مقالة منهجية

تمايز أحاديات في الضامة الظاهرية متميزة بعد العلاج مع الخلايا الجذعية دم الحبل السري البشري (CB-SC) إكسوسوم المستمدة

DOI:

10.3791/61562

⸱

نوفمبر 12, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطبيق إكسوسووم هو أداة ناشئة لتطوير الأدوية والطب التجديدي. نحن ننشئ بروتوكول عزل إكوسوم مع نقاء عالية لعزل إكسوسومات من الخلايا الجذعية رواية محددة تسمى CB-SC للدراسات الميكانيكية. نحن أيضا coculture CB-SC المستمدة من الاكسوس مع monocytes الإنسان، مما يؤدي إلى تمايزها إلى الضامة المتميزة الظاهري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علاج اختصاصي الخلايا الجذعية (SCE) هو نهج سريري جديد لعلاج مرض السكري من النوع 1 وأمراض المناعة الذاتية الأخرى. يعمم العلاج SCE خلايا الدم أحادية النواة للمريض المعزول (على سبيل المثال، الخلايا اللمفاوية والموحدات) من خلال جهاز استئصال الخلايا السفلية، ويشارك في الثقافات خلايا الدم أحادية النوى للمريض مع الخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل السري (CB-SC) في جهاز SCE، ثم تعيد هذه الخلايا المناعية "المتعلمة" إلى دم المريض. Exosomes هي الحويصلات خارج الخلية بحجم نانو بين 30\u2012150 نانومتر الموجودة في جميع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا والخلايا الحيوية. لمزيد من استكشاف الآليات الجزيئية الكامنة تحت العلاج SCE وتحديد إجراءات exosomes الافراج عن CB-SC، ونحن التحقيق في الخلايا التي phagocytize هذه الكوسومات أثناء العلاج مع CB-SC. من خلال المشاركة في زراعة ديو المسمى بـ CB-SC المشتقة من الإزقاقات مع خلايا أحادية النوى الدموية الطرفية البشرية (PBMC) ، وجدنا أن الإكزومات المشتقة من CB-SC تم تناولها في الغالب من قبل monocytes البشرية ذات CD14 الإيجابية ، مما يؤدي إلى تمايز أحادية في النوع 2 الضامة (M2) ، مع مورفولوجيا تشبه المغزل وتعبير العلامات الجزيئية السطحية المرتبطة بـ M2. هنا، نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف اكسوزومات مشتقة من CB-SC والبروتوكول للثقافة المشتركة من الاكسوس المستمدة من CB-SC مع monocytes الإنسان ورصد التمايز M2.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية لدم الحبل السري (CB-SC) هي نوع فريد من الخلايا الجذعية التي تم تحديدها من دم الحبل السري البشري وتتميز عن الأنواع الأخرى المعروفة من الخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية الميزينشية (MSC) والخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. استنادا إلى خصائص فريدة من نوعها من التشكيل المناعي وقدرتها على الالتزام بإحكام إلى سطح أطباق بيتري، وضعنا تقنية جديدة معينة كمربي الخلايا الجذعية (SCE) العلاج في التجارب السريرية2،3. أثناء العلاج SCE ، يتم جمع خلايا الدم الأحادية الطرفية للمريض (PBMC) وتعميمها من خلال فاصل الخلايا والمشاركة في الثقافة مع CB-SC في المختبر. ثم تعاد هذه الخلايا "المتعلمة" (CB-SC-تعامل PBMC) إلى الدورة الدموية للمريض في نظام حلقة مغلقة. وقد أثبتت التجارب السريرية بالفعل السلامة السريرية وفعالية العلاج SCE لعلاج أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك مرض السكري من النوع 1 (T1D)2,4 و الثعلبة areata (AA)5.

Exosomes هي عائلة من الجسيمات النانوية مع أقطار تتراوح 30\u2012150 نانومتر، وتوجد في جميع وسائل الإعلام بيوفلورويد والخلايا ثقافة6. يتم إثراء إكسوسومات مع العديد من الجزيئات النشطة بيولوجيا بما في ذلك الدهون، mRNAs، والبروتينات، وmicroRNAs (ميرنا)، وتلعب دورا هاما في الاتصالات من خلية إلى خلية. في الآونة الأخيرة، أصبحت اكسوزومات أكثر جاذبية للباحثين وشركات الأدوية نظرا لإمكاناتهم العلاجية في العيادات7،8،9. في الآونة الأخيرة، أظهرت دراساتنا الميكانيكية أن الإكسوسومات CB-SC التي تم إصدارها تساهم في التشكيل المناعي للعلاج SCE10.

