Method Article

التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة CRISPR-بوساطة

DOI:

10.3791/61557

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأشخاص الذين يعانون من طفرات BRCA1 لديهم خطر أعلى للإصابة بالسرطان ، مما يستدعي تقييمًا دقيقًا لوظيفة بدائل BRCA1. هنا، وصفنا بروتوكول للتقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة السيتوسين بوساطة CRISPR التي تمكن من C:G إلى T: تحويل في الخلايا الحية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد بحثت الدراسات الحديثة في المخاطر المرتبطة بالطفرات الجينية BRCA1 باستخدام أساليب تقييم وظيفية مختلفة مثل مقايسات المراسل الفلورية، مقايسات الخلايا الجذعية الجنينية، ومقايسات الحساسية العلاجية المستندة إلى الأدوية. على الرغم من أنها قد أوضحت الكثير من المتغيرات BRCA1، ترتبط هذه المقايسات التي تنطوي على استخدام بدائل BRCA1 أعرب عنها خارجيا مع قضايا فرط التعبير ولا يمكن تطبيقها على ما بعد النسخ. لحل هذه القيود، أبلغنا سابقا عن طريقة للتحليل الوظيفي لمتغيرات BRCA1 عبر محرر قاعدة السيتوسين بوساطة CRISPR التي تحفز استبدال النيوكليوتيدات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام هذه الطريقة، حددنا المتغيرات التي لا تزال وظائفها غامضة، بما في ذلك c.-97C> T، c.154C> T، c.3847C> T، c.5056C> T، وc.4986+5G> A، وأكد أن محررات قاعدة CRISPR بوساطة هي أدوات مفيدة لإعادة تصنيف المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة في BRCA1. هنا، ونحن وصف بروتوكول للتحليل الوظيفي للمتغيرات BRCA1 باستخدام محرر قاعدة cytosine مقرها CRISPR. ويوفر هذا البروتوكول مبادئ توجيهية لاختيار المواقع المستهدفة، والتحليل الوظيفي وتقييم المتغيرات BRCA1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الثدي نوع 1 الجينات القابلية للحساسية(BRCA1) هو معروف على نطاق واسع الجين القامع الورم. لأن جين BRCA1 يرتبط بإصلاح تلف الحمض النووي ، فإن الطفرات في هذا الجين ستؤدي إلى خطر أكبر من تطور السرطان في الفرد1. سرطانات الثدي, المبيض, البروستاتا, وسرطان البنكرياس ترتبط بالطفرات الموروثة فقدان وظيفة (LOF) من الجين BRCA1 2. التقييم الوظيفي وتحديد المتغيرات BRCA1 قد تساعد في الوقاية من الأمراض المختلفة وتشخيصها. لمعالجة وظيفة من المتغيرات BRCA1، وقد تم تطوير عدة طرق وتستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الإمراضية من المتغيرات BRCA1 مثل المقايسات الخلايا الجذعية الجنينية البقاء، المقايسات مراسل الفلورسنت، والعلاجية المخدرات القائمة على الحساسية المقايسات3،4،5،6. على الرغم من أن هذه الطرق قد قيمت وظيفة الكثير من المتغيرات BRCA1، والأساليب التي تنطوي على بدائل BRCA1 أعرب عنها خارجيا تشكل قيودا من حيث فرط التعبير التي قد تؤثر على تنظيم المصب، والجرعة الجينية، والبروتين للطي7. وعلاوة على ذلك ، لا يمكن تسخير هذه المقايسات لتنظيم ما بعد الوصف مثل الربط مرنا ، واستقرار نسخة ، وتأثير المنطقة غير المترجمة8،9.

