إلى 30 خط خلية في نفس الوقت. وبما أن التمايز يستند في معظمه إلى التغيرات التي تطرأ على وسائط الإعلام، فإن عملية التمايز كلها تقريباً يمكن أن تتم دون تدخل بشري. باستخدام جدولة المستندة إلى التقويم للنظام الآلي، يمكننا التخطيط للتغييرات وسائل الإعلام وفقا لخطوات التمايز. كان أحد القيود على العمل مع هذا العدد الكبير من خطوط الخلايا ولوحات الثقافة استحالة إجراء تغييرات الوسائط بين عشية وضحاها. والسبب الرئيسي هو أن نظامنا تم إعداده لاستخدام النصائح التي يمكن التخلص منها وإعادة الملء اليدوي لوسائل الإعلام الثقافية التي تتطلب من المستخدم في المختبر تنفيذ هذه الخطوة اليدوية. ولتيسير عملية تغيير الوسائط، تم تخصيص اللوحات المحملة في النظام لمشروع وتجميعها على دفعات. ثم تم تكييف حجم الدفعة مع عدد النصائح المتاح وحجم وسائل الإعلام الثقافة المتاحة. وكما نوقش أعلاه، يمكن التغلب على هذا القيد بسهولة عن طريق تنفيذ الإبر القابلة لإعادة الاستخدام/القابلة للغسل وإعادة الملء الآلي لوسائل الإعلام. التلقائي passaging / إعادة طلاء الخلايا ، كما هو مبين لـ iPSC ، هي واحدة من وسائل الراحة التي تقدمها لدينا نظام ثقافة الخلايا الآلي. لقد اختبرنا إعادة طلاء الآلي من الخلايا العصبية mDA في اليوم 25 من التمايز. ومع ذلك، فإن تفكك الخلايا العصبية mDA يتطلب فترة أطول (40 دقيقة) الحضانة مع إنزيم تفكك من iPSC (8 دقيقة) توسيع عملية إعادة الطلاء الآلي لأكثر من 1 ساعة في خطوط الخلية. ونتيجة لذلك، أصبح من المستحيل إعادة طلاء 30 خطاً خلوية آلياً في اليوم نفسه. ومن شأن تسريع الخطوات الأخرى أثناء إعادة الطلاء الآلي (نقل اللوحات، وتكييف الأنابيب) وتكييف النظام مع استخدام الإبر وخط الوسائط الذي يجعل العمل بين عشية وضحاها ممكنًا، أن يحل هذا القيد. على الرغم من العيوب، يمكننا نقل بنجاح البروتوكول اليدوي إلى تمايز الآلي من الخلايا العصبية mDA إنتاج الثقافات مع كميات كبيرة من MAP2 (الخلايا العصبية) وTH (الخلايا العصبية mDA) الخلايا الإيجابية.

إن التمييز بين العشرات من خطوط الخلايا iPSC بالتوازي أمر مهم جدًا في المشاريع التي تحقق في الآليات الجزيئية للأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون. ومع ذلك ، لإكمال المهام بشكل أسرع مع أخطاء أقل والتكاليف المخفضة هو تحد كبير. نظرا لأتمتة البروتوكولات المعروضة هنا (iPSC، smNPC والخلايا العصبية MDA)، ونحن يمكن أن تسريع، والحد من التكاليف وزيادة استنساخ في مشاريعنا. إن تطوير مشاريع مثل FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) التي تشمل مئات خطوط الخلايا المريضة يظهر الحاجة إلى ثقافة آلية وبروتوكولات التمايز. وتشمل وجهات نظرنا المستقبلية نقل دليل 3 الأبعاد (3D) نماذج ثقافة الخلية إلى النظام الآلي. وسوف تسمح التعديلات الطفيفة في إعدادات تعريف لوحة واستخدام محولات استخدام لوحات التجارية أو حسب الطلب والغرف microfluidic اللازمة للثقافات 3D. وعلاوة على ذلك، فإن تنفيذ نموذج التصوير الآلي خالية من التسمية تسمح لنا لتتبع نمو الخلايا العصبية في الوقت الحقيقي وترجمة التغييرات في نمو نيوريت، وتنظيم الخلايا العصبية والموت الخلية في فهم أفضل لآليات المرض.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشف عنه