هنا، ونحن وصف البروتوكول لاستكشاف آلية العلاج SCE استهداف monocytes بواسطة اكسوزومات CB-SC صدر. أولاً، تم عزل الاستئصالات الصادرة من CB-SC من الوسائط المكيفة المشتقة من CB-SC باستخدام أساليب الاستئصال الفائق والتحقق من صحتها عن طريق قياس التدفق، واللطخة الغربية (البنك الدولي) وتشتت الضوء الديناميكي (DLS). ثانياً، تم تسمية الكوسومات المشتقة من CB-SC بصبغة شفة خضراء فلورية: ديو. ثالثاً، كانت هذه المنشآت مُزَمَّقة مع PBMC لدراسة النسب المئوية الإيجابية من الإزوسومات المشتقة من ديو CB-SC في المنشآت الفرعية المختلفة من PBMC بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لدراسة عمل الإكسوسومات الكامنة في التشكيل المناعي للخلايا الجذعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية في مركز الاكتشاف والابتكار، هاكينساك ميريديان هيلث. تم شراء وحدات الدم معطف الإنسان من مركز الدم في نيويورك (نيويورك، نيويورك). تم جمع وحدات دم الحبل السري البشري من متبرعين أصحاء وتم شراؤها من بنك الدم الدولي Cryo-Cell (Oldsmar, FL). وقد حصل كل من مركز نيويورك للدم وكريو-سيل على جميع الاعتمادات لجمع الدم وتوزيعه، بموافقة المجلس ووقّع استمارات الموافقة من المتبرعين.

1. خلية ثقافة وإعداد CB-SC- مشتقة المتوسطة مشروطة

  1. نقل 25 مل من دم الحبل السري (جدول المواد) أكثر من 20 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار (γ = 1.077) إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. جهاز طرد مركزي في 1,690 x ز لمدة 20 دقيقة في 20 درجة مئوية في الدوار دلو يتأرجح دون الفرامل.
  3. نقل بعناية طبقة الخلية أحادية النوى (معطف بافي) إلى أنبوب جديد مخروطي 50 مل. ملء أنبوب مخروطي مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) إلى 40 مل. مزيج وطاردة مركزية لخلايا بيليه في 751 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant وإضافة 15 مل من ACK تحلل العازلة(جدول المواد)إلى بيليه الخلية. إعادة تعليق الخلايا من خلال الأنابيب. ثم احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الخطوة إزالة خلايا الدم الحمراء.
  5. ملء أنبوب مخروطي مع 25 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 751 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص من فوق للحصول على خلايا أحادية النواة.
  6. غسل 2x مع 40 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة العازلة تحلل المتبقية.
  7. جهاز طرد مركزي في 751 × ز لمدة 5 دقائق ل بيليه الخلايا.
  8. تخلص من الخلايا أحادية النواة في دم الحبل السري وإعادة تعليقها مع 10 مل من الوسيط الخالي من المصل(جدول المواد)لكل أنبوب.
  9. الجمع بين خلايا أحادية النوى في دم الحبل السري إلى أنبوب واحد.
  10. اتخاذ 20 μL تعليق الخلية وخلط مع 20 ميكرولتر من 0.4٪ trypan حل الأزرق(جدول المواد)في أنبوب 1.5 مل.
  11. قم بتحميلها في شريحة الغرفة وتحديد رقم الخلية وقابلية الخلية للتطبيق باستخدام عداد خلية تلقائي.
    ملاحظة: يتم تخفيف تعليق الخلية عند 1:10 إذا كان تركيز الخلية أعلى من 1 × 107 خلايا/مل.
  12. بذور الخلايا أحادية النوى في 150 مم × 15 ملم أطباق بيتري في 1 × 106 خلايا / مل، 25 مل / طبق في مصل خال من الخلايا المتوسطة المعرفة كيميائيا.
  13. احتضان في 37 درجة مئوية تحت 8٪ CO2 شروط لمدة 10\u201214 أيام حتى CB-SC تصل إلى أكثر من 80٪ التقاء.
  14. تجاهل افرا و غسل مع 15 مل من برنامج تلفزيوني لكل طبق بيتري; ثم، إزالة برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يتم إرفاق CB-SC بأطباق بيتري بإحكام.
  15. كرر الخطوة 1.14 مرتين.
  16. أضف 25 مل من مصل خالي من الوسيلة الكيميائية في طبق بيتري.
  17. احتضان في 37 درجة مئوية تحت 8٪ ثاني2 شروط لمدة 3\u20124 أيام.
  18. جمع المتوسط مكيفة CB-SC المستمدة في أنابيب مخروطية 50 مل.