CRISPR-Cas9 نظام تمكن من تحرير الجينوم المستهدفة في الخلايا الحية والكائنات الحية10. من خلال RNA دليل واحد، يمكن أن تحفز Cas9 فواصل مزدوجة حبلا (DSBs) في الحمض النووي الكروموسومات في loci الجينوم محددة من أجل تنشيط مسارين إصلاح الحمض النووي: غيرhomologous غير عرضة للخطأ نهاية الانضمام (NHEJ) مسار وإصلاح homology خالية من الأخطاء الموجهة (HDR) مسار11. تقرير التنمية البشرية هو آلية دقيقة لإصلاح; ومع ذلك، DSBs الناجمة عن نيكلياز Cas9 لHDR غالباً ما يؤدي إلى إدخال غير المرغوب فيها والحذف (indel) طفرة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحتاج إلى قوالب الحمض النووي المانحة متجانسة لإصلاح تلف الحمض النووي ولها كفاءة منخفضة نسبيا. في الآونة الأخيرة، وقد تم دمج Cas9 نيكاسي (nCas9) مع المجالات cytidine deaminase لاستهداف C:G إلى T:A استبدالات، دون الحاجة إلى قوالب الحمض النووي متماثل والحمض النووي كسر حبلا مزدوج12،13،14،15. باستخدام محرر قاعدة cytosine ، وضعنا طريقة جديدة للتحليل الوظيفي للبدائل BRCA116.

في هذه الدراسة، استخدمنا كريسبر بوساطة محرر قاعدة السيتوسين، BE314، مما يدفع كفاءة C:G إلى T:A الطفرات نقطة، لتنفيذ التقييم الوظيفي للمتغيرات BRCA1 وتحديد بنجاح وظائف عدة متغيرات BRCA1 (الشكل 1).

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل للتقييم الوظيفي. (A) التخطيطي تبين التقييم الوظيفي لBRCA1. لأن LOF من BRCA1 يؤثر على صلاحية الخلية، عندما طفرة BRCA1 هو المسببة للأمراض، تموت الخلايا كما يزيد عدد مرور. (ب) مراحل التقييم الوظيفي لـ BRCA1. مربع منقط اختياري. ويمكن استبداله بtrans-transfection من GRNA التعبير عن و BE3 التعبير عن dna plasmids. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الطريقة الأولى (إنشاء خطوط خلايا HAP1-BE3) اختيارية. بدلا من بناء خط الخلية BE3-التعبير عن, BE3 ترميز الحمض النووي البلازميد يمكن أن تكون تشارك في نقل الحمض النووي مع الحمض النووي بلازميد ترميز الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا أن تستخدم المتغيرات الأخرى من المحررين قاعدة السيتوسين ، مثل BE4max ، لقاعدة تحرير عالية الكفاءة.