شكر وتقدير

يعترف المؤلفون بامتنان بالمرضى وأسرهم الذين ساهموا في المواد الحيوية لهذه الدراسة. كانت خطوط الخلايا المستخدمة في الدراسة من مجموعة NINDS مع Rutgers (ND41865 كما iPS #1) ومختبر الدكتور تيلو كوناث (iPS #2). ويدعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة NOMIS (PH)، RiMod-FTD، وهو برنامج مشترك للاتحاد الأوروبي - أبحاث الأمراض العصبية (JPND) (PH)؛ مبادرة I2A الخاصة بـ DZNE (AD)؛ PD-Strat، وهو مشروع ممول من ERA-NET ERA ERASysMed (PH) ومبادرة البيانات التأسيسية لمرض باركنسون (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN - PD هو جزء من برنامج PATH TO PD لمؤسسة مايكل ج. فوكس. الكتاب الشكر ستيفن فينكبينر وميلاني كوب (معاهد غلادستون) للمساهمة في إنشاء دليل بروتوكول تمايز الخلايا العصبية mDA وماهومي سوزوكي (يوكوغاوا شركة كهربائية) للمساعدة في إعداد تحليل الخروج من نيوريت.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>الأجسام المضادة< قوية>	<قوية>الموزع	<قوي>رقم الكتالوج	<قوي>تخفيف
<قوي>iPSC علامة تعدد القدرات
فأر مضاد ل SSEA4	Abcam	ab16287	1 إلى 33
أرنب مضاد لأكتوبر3/4	Abcam	ab19857	1 إلى 200
علامات الخلايا العصبية < قوية > NGN2 < / قوية >
ماوس مضاد ل TUBB3	R & D	MAB1195	1 إلى 500
أرنب مضاد ل BRN2	NEB	12137	1 إلى 1,000
<قوي >mDA علامات الخلايا العصبية < / قوي >
دجاج مضاد ل TH	Pel-Freez Biologicals	12137	1 إلى 750
ماوس مضاد ل MAP2	سانتا كروز	sc-74421	1 إلى 750
<قوي > أجسام مضادة ثانوية < / قوية>
الماعز المضاد للدجاج IgY ، Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11039	1 إلى 2,000
الماعز المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029	1 إلى 2,000
الماعز المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	1 إلى 2,000
الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 إلى 2,000
الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 إلى 2,000
IgG مضاد للأرانب ، Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	1 إلى 2,000
Nuclei counterstaining< / strong>
Hoechest 33342	Invitrogen	H3570	1 إلى 8,000

Instruments< / قوي>	<قوي>موزع	قوي<قوي> رقم الكتالوج	<قوي>الوصف / التطبيق
Agilent TapeStation	تقنيات Agilent	4200	الرحلان الكهربائي الآلي لعينات الحمض النووي والحمض
النووي الريبي الآلي -20 درجة ؛ نظام تخزين C	Hamilton Storage Technologies	Sample Access Manager (SAM -20C ، سلسلة 3200)	تخزين الكواشف
قارئ الباركود	هانيويل	قارئ الباركود المدار	ماسح الباركود
Brightfield cell cytomat	Nexcelom	Celigo	فحص التقاء و عد الخلايا
CellVoyager 7000	Yokogawa	CellVoyager 7000	مجهر كونفوكال آلي
Cytomat لمزارع الخلايا	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 24 C ، CU	12 مكدس 28 مم ، 12 مكدس 23 مم (إجمالي 456 لوحة)
Cytomat لعينات الذوبان	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 2-LIN ، 60 DU (وحدة التجفيف)	2 مكدسات 28 مم (إجمالي 42 لوحا)
مرشحات HEPA	هاميلتون روبوتيكس	غطاء محرك السيارة تدفق ستار الأشعة فوق البنفسجية	تم تعديله بواسطة Hamilton Robotics
محطة مناولة السوائل	Hamilton Robotics	Microlab Star	القنوات: 8x 1 مل ، 4 × 5 مل و 96 قناة ميلا في الساعة
خزان الوسائط	هاميلتون روبوتكس	188211APE	الوسائط / الكواشف الخزان
نظام المياه النقية	Veolia Water	ELGA PURELAB Classic	يوفر الماء النقي لمحطة غسيل الإبرة
QuantStudio 12K Flex في الوقت الحقيقي نظام PCR	الحرارية فيشر العلمي	QSTUDIO12KOA	آلة PCR في الوقت الحقيقي
ذراع آلي	هاميلتون الروبوتات	Rackrunner	نقل اللوحات
بدوره الجدول	هاميلتون الروبوتات	بدوره الجدول	ضبط اتجاه اللوحة
امدادات الطاقة غير المنقطعة	APC	وحدة UPS RT الذكية ، 10000 VA Power توريد	مصدر الطاقة الاحتياطية
VIAFLO-ماصات	Integra	4500	ماصة إلكترونية
ViiA 7 نظام PCR في الوقت الحقيقي	الأنظمة الحيوية التطبيقية	4453545	آلة