2- توصيف CB-SC

  1. فصل CB-SC بواسطة pipetting 10 مل من خلية الفصل على أساس برنامج تلفزيوني العازلة صعودا وهبوطا مع تلميح ماصة 5 مل(جدول المواد).
  2. أجهزة الطرد المركزي في 1690 × ز لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه وإعادة تعليق في 200 μL من برنامج تلفزيوني.
  3. إصلاح و Permeabilize الخلايا لتلوين داخل الخلايا عن طريق تلطيخ إعداد عدة (جدول المواد).
  4. إضافة 5 ميكرولتر من مانع Fc(جدول المواد)لكل عينة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمنع مانع Fc الربط غير المحدد عند التلطيخ بالأجسام المضادة.
  5. إضافة الفلوريسنس-مترافق الماوس المضادة للأجسام المضادة البشرية أحادية النسيلة بما في ذلك CD34، CD45، SOX2، OCT3/4، CD270، وGalectin 9 في 25 ميكروغرام / مل(جدول المواد)إلى 100 ميكرولتر حجم الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية خفيفة.
  6. بعد تلطيخ، وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 751 × ز لمدة 10 دقيقة إلى خلايا بيليه.
  7. إعادة تعليق الخلايا مع 200 μL من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب 5 مل.
  8. تنفيذ عملية استئصال التدفق للتحقق من صحة التعبير من CB-SC-المرتبطة علامات أعلاه محددة.

3- عزل الاكسوس المستمد من CB-SC

  1. جهاز طرد مركزي المتوسط المُكيف الذي تم جمعه من الخطوة 1.18 عند 300 x غم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
  2. جهاز طرد مركزي المُجمع من الخطوة 3.1 عند 2000 x غم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
  3. جهاز طرد مركزي المُجمع من الخطوة 3.2 عند 10000 x ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
    ملاحظة: يتم استخدام الدوار زاوية ثابتة بحيث يتم عجلت الكريات الخلية إلى جانب الأنبوب. وضع علامة على جانب الغطاء ورسم دائرة على جانب الأنبوب حيث من المتوقع بيليه.
  4. تراكبات التصفية التي تم جمعها من الخطوة 3.3 مع مرشح 0.22 ميكرومتر(جدول المواد).
  5. نقل 15 مل من وسائل الإعلام إلى كل 10 كيلو ادا وحدة تصفية الطرد المركزي(جدول المواد).
  6. أجهزة الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 30 دقيقة لعزل وسائط الإكسوسومات المركزة.
  7. نقل الاكسوسات المركزة إلى أنبوب الطرد الفائق. ثم، اكسوزومات بيليه في 100،000 س ز لمدة 80 دقيقة في 4 °C.
  8. تجاهل عظمى وإعادة تعليق exosomes بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 100،000 س ز لمدة 80 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع الكريه exosomes.
  10. إعادة تعليق بيليه اكسوزومات في 200 μL من برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.