1. توليد خطوط خلايا HAP1-BE3

  1. بناء الحمض النووي البلازميد
    1. لبناء dna plasmid العدس من أجل إنتاج فيروس العدس، تضخيم تسلسل الترميز BE3 في pCMV-BE3(جدول المواد)بواسطة PCR باستخدام البوليميراز عالية الدقة. تصميم التمهيدي PCR لاحتواء متداخلة تسلسلات من الموجه هضم (من الخطوة 1.1.2) للتجميع متساوي الحرارة على النحو التالي17:
      التمهيدي -F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGACCGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCACAGA-3'،
      التمهيدي-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGGGCGGCGGGATCC GACTTTCCTCTTCTTTGGG-3'
      ملاحظة: يتم تداخل النوكليوتيدات الموضحة في خط مسطر مع المتجه المهضم وستكون هذه التسلسلات خاصة بالمتجه الوجهة الذي يختاره المستخدم.
    2. Digest lentiCas9-الانفجار(جدول المواد)dna plasmid مع إنزيمات القيد، XbaI و BamHI (1 وحدة لكل 1 ميكروغرام) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. تشغيل المنتج هضم على 0.8٪ agarose هلام وتنقية النطاقات المناسبة الحجم (8.6 كيلوبايت) باستخدام مجموعة استخراج هلام التجارية(جدول المواد).
    3. استنساخ تضخيم المنتج PCR BE3 وهضم lentiCas9- الانفجار ناقلات باستخدام مجموعة التجميع isothermal(جدول المواد). استخدام ما مجموعه 0.02-0.5 pmol من شظايا الحمض النووي ونسبة 1:3 من المتجه: إدراج. تحويل منتج التجميع إلى خلايا DH5 ألفا المختصة18. إضافة المحولات على لوحة أجار التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    4. اختيار عدة مستعمرات وتطعيمها في 4 مل من LB (مرق lysogeny) المتوسطة التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) وتنمو الثقافة في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
    5. تنقية الحمض النووي plasmid باستخدام طقم تنقية الحمض النووي plasmid التجارية(جدول المواد)وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    6. لتأكيد نجاح استنساخ الحمض النووي، وتحليل تسلسل BE3 من كل DNA plasmid تنقية (من الخطوة 1.1.5) من قبل تسلسل سانجر باستخدام التمهيديات القياسية وBE3-محددة(الجدول التكميلي 1) وحدد بالضبط المستنسخة lentiBE3-انفجار البناء.
      ملاحظة: لتحليل نتائج تسلسل السانجر، أوصينا بعدة أدوات مثل BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) وCLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. خلية ثقافة وتوليد من خطوط خلايا HAP1-BE3
    1. الحفاظ على الخلايا في حالة صحية وفي حالة تقسيم بنشاط. ثقافة HAP1 الخلايا في التوسط Dulbecco في Iscove المعدلة(جدول المواد)تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين / ستربتوميسين. ثقافة HEK293T/17 الخلايا في دولبيككو معدلة النسر المتوسط(جدول المواد)تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / ستربتوميسين.
      ملاحظة: خلايا HAP1 مفيدة للبحث الجيني لأنها خلايا هابلويدية تقريبا. ومع ذلك، يمكن أن تعود الخلايا تلقائياً إلى حالة diploid في خلية الثقافة. سوف إثراء Hoechst 34580 ملطخة 1ن-السكان باستخدام flowtometry تكون مفيدة لصيانة haploidy من خلايا HAP119.
    2. بذور 5 × 106 HEK293T/17 الخلايا على طبق 100 نانومتر 1 قبل يوم من نقل. في يوم transfection، ونقل الحمض النووي plasmid (15 ميكروغرام من انفجار lentiBE3، 9 ميكروغرام من psPAX2 للتعبئة والتغليف الفيروسية، و 6 ميكروغرام من pMD2.G لظرف القارورة من الجيلالثاني نظام التعبئة والتغليف العدسي) باستخدام المواد reagentction التجارية وفقا لبروتوكولات الشركةالمصنعة( جدول المواد )20. تغيير المتوسطة في 6 ح بعد transfection وحصاد الفيروس التي تحتوي على المتوسطة في 48 ح أو 72 ح بعد transfection. تصفية عظمى باستخدام مرشح 0.45 μm.
    3. تحويل جزيئات العدس من BE3 إلى خلايا HAP1 في وزارة الداخلية (تعدد العدوى) من 0.1. لضبط ل MOI المناسبة، استخدم تركيزات مخففة متسلسلة من الفيروس. إزالة المتوسطة واستبدالها مع فائقة الفيروسية المعدلة والثقافة الطازجة المتوسطة.
    4. بعد يوم واحد من عملية النقل، قم بتغيير المتوسط إلى 10 ميكروغرام/مل من البلاستيسيدين(جدول المواد)المتوسطة التي تحتوي على وتحديد الخلايا العابرة لمدة 3 أيام مع البلاستيسيدين. بعد تحديد blasticidin، حدد جيدا مع ~ 10٪ من الخلايا الباقية للخطوة التالية.
    5. بعد اختيار blasticidin، بذور الخلايا المستحثة على لوحات 96-جيدا في كثافة 0.5 الخلايا/جيدا من أجل عزل استنساخ واحد (على سبيل المثال، تمييع 50 خلية في 20 مل (0.5 الخلايا لكل 200 ميكرولتر) ثقافة متوسطة و aliquot 200 ميكرولتر في بئر في 96 لوحة جيدا). احتضان لوحات 96-جيدا لمدة 2 أسابيع واختيار المستعمرات واحدة لتأكيد النشاط BE3.
    6. تقسيم المستعمرات واحدة إلى مجموعتين، مجموعة واحدة لاختبار النشاط BE3 وغيرها للصيانة. تحويل جزيئات العدس من gRNAs إلى واحدة من مجموعات لتأكيد النشاط BE3. تحليل تردد الطفرة من كل مستعمرة باستخدام T7 endonuclease I (T7E1، جدول المواد)مقايسة أو عن طريق تنفيذ تقنية التسلسل العميق المستهدفة (الخطوة 4)21. حدد استنساخ واحد المناسبة التي هي صحية ولها BE3 نشطة للغاية.
      ملاحظة: للتحقق من صحة ترددات الطفرات الدقيقة، نوصي بالتسلسل العميق المستهدف من مقايسة T7E1. HEK2 (5'GAACACAAAGCATAGACTGCGGGGG-'3) هو موقع جيد التحقق من صحة الهدف لـ BE3.