<قوية>المواد< قوي>	قوي<قوي>الموزع< قوي><قوي>	الكتالوج	< قوية > ملاحظات < / قوية >
1 بئر (84 سم < سوب > 2 < / سوب>) Thermo	Fischer Scientific	165218	Nunc OmniTray
6 ألواح ثقافة بئر (9.6 سم < سوب > 2 < / سوب>)	Greiner Bio-One	657160	TC معالجة بغطاء
لوح ثقافة 12 بئر (3.9 سم ^{2< / sup>)}	Greiner Bio-One	665180	TC معالج بغطاء
لوحة ثقافة 96 بئر (0.32 سم ^{2< / sup>) Perkin}	Elmer	6005558	CellCarrier-96 نصائح لوحة سوداء
، 50 - & ميكرو ؛ L	هاميلتون روبوتكس	235987	نصائح 50-uL
نصائح ، 300-µ L	هاميلتون روبوتكس	235985	300-µ نصائح L
، 1000 - & L	هاميلتون الروبوتات	235939	1000-µ نصائح L
، 5 مل	هاميلتون روبوتكس	184022	5 مل
، أنابيب 15 مل	Greiner Bio-One	188271	15 مل
، 50 مل	Greiner Bio-One	227261	50 مل
قوارير Nalgene المبردة 2.0 مل	Sigma Aldrich	V5007	Cryovials

< strong> Plasmids< / قوي>	<قوي>موزع	<قوي>رقم الكتالوج	<قوي>ملاحظات
pLV_hEF1a_rtTA3	هدية لطيفة من		رون فايس
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro	Addgene	61474	هدية لطيفة من رون فايس
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 فيروس العدسات	تاكارا	بيو 631983

<قوي>بادئات	<قوي>تسلسل (إلى الأمام)	><قوي>تسلسل (عكس)	<قوي>المصدر
<قوي>iPSC تعدد القدرات
أكتوبر 4 (معرف 4505967a1)	CTTGAATCCGAATGGAAAGGG	GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC	PrimerBank
NANOG (المعرف 153945815c3)	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC	PrimerBank
REX1 (معرف 89179322c1)	AGAAACGGGCACACACACACACACAC	GCTGACAGGTTCTATTTCCGC	PrimerBank
NGN2 الخلايا العصبية
MAP2 (المعرف 87578393c1)	CTCAGCACCGCTAACAGAGG	CATTGGCGCTTCGGACAAG	PrimerBank
BRN2 (المعرف 380254475c1)	CGGCGGATCAAACTGGGATTT	TTGCCTGCGATCTTGTCTAT	PrimerBank
CUX2 (معرف 291045458c2)	CGAGACCTCCACACTTCGTG	TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG	PrimerBank
NCAM1 (المعرف 336285437c3)	TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC	CTCACAGCGATAAGTGCCCTC	PrimerBank
SYNAPSIN1 (المعرف 91984783c3)	TGCTCAGCAGTACAACGTACC	GACACTTGCGATGTCCTGGAA	PrimerBank
< قوية > الخلايا العصبية < / قوي>
TH	CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA	CTCCTCGGCGGTACTCCACA	NCBI التمهيدي انفجار
MAP2	GGATCAACGGAGAGCTGACC	TCAGGACTGCTACCCTCA	NCBI التمهيدي انفجار
قوي > جينات التدبير المنزلي < / قوي >
GAPDH	GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG	GAGCCAGCCTTCTCCATG	NCBI التمهيدي انفجار
OAZ1	AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT	ATGAAGACATGGGGCTCG	NCBI التمهيدي انفجار
RPLPO	cctcatatccgggggaatgtg	gcagcagctggaccttattg	NCBI التمهيدي انفجار
RPL13A	GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC	TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC	NCBI التمهيدي انفجار