4- توصيف الكوسومات المشتقة من الـ CB-SC

  1. تحديد كمية تركيز البروتين الكلي لإعداد الإكسوسوم بواسطة مجموعة طقم حمض ثنائي شونونيك (BCA)
    1. Pipette 10 μL من كل عينة من الزفير القياسية والمعزولة على شكل ايزوسومات معدة في الخطوة 3.10 في لوحة 96-well في مكررة.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الكاشف العامل من مجموعة BCA إلى كل بئر. مزيج محتويات لوحة بدقة على لوحة شاكر لمدة 10 s.
      ملاحظة: كاشف العمل (WR): 50 جزء كاشف A مع 1-جزء كاشف B.
    3. تغطية لوحات مع احباط واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. تبريد لوحات إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. قياس امتصاص العينة في 562 نانومتر عن طريق قارئ لوحة.
  2. إعداد وتلطيخ من إضحاوس لتدفق عملية استئصال
    1. التقاط اكسوزومات بإضافة 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضادة للإنسان CD63 (حجم 4.5 ميكرومتر)(جدول المواد)إلى 25 ميكروغرام من الإكسوسومات المشتقة من CB-SC المعدة في الخطوة 3.10 في إجمالي 100 ميكرولتر حجم برنامج تلفزيوني.
    2. احتضان أنبوب بين عشية وضحاها (18\u201222 ساعة) في 4 درجة مئوية على شاكر في 800 دورة في الدقيقة.
    3. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 س ز لمدة 30 s لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    4. إضافة 300 μL من العزل العازلة (0.1٪ البوم الدم البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني) ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب.
      ملاحظة: هذه الخطوة يغسل exosomes ربط حبة.
    5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيس لمدة 1 دقيقة (جدول المواد) وتجاهل المابير.
    6. كرر الخطوات 4.2.4\u20124.2.5.
    7. إعادة تعليق exosomes حبة ملزمة مع 400 ميكرولتر من العازلة العزل.
    8. Aliquot 100 ميكرولتر من الاكسوسات المربوطة بالخرز لكل أنبوب.
    9. إضافة الأجسام المضادة المترافقة مع الفلور (CD9-FITC، CD81-PE، و CD63-FITC في 25 ميكروغرام/مل، على التوالي) إلى كل أنبوب تدفق مع اكسوزومات CD63 التي تم التقاطها بالخرز.
      ملاحظة: يعمل IgGs المطابق Isotype كـ عناصر تحكم سالبة.
    10. احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية خفيفة على شاكر في 800 دورة في الدقيقة.
    11. كرر الخطوات 4.2.4\u20124.2.5.
    12. إعادة تعليق exosomes حبة ملزمة في 200 ميكرولتر من العزلة العازلة ونقلها إلى أنابيب تدفق 5 مل.
    13. ضع الأنابيب في عينة الدوارة من تدفق سايتوميتر.
    14. افتح البروتوكول لاختبار الاكسوسوم.
    15. تشغيل العينة تلقائيا بواسطة تدفق مقياس المقاييس.
  3. اكتشاف الكوسوم بواسطة لطخة غربية
    ملاحظة: لطخة الغربية هي طريقة راسخة ونحن لن ندخل في تفاصيل الأسلوب نفسه.
    1. lyse الكريات من اكسوزومات CB-SC المستمدة من الخطوة 3.10 مع 100 ميكرولتر من العازلة RIPA، ماص 20x، ثم وضع على الجليد لمدة 5 دقائق.
    2. كمي تركيز البروتين من ميزات الاكسوس بواسطة مجموعة BCA وتحميل 25 ميكروغرام من البروتين في البئر.
    3. فصل البروتينات بواسطة جل الكهرباء لمدة 40 دقيقة في 150 V.
    4. نقل البروتين إلى بولي فينيليدين فلوريد (PVDF) غشاء باستخدام طريقة نقل شبه الجافة11.
    5. سد الغشاء مع 5٪ الحليب غير الدهني لمدة 30 دقيقة.
    6. احتضان مع 2 ميكروغرام / مل المضادة للإنسان Alix (جدول المواد) و 1 ميكروغرام / مل المضادة للأجسام المضادة كالنشين البشرية (جدول المواد).
    7. الكشف عن البروتين عن طريق chemiluminescence مع نظام التصوير الرقمي.
  4. التحقق من صحة الكوسوم من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS)
    1. تمييع 10 ميكروغرام من عينات الإكسوسوم المشتقة من CB-SC في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. نقل 1 مل من العينة المخففة إلى cuvette شبه الصغر المتاح(جدول المواد).
    3. ضع الـ cuvette في أداة DLS. تعيين معامل الانكسار (RI) كـ 1.39 لكافة شاشة العينة.
    4. تشغيل العينات في 25 درجة مئوية والحصول على ثلاثة قياسات لكل كسر للحصول على متوسط حجم التوزيع.
  5. التحقق من صحة إكسوسومات عن طريق المجهر الإلكترون انتقال (TEM)
    1. معطف formvar على 300 شبكة شبكات النحاس12 (جدول المواد).
    2. تعزيز formvar مع طبقة إضافية من الكربون المتبخر على شبكات النحاس12.
      ملاحظة: مثل هذا النهج طلاء ممتازة لدعم العينة.
    3. تحميل 10 ميكرولتر من عينات إكسوسوسوم على الشبكات وترك للهواء الجاف.
    4. عينات البقعة السلبية مع خلات أورانيل لمدة 5 دقائق.
    5. غسل ثلاث مرات مع DI الماء وتترك لتجف الهواء.
    6. مراقبة وتصوير العينات تحت TEM. تعيين الجهد المتسارع في 200 كيلو فولت وحجم بقعة في 2.

5. التدبير ديو المسمى CB - SC المستمدة من الاكوسوم التي اتخذتها مختلف المنشآت الفرعية من PBMC

  1. تسمية CB-SC المستمدة من الاكسوس مع صبغة ديو الدهنية الفلورية الخضراء
    1. نقل 100 ميكروغرام من إكسوزومات استخراجية من نوع CB-SC (أعدت في الخطوة 3.10) إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
    2. تمييع العينة مع برنامج تلفزيوني إلى 5 مل.
    3. إضافة صبغة فلوروفية ديو فلورسنت ديو(جدول المواد)حتى يصل تركيز العمل إلى 5 ميكرومتر.
    4. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
    5. نقل العينة إلى أنبوب فائق الوضوح.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 100،000 س ز لمدة 80 دقيقة إلى بيليه ديو المسمى CB-SC المستمدة exosomes.
    7. إعادة تعليق الاكسوس المسمى في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد PBMC الإنسان
    1. نقل 25 مل من معطف بافي الإنسان(جدول المواد)أكثر من 20 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار (γ = 1.077) في أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.11.
    3. نقل 1 × 106 PBMC إلى لوحة 24-well المُهَم المعالجة غير المعالجة بالأنسجة (1 مل/بئر).
      ملاحظة: تم استخدام لوحة غير معالجة للأنسجة لتجنب التمسك بوحددات.
  3. شارك في الثقافة ديو المسمى exosomes مع PBMC
    1. نقل 40 ميكرولتر ديو المسمى CB-SC- exosomes المستمدة أعدت في الخطوة 5.1.7 إلى كل PBMC-تحتوي على جيدا في لوحة 24-جيدا باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. إضافة نفس حجم برنامج تلفزيوني للسيطرة على الآبار.
    2. مزيج بواسطة pipetting 10x. احتضان لمدة 4 ساعات.
    3. جمع 200 ميكرولتر- المعالجة PBMC وتسمية مع Hoechst 33342 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل افرا و إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    5. خلايا جبل على شرائح المجهر.
    6. مراقبة وتصوير التفاعل بين ديو المسمى CB-SC-المشتقة من الاكسوس مع هويشت 33342-المسمى PBMC باستخدام المجهر.
    7. نقل الخلايا المتبقية من الخطوة 5.3.3 إلى أنبوب 1.5 مل.
    8. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل افرا وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    9. أضف 5 ميكرولتر من مانع Fc لكل عينة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    10. إضافة الأجسام المضادة (CD3، CD4، CD8، CD11c، CD14، CD19، وD56 في 25 ميكروغرام / مل)(جدول المواد) لطخةPBMC.
      ملاحظة: يعمل IgGs المطابق Isotype كـ عناصر تحكم سالبة.
    11. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية خفيفة.
    12. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 300 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية ل بيليه الخلايا.
    13. إعادة تعليق الخلايا مع 200 μL PBS. إضافة 5 ميكرولتر من يوديد بروبديسيوم.
    14. استخدام تدفق cytometry لتقييم مستوى امتصاص اكسوسوسوم المسمى ديو في السكان الفرعية المختلفة من PBMC.