2. تصميم وبناء BRCA1 استهداف gRNAs

figure-protocol-1
الشكل 2: مثال على الحمض النووي الريبيRNA. (أ) لتحرير تسلسل الهدف بشكل فعال مع BE3، يلزم إنشاء NGG PAM (CCN PAM) الذي يضع الهدف C (الهدف G) ضمن نافذة خماسية من النيوكليوتيدات. يتم عرض NGG PAM باللون الأحمر ويتم تمثيل إطار التحرير الأساسي بمربع رمادي. (B)يتم الإشارة إلى تسلسل GRNA لـ c.8047C> T (H1283Y) وتحريرها الأساسي وتظهر أزواج C:G المستهدفة باللون الأحمر بينما يتم تمييز الإطار النشط بواسطة مربع رمادي. وبالنسبة لاستنساخ الحمض النووي الريبي، تضاف تسلسلات الشنق المشار إليها بالخط العريض في كلا الطرفين. تم إنشاء نماذج لـ GRNA عن طريق حني القليدين التكميليين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: عناصر التحكم الإيجابية والسلبية من متغيرات BRCA1 ضرورية. في هذه الدراسة، يتم استخدام c.5252G> A (R1751Q) وc.4527C> T (Y1509Y) كضوابط حميدة. c.191G> A (C64Y)، 81-1G> A، وc.3598C> T (Q1200*) تستخدم كضوابط مسببة للأمراض. التسلسلات المستهدفة لكل رنا مرّة مدرجة في الجدول التكميلي 1.

  1. الحصول على تسلسل الجينوم BRCA1 من جينبانك في NCBI22.
  2. ابحث في المواقع المستهدفة 20-bp مع تسلسل Protospacer المجاورة عزر (PAM) "NGG" و "CCN" حول طفرة من الفائدة. وينبغي أن يكون موجودا في طفرة الفائدة في 4-8 النيوكليوتيدات في نهاية PAM-شطة من تسلسل الهدف GRNA بسبب النافذة النشطة من BE3 هو 4-8 النيوكليوتيدات في نهاية PAM-شطة من تسلسل الهدف GRNA14. في حالة c.8047C> T (H1283Y)- وc.5252G> A (R1751Q) استهداف gRNAs، 5-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3 و 5-CCA-CCAGGTCCAAAGCGAGCAA-3 3، التسلسل في جريئة هي النوافذ النشطة. C إلى T وG إلى A تحدث التحويلات مع NGG و CCN PAM ، على التوالي (الشكل 2A).
    ملاحظة: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 هو أدوات مفيدة على شبكة الإنترنت لتصميم GRNA.
  3. طلب اثنين من أوليغونوكليوتيدات تكميلية لكل رنا؛ بالنسبة إلى oligonucleotides إلى الأمام، أضف "CACCG" إلى النهاية 5 من تسلسل الدليل، وبالنسبة لـ oligonucleotides العكسي، أضف "AAAC" إلى نهاية 5 و "C" إلى نهاية 3. هذه التسلسلات الإضافية خاصة بمتجه تعبير GRNA الوجهة (من الخطوة 2.5) المستخدمة لهذا البروتوكول، وينبغي تعديل المستخدمين لناقلات التعبير GRNA بديلة(الشكل 2B).
  4. Resuspend oligonucleotide في الماء المقطر في تركيز نهائي من 100 μM. مزيج اثنين من oligonucleotides التكميلية إلى تركيز نهائي من 10 μM مع T4 الربط العازلة(جدول المواد)وتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتبريدها في درجة حرارة الغرفة للحن.
  5. هضم pRG2 باستخدام إنزيم القيد، BsaI (1 وحدة لكل 1 ميكروغرام) ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية(جدول المواد). تشغيل المنتج هضم على 1٪ agarose هلام وتنقية الفرقة المناسبة الحجم (2.5 كيلو بايت).
    ملاحظة: بدلاً من استخدام أسلوب الهضم واللتصاج الكلاسيكي، يمكن استخدام أسلوب استنساخ أخرى مثل استنساخ البوابة الذهبية.
  6. Ligate oligonucleotide الدوبلوج إلى الحمض النووي ناقلات باستخدام الحمض النووي التي تم شراؤها ligase(جدول المواد)وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتحويلها إلى DH5 ألفا المختصة الخلايا (غيرها من سلالات القولونية E. التي تستخدم على نطاق واسع لscloning subcloning أيضا يمكن استخدامها).
  7. إضافة المحولات إلى لوحة أغار التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تنقية plasmid الحمض النووي من عدة محولات وتحليل تسلسلها GRNA من قبل تسلسل سانجر باستخدام التمهيدي الذي رئيس في U6 المروج (جدول المواد).