<قوي > الوسائط والكواشف < قوي >	<قوي > الموزع < / قوي >	<قوي > رقم الكتالوج < / قوي >	<قوي > استخدم التركيز < / قوي >
< قوي > مصفوفة طلاء < / قوي >
مصفوفة خارج الخلية (Matrigel)	كورنينج	354277	10 مو ؛ جم / مل
فيبرونيكتين	كورنينج	356008	2 مو ؛ جم / مل
Laminin	Sigma	L2020	5 - 10 & mu ؛ جم / مل
بولي إل أورنيثين (PLO)	سيجما	P3655	0.1 مجم / مل
< قوي > وسط ثقافة < / قوي >
iPSC وسط ثقافة < br / > (أساسي 8 فليكس متوسط) الخلايا	Gibco	A2858501
< قوية > NGN2 - NGN2 متوسط < / قوي >
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	0.909 مل (50 وميكرو ؛ M)
مكمل B27	Gibco	12587010	10 مل (1٪)
DMEM / F-12 ، GlutaMAX	Gibco	31331093	484.75 مل
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 مل (2 مل)
الأنسولين	Sigma	I9278	0.25 مل (2.5 & micro; جم / مل)
الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM	جيبكو	11140050	5 مل (0.5٪) مكمل
N2	Gibco	17502048	5 مل (0.5٪) متوسط
	عصبي عصبي جيبكو	21103049	485 مل
< قوي > mDA - SRM متوسط < / قوي >
2-mercaptoethanol	جيبكو	21985023	0.5 مل (55 & micro ؛ م)
جلوتاماكس	جيبكو	35050038	5 مل (2 مل)
Knockout DMEM / F-12	Gibco	12660012	409.5 مل
بدائل مصل بالضربة القاضية (بديل المصل)	جيبكو	10828028	75 مل (15٪) MEM
الأحماض الأمينية غير الأساسية	جيبكو	11140050	5 مل (1٪)
بنسلين ستربتومايسين	جيبكو	15140122	5 مل (1٪)
<قوي > mDA الخلايا العصبية - N2 متوسط < / قوي >
B27	مكمل جيبكو	12587010	10 مل (2٪)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 مل (2 مل)
مكمل N2	Gibco	17502048	5 مل (1٪)
عصبي	القاعدي جيبكو	21103049	475 مل
بنسلين ستربتومايسين	جيبكو	15140122	5 مل (1٪)
< قوي > mDA الخلايا العصبية - وسيط التمايز < / قوي >
B27 مكمل	جيبكو	12587010	10 مل (2٪)
عصبي	القاعدي جيبكو	21103049	485 مل
بنسلين ستربتومايسين	جيبكو	15140122	5 مل (1٪)
<قوي > NGN2 الخلايا العصبية - المكملات الغذائية< / قوي >
عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)	Peprotech	450-02	10 نانوغرام / مل
CHIR99021 (CHIR)	R & د	4423/10	2 & م
دوكسيسيلين (دوكس)	سيجما	D9891	2.5 & جم / مل
عامل التغذية العصبية المشتق من الدبقي (GDNF)	Peprotech	450-10	10 نانوغرام / مل
حمض الأسكوربيك L المغنيسيوم (AA2)	Sigma	A8960	64 مجم / لتر
عامل التغذية العصبية -3 (NT-3)	Peprotech	450-10	10 نانوغرام / مل
بورمورفامين (PMA)	كايمان	10009634	0.5 & مو ؛ M
Puromycin	Sigma	P8833-10MG	0.5 & mu ؛ جم / مل
ثيازوفيفين	ميرك ميليبور	420220-10 مجم	2 مو ؛
الخلايا العصبية MmDA - المكملات الغذائية< / عامل
المشتق من الدماغ (BDNF)	Peprotech	450-02	20 نانوغرام / مل
CHIR99021 (CHIR)	R & د	4423/10	3 & M
DAPT	كايمان	13197	10 & مايكرو; M
Dibutyryl-cAMP (ديسيبل-cAMP)	سيجما	D0627	1 ملي مولار
عامل نمو الخلايا الليفية 8B (FGF-8b)	Peprotech	100-25	100 نانوغرام / مل
عامل التغذية العصبية المشتق من الدلام (GDNF)	Peprotech	450-10	20 نانوغرام / مل
حمض الأسكوربيك L(AA1)	Sigma	A4403	0.2 mM
LDN193189 (LDN)	كايمان	11802	100 nM
بورمورفامين (بورم)	كايمان	10009634	2 & مو ؛ M
سونيك القنفذ / Shh (C24II) N-Terminus (SHH)	R & D	1845-SH	100 نانوغرام / مل
SB431542 (SB)	كايمان	13031	10 & مو ؛ م
تحويل نوع عامل النمو ß ؛ 3 (TGF & szlig ؛ 3)	R & D	243-B3	1 نانوغرام / مل
Y-27632	كايمان	10005583	10 ومايكرو ؛ كواشف M
تفكك< / قوي >
كاشف تفكك خلية واحدة (StemPro Accutase)	Gibco	A1110501	1x
UltraPure 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0	Gibco	11575020	0.5 ملي
مولار < قوي > الحمض النووي الريبي وعزل مجموعة cDNA < / strong >
RNA Kit	Qiagen	74106	Rneasy MiniKit
تحلل المخزن	Thermo Fisher Scientific	15596018	Trizol Solution Buffer (RNA Lysis Buffer)
Reverse transcriptase (kit)	Thermo Fisher Scientific	18080-085	SuperScript III Reverse Transcriptase

