الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير تعليمات حول كيفية قياس قدرة الأجسام المضادة الموجودة في سيرا أو البلازما للأفراد ، المعرضين بشكل طبيعي لعدوى بالسيباروم البلازمودي ، لopsonize والحث على البلعميات الحمراء المصابة بالطفيليات (IEs).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس المكتسبة بشكل طبيعي Phagocytosis-تحريض الأجسام المضادة لبلاموديوم فالسيباروم الطفيليات من قبل تدفق Cytometry القائم على المقايسة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف البروتوكول كيفية إعداد وتشغيل مقايسة البلعة المستندة إلى الخلايا المتدفقة من plasmodium falciparum-eded inedethrotes (IEs) التي تم التقاطها من قبل الأجسام المضادة IgG المكتسبة بشكل طبيعي محددة لـ VAR2CSA. VAR2CSA هو مستضد الطفيليات التي تتوسط في عزل انتقائي لل IEs في المشيمة التي يمكن أن تسبب شكلًا حادًا من الملاريا لدى النساء الحوامل ، وتسمى الملاريا المشيمة (PM). يتم توسط الحماية من PM بواسطة الأجسام المضادة VAR2CSA الخاصة التي يعتقد أنها تعمل عن طريق تثبيط عزل المشيمة و / أو عن طريق opsonizing IEs للبالعميات. يستخدم الفحص IEs في مرحلة متأخرة من متزامنة التي تم اختيارها في المختبر للتعبير عن VAR2CSA ، والهيئات المضادة للبيات البلازما / المصل من النساء ذوات مناعة PM محددة بشكل طبيعي ، وخط الخلايا الفاتجية THP-1. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم. تقدم هذه المقايسة تقييم بسيط وعالي الإنتاجية، مع قابلية جيدة للتكرار، لجانب وظيفي مهم من مناعة الأجسام المضادة بوساطة في الملاريا. ولذلك، فإنه مفيد عند تقييم المناعة السريرية ضد الملاريا P. فالسيباروم، وهي سبب رئيسي للاعتلال والوفيات في المناطق المدارية، وخاصة في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.
المقدمة
الملاريا هي مرض ينتقل بالنواقل يسبب في البشر عند العدوى مع خمسة أنواع مختلفة من جنس بلازموديوم. الأنواع الأكثر انتشارا هي P. falciparum، والتي هي أيضا مسؤولة عن معظم المراضة والوفيات1. يختلف العرض السريري للملاريا من التهابات غير أعراضية أو حميدة إلى مرض معقد/شديد، ويحدث هذا الأخير في الغالب في الأطفال دون سن الخامسة. لا يؤدي التعرض لـ P. falciparum إلى مناعة معقمة ، ولكن الأفراد الذين يعيشون في المناطق المتوطنة يطورون ببطء مناعة ضد المرض السريري. الحماية هي العمر / التعرض التبعية ويتم اكتساب الحصانة عادة خلال أول 5-10 سنوات من الحياة2. تعتبر النساء البالغات استثناءً هاماً، حيث يمكن أن تحدث الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم جمع عينات مصل الإنسان المستخدمة للنتائج المعروضة هنا في دراسة منفصلة19. وقد وافق على جمعها مجلس المراجعة المؤسسي لمعهد نوغوشي التذكاري للبحوث الطبية، جامعة غانا (دراسة 038/10-11)، ومن قبل اللجان الإقليمية لأخلاقيات البحوث، منطقة العاصمة الدانمركية (البروتوكول H-4-2013-083).
1. ثقافة الطفيليات
ملاحظة: اتبع اللوائح المحلية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية.
- الحفاظ على طفيليات P. falciparum وفقا للبروتوكول القياسي كما هو موضح قبل20 في ثقافة الطفيليات المتوسطة (انظر جدول المواد).
- الحفاظ على الطفيليات متزامنة بإحكام باستخد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا نقدم بالتفصيل بروتوكول سبق أن وصفت31 واستخدمت11،12،13،14،15،16،17،18 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للحث على أوسونية والبلعمة من قبل الخلايا THP - 1.
يقيس الفحص ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكول المقدم هنا قد سبق وصفه واستخدامه12،15،17،31 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للحث على opsonization والبلعوم من قبل الخلايا THP - 1. وتركز النتائج المقدمة هنا على الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها بشكل طبيعي VAR2CSA في البلازما / المصل للنساء اللواتي يعشن في منطقة متوطنة P. falciparum. VAR2CSA هو نوع من PfEMP1 المشاركة في عزل المشيمة من.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
مايكن فيستي هو الشكر للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة (MAVARECA II؛ 17-02-KU) من وزارة الخارجية في الدانمرك، ويديرها مركز زمالة دانيدا. ولم يكن للممول أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعدادها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 لوحة لزراعة خلايا البئر ، قاع دائري مع غطاء | Corning | 3799 | يمكن استخدام أي لوحة مماثلة ، تأكد من أنها متوافقة مع أداة مقياس التدفق الخلوي التي تنوي استخدامها |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5٪) | - | 5٪ AlbuMAX-II (Gibco ، 11021-037) ، 0.2 جم / لتر هيبوكسانثين (سيجما ، H9377) في RPMI1640 (سيجما ، R5886) | |
| خلايا الدم الحمراء المضادة للحمراء الجسم المضاد | Abcam | ab34858 | تحضير 2 &# 956 ؛ ل aliquots وتجميد -20 درجة مئوية. استخدم حصة واحدة لكل تجربة. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| محلول بروميد الإيثيديوم | Sigma | E1510 | قم بإعداد محلول مخزون عند 0.1 مجم / مل في RPMI1640 (R5886). تخزين محمي من الضوء |
| FC500 مقياس التدفق الخلوي | Beckman Coulter | يمكن استخدام أي مقياس تدفق خلوي يدعم تنسيق لوحة 96 جيدا ويحتوي على الليزر / المرشحات المناسبة لقياس مضان EtBr. | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | جيبكو | 10099-141 | قم بتعطيل الحرارة قبل الاستخدام. |
| فأر FITC مضاد للإنسان CD16 | BD Biosciences | 555406 أو 556618 | |
| فأر FITC المضاد للإنسان CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| فأر FITC المضاد للإنسان CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| برنامج FlowLogic | تقنيات Inivai | استخدام أي تحليل لقياس التدفق الخلوي ، على سبيل المثال FlowJo أو Winlist | |
| Gentamicin (10mg / mL) | Sigma | G1272 | |
| هيبوكسانثين | سيجما | H9377 | |
| L-الجلوتامين (200 ملم) محلول | التحلل Sigma | G7513 | |
| - | 15 ملي NH4Cl ، 10 ملي NaHCO3 ، 1 ملي متر EDTA | ||
| MACS CS-العمود وملحقاته | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| وسط ثقافة الطفيليات | - | - | 2 ملي مولار L-الجلوتامين (سيجما ، G7513) ، 50 وميكرو ؛ جم / مل جنتاميسين (سيجما ، G1272) ، 0.5٪ AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5٪) في RPMI1640 (سيجما ، R5886) |
| البنسلين / الستربتومايسين (10000U و 10 مجم / مل) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 متوسط | Sigma | R5886 | |
| THP-1 متوسط الثقافة | - | 10٪ FBS (Gibco ، 10099-141) ، 2 ملي مولار L-glutamine (سيجما ، G7513) ، 100U / مل بنسلين ، 0.1 مجم / مل ستربتومايسين (سيجما ، P0781) في RPMI1640 (سيجما ، R5886) | |
| مغناطيس فاريو ماك | ميلتيني بيوتيك |
المراجع
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