6. دراسة عمل اكسوزومات مشتقة من CB-SC على أحاديات

  1. العزلة الإنسان CD14-monocytes إيجابية
    1. نقل 3 × 107 PBMC الإنسان في أنبوب 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. ضع عمود الفصل (جدول المواد) في فاصل المغناطيس (جدول المواد).
    4. غسل أعمدة الفصل ثلاث مرات مع 2 مل من الباردة تشغيل العازلة(جدول المواد).
    5. إعادة تعليق الخلايا في 300 μL من برنامج تلفزيوني الباردة. أضف 60 ميكرولتر من ميكروبات CD14. تخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    6. إضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. إعادة تعليق الخلايا في بيليه 500 μL من الباردة تشغيل العازلة.
    8. نقل الخلايا إلى عمود الفصل (المعدة في الخطوة 6.14) والسماح لهم بالمرور.
    9. اغسل عمود الفصل ثلاث مرات مع 2 مل من المخزن المؤقت في الغسيل. ارفع العمود من فاصل المغناطيس وضعه في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
      ملاحظة: يجب وضع أنبوب 15 مل على الجليد بسبب الالتزام بـ CD14-positive monocytes إلى الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
    10. نقل 2 مل من الباردة تشغيل العازلة إلى أعلى العمود وعزل الخلايا CD14 إيجابية في أنبوب 15 مل.
    11. جهاز طرد مركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية إلى بيليه الخلايا إيجابية CD14.
    12. إعادة تعليق الخلايا مع 2 مل من مادة كيميائية الباردة المعرفة مصل الحرة المتوسطة(جدول المواد).
    13. نقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل.
    14. وصمة عار مع 10 ميكرولتر من كروم أورانج مترافق المضادة للدم البشري CD14 مل ب (جدول المواد) لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يعمل IgGs المطابق Isotype كـ عناصر تحكم سالبة.
    15. إضافة 1 مل PBS إلى الخلايا. جهاز طرد مركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة إلى خلايا بيليه.
    16. إعادة تعليق الخلايا في 200 μL من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب 5 مل. تحديد نقاء الخلايا أحادية CD14 إيجابية عن طريق تدفق الخلايا.
  2. علاج أحاديات مع اكسوزوس مشتقة من CB-SC
    1. البذور 1 × 106 monocytes المنقاة مع الكيميائية المعرفة مصل خالية من المتوسط ثقافة(جدول المواد)في الأنسجة ثقافة المعالجة 6-جيدا لوحة (2 مل / جيدا).
    2. احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    3. تجاهل المصات الفائق مع 1 مل ماصة. إضافة 2 مل من 37 درجة مئوية قبل تسخين الكيميائية المحددة الكيميائية مصل خالية من المتوسط(جدول المواد)بلطف.
      ملاحظة: تم الالتزام monocytes إلى لوحة داخل 2 ساعة. تم تحديد الخلايا العائمة على أنها تلوثات ميتة أو غيرها من الخلايا.
    4. أضف 80 ميكروغرام من الاكسوس المشتق من CB-SC المعزولة من الخطوة 3.10 إلى الثقافات أحادية في لوحة 6-جيدا مع حجم إجمالي قدره 2 مل.
      ملاحظة: تمت إضافة نفس حجم برنامج تلفزيوني للتحكم في الآبار.
    5. احتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 3\u20124 أيام.
    6. تصوير مورفولوجيا الخلية باستخدام مجهر مقلوب في 200× التكبير (جدول المواد).
    7. فصل الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في 1 مل من خلية الفصل على أساس برنامج تلفزيوني العازلة مع 1 مل ماص تلميح.
    8. حصاد الخلايا المرفقة المتبقية عن طريق مكشطة الخلية.
      ملاحظة: منذ أحاديات أساسية أو الضامة متباينة إرفاق بإحكام، تبقى بعض الخلايا الالتزام إلى أسفل بعد العلاج مع العازلة الانفصام. لذلك، يتم حصاد هذه الخلايا مع مكشطة الخلية.
    9. جمع الخلايا في 1،690 س ز لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 200 μL من برنامج تلفزيوني.
    10. أضف 5 ميكرولتر من مانع Fc (25 ميكروغرام/مل) لمنع الربط غير المحدد.
    11. إضافة الأجسام المضادة (CD14، CD80، CD86، CD163، CD206، وD209 في 25 ميكروغرام / مل، جدول المواد)إلى الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: IgGs متطابقة مع الأيزوتايب بمثابة التحكم السالب
    12. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل افرا وإعادة تعليق مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    13. إضافة 5 ميكرولتر من يوديد بروبدييوم لكل عينة (200 ميكرولتر) ونقل الخلايا إلى أنبوب تدفق جديد 5 مل.
    14. تنفيذ عملية استئصال التدفق وتقييم مستويات التعبيرات CD14 و CD80 و CD86 و CD163 و CD206 و CD209.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البداية، تم فحص النمط الظاهري ونقاء CB-SC بواسطة قياس التدفق الخلوي مع علامات CB-SC المرتبطة مثل مستضد الكريات البيض المشترك CD45، وعوامل النسخ الخاصة بالخلايا ES OCT3/4، وSOCX2. CB-SC عرض مستويات عالية من CD45، OCT3/4، SOX2، CD270، و 9 galectin التعبير، ولكن لا تعبير عن CD34 (الشكل 1A). وأكد تحليل تدفق قياس الثغرات التعبير عن علامات اكسوسومات محددة بما في ذلك CD9، CD81، وD63 كانت على اكسوزومات CB-SC المشتقة (الشكل 1B). وتتميز مورفولوجيا وحجم توزيع الاكوسوم م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطبيق الإكسوسوم هو مجال ناشئ للتشخيص السريري، والتطورات الدوائية والطب التجديدي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل بشأن إعداد اكسوزومات مشتقة من مادة CB-SC والدراسة الوظيفية للاكسوسومات على التمييز بين أحاديات الإنسان. أظهر البروتوكول الحالي أن الإكسوسومات الوظيفية المشتقة من SC يتم عزلها بالطرد المركزي المتتابع والطرد فوق المركز مع نقاء عالي وعرض التشكيل المناعي على الخلايا الأحادية.

بالمقارنة مع البروتوكولات التقليدية الأخرى، فإن الترشيح الفائق هو نهج راسخ لعزل وتنقية الإكسوسات من خلايا أو وسائط مختلف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور تشاو هو مؤسس Tianhe الخلايا الجذعية للتكنولوجيا الحيوية هي شركة الدكتور جاو مخترع التكنولوجيا Cell Cell. ولا يملك جميع المؤلفين الآخرين أي مصالح مالية قد تكون ذات صلة بالعمل المقدم.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للسيد بوددار والسيد لودفيغ على الدعم السخي للتمويل من خلال مؤسسة هاكينساك UMC. ونحن نقدر لورا تشاو لتحرير اللغة الإنجليزية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق فيشر ساينتفيك05-408-129
15 مل أنبوب مخروطيفالكون352196
لوح 24 بئرفالكون351147ثقافة غير الأنسجة
لوحة
3،3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio)Millipore sigmaD4292-20MGتخزين في 4 درجات ؛ C
300 شبكةتيد بيلا1GC300
50 مل أنبوب مخروطيفالكون352070
لوحة 6 آبارFalcon353046لوحة زراعة
الأنسجة 96 بئر لوحةFalcon353072لوحة زراعة
الأنسجة ACK Lysis BufferLonza10-548E100 مل
Amicon-15 10kDa وحدة فلتر الطرد المركزيمتجر Millipore sigmaUFC901024
Biolegendالمضاد للإنسان634501 في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2268110
Calnexin Biolegend 699401 المضاد للإنسانفي 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2728519
الأجسام المضادة للإنسان CD11c ، 561356 تخزين Pe-Cy7BD Bioscienceفي 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_10611859
الأجسام المضادة للإنسان CD14 ، متجر Karma OrangeBeckman CoulterB36294عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2728099
الأجسام المضادة CD163 المضادة للإنسان ،BD Bioscience556018مخزن في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_396296
الأجسام المضادة CD19 المضادة للإنسان ، PC5Beckman CoulterIM2643Uالمتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_131160
الأجسام المضادة للإنسان CD206 ، متجر FITCBD Bioscience551135في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_394065
الجسم المضاد CD209 المضاد للإنسان ، متجر 564127 Brilliant Violet 421BD Bioscienceفي 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2738610
الأجسام المضادة للإنسان CD270 ،Biolegend318806المتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2203703
الأجسام المضادة CD3 المضادة للإنسان ، Pacfic BlueBiolegend300431المتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_1595437
الأجسام المضادة CD34 المضادة للإنسان ، متجر IM2427U APCBeckman Coulterفي 4 درجات ؛ C ، RRID: N /
A الجسم المضاد CD4 المضاد للإنسان ، متجر 555349 APCBD Bioscienceعند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_398593
الأجسام المضادة CD45 المضادة للإنسان ، متجر IM3548U Pe-Cy7Beckman Coulterفي 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_1575969
الأجسام المضادة CD56 المضادة للإنسان ، PEBeckman CoulterIM2073Uالمتجر في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_131195
الأجسام المضادة CD63 المضادة للإنسان ،BD Bioscience561925مخزن في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_10896821
الأجسام المضادة CD8 المضادة للإنسان ، متجر APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686في 4 درجات ؛ C ، RRID: N /
A جسم مضاد CD80 مضاد للإنسان ، متجر APCBeckman CoulterB30642في 4 درجات ؛ C ، RRID: N /
A الأجسام المضادة CD81 المضادة للإنسان ، متجر FITCBD Bioscience561956في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_394049
الجسم المضاد CD86 المضاد للإنسان ، متجر APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646عند 4 درجات ؛ C ، RRID: N /
A الجسم المضاد CD9 المضاد للإنسان ،FITC ThermoScienticMA5-16860في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2538339
الجسم المضاد للإنسان Galectin 9 ، متجر Brilliant Violet 421Biolegend348919عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2716134
جسم مضاد OCT3 / 4 مضاد للإنسان ، eFluor660ThermoScientic50-5841-82مخزن عند 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_11218882
الجسم المضاد SOX2 المضاد للإنسان ، متجر Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82في 4 درجات ؛ C ، RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
Serum AlbuminMillipore SigmaA1933
Buffy coatYork Blood Center40-60 مل / وحدة
مكشطة خليةFalcon353085
يمكن التخلص منها شبهكوفيت VWR97000590
عازلة التفككGibco131510014100 مل
شرائح عد الخلايا المزدوجة ChanberBio-Rad1450015
Exosome-Human CD63 كاشفالكشف عن ThermoFisher Scientific10606Dمخزن في 4 درجات ؛ C
Ficoll-Paque PLUS كثافة الوسائط الكبرىGE Health17-1440-03500 مل
دوار بزاوية ثابتة (25 درجة ؛)Thermo Scientifc75003698Maxium 24,700 × g
Gallios Flow CellularBeckman Coulter3 lasers
10 Color Max
Human Cordifc BloodCryo-Cell International40-100 مل / وحدة
Human Fc BlockBD Bioscience564220مخزن في 4 درجات ؛ C
Immun-Blot PVDF غشاءBio-Rad1620177
Millex-GP وحدة تصفية حقنة ، 0.22 & micro ؛ مميليبور سيجماSLGP033RS
أوبتيما XE-90 Ultracentrigugeبيكمان كولتر
أوربيتال شاكر MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 مل
بروبيديوم يوديدBD Bioscience56-66211Eمخزن في 4 درجات ؛ C
نيكون Eclipse Ti2 المجهرنيكون إنسترومنتس إنكEclipse Ti2NIS-Elements إصدار البرنامج 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 مل
Revert microsopyفيشر12563518
الدوار 41 Tiبيكمان كولتر331362ماكسيوم 41,000 دورة في الدقيقة
Sorvall St 16R الطرد المركزيالحراري Scientifc75004381
يتأرجح دلو الدوارالحرارية Scientifc75003655
TC-20 عداد الخلاياBio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle حاضنة CO2ThermoFisher Scientific
المجهر الإلكترونيJEOLJEM-2100 PLUS
أنبوب الطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر331372
X'VIVO 15 متوسط خال من السيروملونزاBEBP04-744Q1000 مل وسط استزراع ، يخزن في 4 درجات ؛ ج
شبكات Alix متجر PE PE PE متجر Cowvine New ميكرو العلمي Transmission

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160(2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87(2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763(2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD14 M2

مقالات ذات صلة