3. إنشاء بدائل BRCA1 باستخدام أدوات تحرير قاعدة CRISPR بوساطة

ملاحظة: إذا لم يتم استخدام خطوط خلايا HAP1-BE3، يمكن أن يكون CO-transsmid ترميز الحمض النووي BE3 -1 مع BRCA1-استهداف GRNA. بالمقارنة مع co-transfection من BE3 وGRNA plasmids، transfection من plasmid GRNA إلى خلايا HAP-BE3 تحفز كفاءة تحرير قاعدة تصل إلى 3 أضعاف في مكان الهدف في أيدينا.

  1. البذور 5 × 105 HAP1 - BE3 الخلايا (أو خلايا HAP1 في حالة أساليب co-transfection) في بئر في 24-جيدا لوحات 1 يوم قبل transfection. في وقت transfection ، والخلايا الثقافة للوصول إلى كثافة مناسبة (التقاء 70 ٪-80٪).
  2. Transfect BRCA1-استهداف gRNAs باستخدام الكواشف transfection شراؤها (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام 1 ميكروغرام من BRCA1-استهداف gRNAs (مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد BE3-ترميز في حالة أساليب النقل المشترك) للحث C:G إلى T: تحويل في المواقع المستهدفة BRCA1. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية والثقافة الفرعية كل 3-4 أيام.
  3. حصاد الكريات الخلية 3 و 10 و 24 يوما بعد transfection لتحليل كفاءة تحرير قاعدة (عينات من 3 أيام بعد transfection يتم تحليلها regrading كما عينات اليوم 0).
  4. استخراج الحمض النووي الجينوم باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية(جدول المواد).
    ملاحظة: نوصي بتحسين ظروف النقل مع نسبة متغيرة من الكاشف إلى الحمض النووي. الحالة المثلى لTRANS1 هو 4:1 حصة من الكاشف إلى الحمض النووي في أيدينا.

4. إعداد العينة لتسلسل الجيل التالي من إيلومينا (NGS)

figure-protocol-2
الشكل 3: التحضير لتسلسل الجيل التالي. تم تصميم التمهيديPCR 1 لتضخيم الموقع المستهدف BRCA1 على الحمض النووي الجينومي. تم تصميم التمهيديPCR nd 2 بحيث تقع تسلسله داخل أكثر من تسلسل التمهيدي PCR 1st. تمت إضافة تسلسلات إضافية تظهر كشريط أصفر على طرفي التمهيدي الثاني PCR لإرفاق التسلسلات الأساسية لتنفيذ تسلسل الجيل التالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تصميم التمهيديات 1ST PCR لتضخيم مواقع BRCA1 المستهدفة. على الرغم من عدم وجود قيود على حجم المنتج 1ST PCR، من المستحسن حجم المنتج من <1 كيلوبايت لتضخيم بكفاءة منطقة معينة(الشكل 3).
  2. تصميم2 PCR التمهيدية التي تقع داخل المنتج PCR 1st. النظر في حجم amplicon وفقا لNGS طول القراءة (على سبيل المثال، يجب أن يكون حجم المنتج amplicon أصغر من 300 bp لمدة 2 × 150 bp الزوجية نهاية تشغيل لدمج كل يقرأ). من أجل إرفاق تسلسلات أساسية لتحليل NGS، إضافة تسلسلات إضافية إلى 5' نهاية التمهيديات2 PCR على النحو التالي: ل التمهيديات إلى الأمام، إضافة 5'-ACACTCTTTCACACACGACGCTCCCGATCT-3' تسلسل إلى 5'، وبالنسبة لل التمهيديات العكسية، إضافة 5'-GTGACTGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGTGCCTTCTTCCG ATCT-3'تسلسل إلى نهاية 5'
    ملاحظة: استخدمنا PCR متداخلة لتقليل amplicon من الربط غير محددة عن طريق منع التمهيديات من إرفاق تسلسل غير الهدف.
  3. تضخيم المواقع المستهدفة BRCA1 على الحمض النووي الجينومي التي تم الحصول عليها من ثلاث نقاط زمنية. استخدام البوليميراز عالية الدقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للتقليل من أخطاء PCR. بالنسبة لتفاعل PCR1st، استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي للتضخيم على مدى 15 دورة. بالنسبة لتفاعل PCRالثاني، استخدم 1 ميكرولتر من منتج PCR1 لتضخيمه على مدى 20 دورة. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج2 PCR nd على 2٪ agarose هلام وتأكيد حجم.
  4. من أجل إرفاق تسلسلات أساسية لتحليل NGS، تضخيم المنتج2 PCR nd باستخدام التمهيديات المذكورة أدناه. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتعدد الكلور، يتم استخدام 1 ميكرولتر من منتج PCRالثاني للتضخيم حتى 30 دورة باستخدام البوليميراز عالي الدقة.
    1. لتنفيذ تسلسل تعددي لأعداد كبيرة من المكتبات التي سيتم تجميعها وتسلسلها في وقت واحد، استخدم إلى الأمام (D501 – D508) وعكس (D701 – D712) التمهيدية، التي لها تسلسل فهرس فريد(الجدول التكميلي 1). تضخيم كل عينة باستخدام مجموعات التمهيدي مختلفة لإجراء استراتيجية الفهرسة المزدوجة فريدة من نوعها.
    2. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج PCR على 2٪ agarose هلام لتأكيد حجم، وتنقية amplicon باستخدام PCR التجارية تنظيف عدة (جدول المواد). اخلط كل عينة بكميات متساوية لإنشاء مكتبة NGS.
  5. كمي مكتبة NGS في الطول الموجي 260 نانومتر باستخدام الطيف الضوئي وتمييع مكتبة NGS لتركيز 1 nM باستخدام عازلة resuspension أو 10 mM تريس HCl، درجة ح H 8.5. إعداد 100 ميكرولتر من المكتبة المخففة لتركيز التحميل المناسب اعتمادا على أنواع المكتبة (على سبيل المثال، إعداد 200 pM من المكتبة لـ Nextera DNA Flex).
    1. كتحكم، والجمع بين phiX مع العينة المخففة المناسبة لنوع من عدة.
    2. قم بتحميل المكتبة على الكارتريدج و قم بتشغيل NGS وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. Illumina iSeq 100 أو نظم مسيك يمكن تسلسل amplicons من طول مختلف يصل إلى 300 BP لقراءة واحدة أو الاقتران نهاية. أوصينا أكثر من 10،000 يقرأ لكل أمبيركون الهدف لتحليل متعمق لكفاءة تحرير قاعدة.

5. تحليل كفاءة التحرير الأساسي للتقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1

  1. تحليل كفاءة التحرير الأساسي باستخدام MAUND24. يتم حساب كفاءة التحرير الأساسي كما هو موضح أدناه.
    figure-protocol-3
    إذا كانت السيتوسينات متعددة موجودة في إطار BE3 النشطة، فقط تحويل C إلى T التي تستهدف لتقييم البديل BRCA1 يعتبر. على سبيل المثال، إذا كانت تسلسلات إطار BE3 النشطة هي "C4A5T6C7T8،" التسلسلات المحتملة التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير القاعدة هي "T4A5T6C7T8" ، "C4A5T 6 T7T8" ، و "T4A5T6T7T8". في هذا الوقت، إذا كان الموقف 4 هو الموضع المستهدف لـ BRCA1 المتغير المطلوب، ثم فقط "T4A5T6C7T8" يعتبر تسلسل لحساب كفاءة التحرير الأساسي.
    ملاحظة: نوصي أيضا أدوات ويب أخرى لتحليل نشاط تحرير قاعدة مثل CRISPResso225، و BE-محلل23.
  2. تحقق من النتائج باستخدام عناصر التحكم الإيجابية والسلبية لمتغيرات BRCA1. وينبغي أن تظل كفاءة التحرير الأساسي للرقابة الحميدة كما هي، في حين أن كفاءة الرقابة المسببة للأمراض ينبغي أن تنخفض بمرور الوقت.
  3. حساب كفاءة التحرير الأساسي النسبي لمتغيرات BRCA1 وتحديد إمراضيتها. يتم تحليل الاختلافات الهامة بين يوم 0 و 21 عينات التحليل الإحصائي المناسب مثل t-test.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكن النهج التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول من التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 الذاتية التي تم إنشاؤها بواسطة محررات قاعدة السيتوسين المستندة إلى CRISPR. لتحديد خطوط الخلايا المناسبة للتقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 ، يجب على الباحثين التأكد من أن BRCA1 هو جين أساسي في خطوط الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، نحن أول كاس 9 المصابة وgRNAs في خطوط خلايا HAP1 لتعطيل BRCA1 وتحليل ترددات الطفرات من خلال التسلسل العميق المستهدفة. وجدنا أن ترددات الطفرات انخفضت بشكل ملحوظ مع مرور الوقت في خط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة للتقييمات الوظيفية لمتغيرات BRCA1 باستخدام محرر قاعدة السيتوسين المتأملة CRISPR. ويصف البروتوكول أساليب تصميم الـ gRNAs عند موضع الهدف وبناء الـ DNAs البلازميد التي يتم التعبير عنها منها. المحررات قاعدة Cytosine حث تحويل النيوكليوتيدات في نافذة نشطة (في حالة BE3, النوكليوتيدات 4-8 في نهاية PAM-distal من تسلسل الهدف GRNA). يجب على الباحث اختيار بعناية تسلسل الهدف لأن جميع السيتوسينات في النافذة النشطة يمكن أن تحل محلها thymines. وعلاوة على ذلك، كما هو موضح في الخطوة 5، ينبغي تحليل ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (المنح 2017M3A9B4062419، 2019R1F1A1057637، و 2018R1A5A2020732 إلى Y.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHINEBR3136إنزيم التقييد
BlasticidinThermo Fisher A1113903 العلميدواء لاختيار الخلايا المنقولة
BsaINEBR0535إنزيم التقييد
DNeasy Blood & مجموعة الأنسجةQiagen69504مجموعة إعداد الحمض النووي الجيني
Dulbecco s النسر المعدل s متوسطGibco11965092متوسط ل HEK293T/17 خلية
مصل الأبقار الجنينيGibco16000036Supplemetal لزراعة الخلايا
كاشف التعداء FuGENE HDPromegaE2311كاشف التعداء
جيبسون الجمعية ماستر ميكسNEBE2611Lمجموعة تجميع جيبسون
Iscove ' s Dulbecco المعدل s متوسطGibco12440046متوسط لخلايا HAP1
lentiCas9-BlastAddgene52962البلازميدات DNA لاستنساخ lentiBE3
Lipofectamine 2000كاشفالإرسال 11668027 Thermo Fisher
Scientific Opti-MEMGibcoمواد التعداء31985070
pCMV-BE3Addgene73021البلازميدات الحمض النووي ل lentiBE3 استنساخ
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140Supplemetal لزراعة الخلايا
Phusion عالي الدقة DNA PolymeraseNEBM0530SQبوليميراز عالي الدقة
pMD2.GAddgene12259البلازميدات DNA لإعداد الفيروسات.
pRG2Addgene104174gRNA استنساخ ناقل
psPAX2Addgene12260البلازميدات DNA لإعداد الفيروسات.
طقم QIAprep Spin MiniprepQiagen27106البلازميد DNA الإعدادية. طقم
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704طقم استخراج الجل
QIAquick PCR طقم تنقية QIAquick PCRQiagen28104PCR المنتج الإعدادي. طقم
طقم الربط السريعNEBM2200Ligase لاستنساخ gRNA
T7 Endonuclease Iمواد NEBM0302 لمقايسة T7E1
XbaINEBR0145إنزيم التقييد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242(2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473(2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542(2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BRCA1 VariantsCRISPR Base EditorCytosine Base EditorFunctional AssessmentEndogenous MutationHAP1 CellsGuide RNA DesignNGS AnalysisBase Editing EfficiencyVariant Classification

Related Articles