Software< / strong >	Company < / قوي >	< قوي > رقم الكتالوج < / قوي >	< قوي > الوصف / التطبيق < / قوي >
إطار عمل ثقافة الخلية (CCF) (واجهة مستخدم رسومية ، واجهة المستخدم الرسومية) واجهة	Hamilton Robotics	واجهة مستخدم مخصصة	للنظام الآلي
برنامج CellPathFinder (برنامج تحليل الصور 1) أداة	تحليل الصور	Yokogawa	CellPathfinder HCS
نظام قياس CellVoyager	يوكوجاوا	متضمن مع CellVoyager 7000	التحكم في المجهر
برنامج كولومبوس (برنامج تحليل الصور 2)	Perkin Elmer	Columbus	أداة تحليل الصور
qPCR المستند إلى السحابة	Thermo Fisher Scientific	Themo برنامج تحليل سحابة	ل qRT-PCR البيانات
Venus برنامج	هاميلتون الروبوتات	فينوس اثنين ديناميكية Schedular 5.1	برنامج التحكم في البرمجيات لنظام الآلي

نظام PCR في الوقت الحقيقي رقم أنابيب أنابيب < العصبية متوسط متوسط التغذية العصبية القوي > RNA المؤقت مستخدم Software برنامج تطبيق

المراجع

Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177(2019).
Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647(2015).
Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).
Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760(2014).
Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252(2013).
Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811(2015).
Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134(2012).
Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792(2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

hiPSC Neurogenin 2 neurite

الإنتاج الآلي من الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المشتقة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية القشرية والدوبامين مع المتكاملة مراقبة الخلايا الحية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة