تطبيق إكسوسووم هو أداة ناشئة لتطوير الأدوية والطب التجديدي. نحن ننشئ بروتوكول عزل إكوسوم مع نقاء عالية لعزل إكسوسومات من الخلايا الجذعية رواية محددة تسمى CB-SC للدراسات الميكانيكية. نحن أيضا coculture CB-SC المستمدة من الاكسوس مع monocytes الإنسان، مما يؤدي إلى تمايزها إلى الضامة المتميزة الظاهري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تمايز أحاديات في الضامة الظاهرية متميزة بعد العلاج مع الخلايا الجذعية دم الحبل السري البشري (CB-SC) إكسوسوم المستمدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علاج اختصاصي الخلايا الجذعية (SCE) هو نهج سريري جديد لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى. يعمم العلاج SCE خلايا الدم أحادية النواة للمريض المعزول (على سبيل المثال، الخلايا اللمفاوية والموحدات) من خلال جهاز استئصال الخلايا السفلية، ويشارك في الثقافات خلايا الدم أحادية النوى للمريض مع الخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل السري (CB-SC) في جهاز SCE، ثم تعيد هذه الخلايا المناعية "المتعلمة" إلى دم المريض. Exosomes هي الحويصلات خارج الخلية بحجم نانو بين 30\u2012150 نانومتر الموجودة في جميع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا والخلايا الحيوية. لمزيد من استكشاف الآليات الجزيئية الكامنة تحت العلاج SCE وتحديد إجراءات exosomes الافراج عن CB-SC، ونحن التحقيق في الخلايا التي phagocytize هذه الكوسومات أثناء العلاج مع CB-SC. من خلال المشاركة في زراعة ديو المسمى بـ CB-SC المشتقة من الإزقاقات مع خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية البشرية (PBMC) ، وجدنا أن الإكزومات المشتقة من CB-SC تم تناولها في الغالب من قبل monocytes البشرية ذات CD14 الإيجابية ، مما يؤدي إلى تمايز أحادية في النوع 2 الضامة (M2) ، مع مورفولوجيا تشبه المغزل وتعبير العلامات الجزيئية السطحية المرتبطة بـ M2. هنا، نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف اكسوزومات مشتقة من CB-SC والبروتوكول للثقافة المشتركة من الاكسوس المستمدة من CB-SC مع monocytes الإنسان ورصد التمايز M2.
المقدمة
الخلايا الجذعية لدم الحبل السري (CB-SC) هي نوع فريد من الخلايا الجذعية التي تم تحديدها من دم الحبل السري البشري وتتميز عن الأنواع الأخرى المعروفة من الخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية الميزينشية (MSC) والخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. استنادا إلى خصائص فريدة من نوعها من التشكيل المناعي وقدرتها على الالتزام بإحكام إلى سطح أطباق بيتري، وضعنا تقنية جديدة معينة كمربي الخلايا الجذعية (SCE) العلاج في التجارب السريرية2،3. أثناء العلاج SCE ، يتم جمع خلايا الدم الأحادية الطرفية للمريض (PBMC) وتعميمها من خلال فاصل الخلايا والمشاركة في الثقافة مع CB-SC في المختبر. ثم تعاد هذه الخلايا "المتعلمة" (C....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية في مركز الاكتشاف والابتكار، هاكينساك ميريديان هيلث. تم شراء وحدات الدم معطف الإنسان من مركز الدم في نيويورك (نيويورك، نيويورك). تم جمع وحدات دم الحبل السري البشري من متبرعين أصحاء وتم شراؤها من بنك الدم الدولي Cryo-Cell (Oldsmar, FL). وقد حصل كل من مركز نيويورك للدم وكريو-سيل على جميع الاعتمادات لجمع الدم وتوزيعه، بموافقة المجلس ووقّع استمارات الموافقة من المتبرعين.
1. خلية ثقافة وإعداد CB-SC- مشتقة المتوسطة مشروطة
- نقل 25 مل من دم الحبل السري (جدول المواد) أكثر من 20 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار (γ = 1.077) إلى أنبوب مخروطي 50 مل. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في البداية، تم فحص النمط الظاهري ونقاء CB-SC بواسطة قياس التدفق الخلوي مع علامات CB-SC المرتبطة مثل مستضد الكريات البيض المشترك CD45، وعوامل النسخ الخاصة بالخلايا ES OCT3/4، وSOCX2. CB-SC عرض مستويات عالية من CD45، OCT3/4، SOX2، CD270، و 9 galectin التعبير، ولكن لا تعبير عن CD34 (الشكل 1A). وأكد تحليل تدفق قياس الثغرات التعبير عن علامات اكسوسومات محددة بما في ذلك CD9، CD81، وD63 كانت على اكسوزومات CB-SC المشتقة (الشكل 1B). وتتميز مورفولوجيا وحجم توزيع الاكوسوم م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تطبيق الإكسوسوم هو مجال ناشئ للتشخيص السريري، والتطورات الدوائية والطب التجديدي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل بشأن إعداد اكسوزومات مشتقة من مادة CB-SC والدراسة الوظيفية للاكسوسومات على التمييز بين أحاديات الإنسان. أظهر البروتوكول الحالي أن الإكسوسومات الوظيفية المشتقة من SC يتم عزلها بالطرد المركزي المتتابع والطرد فوق المركز مع نقاء عالي وعرض التشكيل المناعي على الخلايا الأحادية.
بالمقارنة مع البروتوكولات التقليدية الأخرى، فإن الترشيح الفائق هو نهج راسخ لعزل وتنقية الإكسوسات من خلايا أو وسائط مختلف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الدكتور تشاو هو مؤسس Tianhe الخلايا الجذعية للتكنولوجيا الحيوية هي شركة الدكتور جاو مخترع التكنولوجيا Cell Cell. ولا يملك جميع المؤلفين الآخرين أي مصالح مالية قد تكون ذات صلة بالعمل المقدم.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون للسيد بوددار والسيد لودفيغ على الدعم السخي للتمويل من خلال مؤسسة هاكينساك UMC. ونحن نقدر لورا تشاو لتحرير اللغة الإنجليزية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق فيشر ساينتفيك | 05-408-129 | |
| 15 مل أنبوب مخروطي | فالكون | 352196 | |
| لوح 24 بئر | فالكون | 351147 | ثقافة غير الأنسجة لوحة |
| 3،3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | تخزين في 4 درجات ؛ C |
| 300 شبكة | تيد بيلا | 1GC300 | |
| 50 مل أنبوب مخروطي | فالكون | 352070 | |
| لوحة 6 آبار | Falcon | 353046 | لوحة زراعة |
| الأنسجة 96 بئر لوحة | Falcon | 353072 | لوحة زراعة |
| الأنسجة ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 مل |
| Amicon-15 10kDa وحدة فلتر الطرد المركزي | متجر Millipore sigma | UFC901024 | |
| Biolegend | المضاد للإنسان | 634501 في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2268110 | |
| Calnexin Biolegend 699401 المضاد للإنسان | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2728519 | ||
| الأجسام المضادة للإنسان CD11c ، 561356 تخزين Pe-Cy7 | BD Bioscience | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_10611859 | |
| الأجسام المضادة للإنسان CD14 ، متجر Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2728099 |
| الأجسام المضادة CD163 المضادة للإنسان ، | BD Bioscience | 556018 | مخزن في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_396296 |
| الأجسام المضادة CD19 المضادة للإنسان ، PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | المتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_131160 |
| الأجسام المضادة للإنسان CD206 ، متجر FITC | BD Bioscience | 551135 | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_394065 |
| الجسم المضاد CD209 المضاد للإنسان ، متجر 564127 Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2738610 | |
| الأجسام المضادة للإنسان CD270 ، | Biolegend | 318806 | المتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2203703 |
| الأجسام المضادة CD3 المضادة للإنسان ، Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | المتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_1595437 |
| الأجسام المضادة CD34 المضادة للإنسان ، متجر IM2427U APC | Beckman Coulter | في 4 درجات ؛ C ، RRID: N / | |
| A الجسم المضاد CD4 المضاد للإنسان ، متجر 555349 APC | BD Bioscience | عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_398593 | |
| الأجسام المضادة CD45 المضادة للإنسان ، متجر IM3548U Pe-Cy7 | Beckman Coulter | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_1575969 | |
| الأجسام المضادة CD56 المضادة للإنسان ، PE | Beckman Coulter | IM2073U | المتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_131195 |
| الأجسام المضادة CD63 المضادة للإنسان ، | BD Bioscience | 561925 | مخزن في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_10896821 |
| الأجسام المضادة CD8 المضادة للإنسان ، متجر APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | في 4 درجات ؛ C ، RRID: N / |
| A جسم مضاد CD80 مضاد للإنسان ، متجر APC | Beckman Coulter | B30642 | في 4 درجات ؛ C ، RRID: N / |
| A الأجسام المضادة CD81 المضادة للإنسان ، متجر FITC | BD Bioscience | 561956 | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_394049 |
| الجسم المضاد CD86 المضاد للإنسان ، متجر APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | عند 4 درجات ؛ C ، RRID: N / |
| A الجسم المضاد CD9 المضاد للإنسان ، | FITC ThermoScientic | MA5-16860 | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2538339 |
| الجسم المضاد للإنسان Galectin 9 ، متجر Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2716134 |
| جسم مضاد OCT3 / 4 مضاد للإنسان ، eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | مخزن عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_11218882 |
| الجسم المضاد SOX2 المضاد للإنسان ، متجر Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | York Blood Center | 40-60 مل / وحدة | |
| مكشطة خلية | Falcon | 353085 | |
| يمكن التخلص منها شبه | كوفيت VWR | 97000590 | |
| عازلة التفكك | Gibco | 131510014 | 100 مل |
| شرائح عد الخلايا المزدوجة Chanber | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 كاشف | الكشف عن ThermoFisher Scientific | 10606D | مخزن في 4 درجات ؛ C |
| Ficoll-Paque PLUS كثافة الوسائط الكبرى | GE Health | 17-1440-03 | 500 مل |
| دوار بزاوية ثابتة (25 درجة ؛) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 × g |
| Gallios Flow Cellular | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max | |
| Human Cordifc Blood | Cryo-Cell International | 40-100 مل / وحدة | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | مخزن في 4 درجات ؛ C |
| Immun-Blot PVDF غشاء | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP وحدة تصفية حقنة ، 0.22 & micro ؛ م | ميليبور سيجما | SLGP033RS | |
| أوبتيما XE-90 Ultracentriguge | بيكمان كولتر | ||
| أوربيتال شاكر MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 مل |
| بروبيديوم يوديد | BD Bioscience | 56-66211E | مخزن في 4 درجات ؛ C |
| نيكون Eclipse Ti2 المجهر | نيكون إنسترومنتس إنك | Eclipse Ti2 | NIS-Elements إصدار البرنامج 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 مل |
| Revert microsopy | فيشر | 12563518 | |
| الدوار 41 Ti | بيكمان كولتر | 331362 | ماكسيوم 41,000 دورة في الدقيقة |
| Sorvall St 16R الطرد المركزي | الحراري Scientifc | 75004381 | |
| يتأرجح دلو الدوار | الحرارية Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 عداد الخلايا | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle حاضنة CO2 | ThermoFisher Scientific | ||
| المجهر الإلكتروني | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| أنبوب الطرد المركزي الفائق | بيكمان كولتر | 331372 | |
| X'VIVO 15 متوسط خال من السيروم | لونزا | BEBP04-744Q | 1000 مل وسط استزراع ، يخزن في 4 درجات ؛ ج |
المراجع
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration followin....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
