مقالة منهجية

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

DOI:

10.3791/61563

⸱

يناير 13, 2021

 , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو بروتوكول فائقة الدقة التصوير بالخلايا الحية في الأنسجة سليمة. لقد قمنا بتوحيد شروط تصوير مجموعة الخلايا الجذعية البالغة الحساسة للغاية في بيئة الأنسجة الأصلية. وتنطوي هذه التقنية على تحقيق التوازن بين الاستبانة الزمنية والمكانية للسماح بالملاحظة المباشرة للظواهر البيولوجية في الأنسجة الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت هناك منذ فترة طويلة مقايضة حاسمة بين الدقة المكانية والزمنية في التصوير. وقد تم تقليديا التصوير خارج الحد الحيود للضوء يقتصر على استخدامها فقط على عينات ثابتة أو الخلايا الحية خارج الأنسجة المسماة مع إشارة الفلورسنت قوية. تتطلب تقنيات تصوير الخلايا الحية فائقة الدقة الحالية استخدام مسابير مضان خاصة ، أو إضاءة عالية ، أو اكتساب صور متعددة مع معالجة ما بعد الاستحواذ ، أو في كثير من الأحيان مزيج من هذه العمليات. وتحد هذه الشروط المسبقة بشكل كبير من العينات والسياقات البيولوجية التي يمكن تطبيق هذه التقنية عليها.

هنا نحن نصف طريقة لأداء فائقة الدقة (~ 140 نانومتر XY القرار) الوقت الفاصل الزمني التصوير الخلايا الحية في الموقع. هذه التقنية متوافقة أيضا مع كثافة الفلورسنت المنخفضة ، على سبيل المثال ، EGFP أو mCherry الموسومة داخليا في الجينات المعبر عنها بشكل منخفض. كدليل على المبدأ ، استخدمنا هذه الطريقة لتصور هياكل فرعية متعددة في اختبار Drosophila. أثناء إعداد الأنسجة ، يتم الحفاظ على كل من البنية الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة داخل الخصية المشرحة. هنا ، نستخدم هذه التقنية لتصوير ديناميات microtubule ، والتفاعلات بين microtubules والغشاء النووي ، فضلا عن ارتباط microtubules إلى centromeres.

تتطلب هذه التقنية إجراءات خاصة في إعداد العينات وتركيب العينات وشل حركة العينات. بالإضافة إلى ذلك، يجب الحفاظ على العينات لعدة ساعات بعد تشريح دون المساس وظيفة الخلوية والنشاط. في حين أننا قمنا بتحسين ظروف التصوير الحي فائق الدقة على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila (GSCs) والخلايا الجرثومية السلف في أنسجة الخصية تشريح، وهذه التقنية تنطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة. إن القدرة على مراقبة الخلايا في ظل ظروفها الفسيولوجية دون التضحية بالدقة المكانية أو الزمنية ستكون بمثابة أداة لا تقدر بثمن للباحثين الذين يسعون إلى معالجة الأسئلة الحاسمة في بيولوجيا الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور الهياكل دون الخلوية وديناميات البروتين في الخلايا الحية مع القرار وراء حد الحيود للضوء وعادة ما يكون تحديا كبيرا1-3. في حين تم تطوير تقنيات متعددة فائقة الدقة مثل الاستشحات البصري - إعادة الإعمار - المجهر (STORM) ، والتنظير الضوئي المنشط - التعريب الدقيق (PALM) وحفز الانبعاثات - الاستنفاد (STED)4،5،6 المجهر ، والمضاعفات في إعداد العينات ، فضلا عن الحاجة إلى الحفاظ على الجدوى والنشاط في الجسم الحي ، والحد من استخدام المجهر فائقة الدقة التقليدية لتصوير العينات الحية. لا يمكن أن يصل المجهر البؤري التقليدي إلى الدقة المكانية بعد دقة XY ~ 23....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد كوكتيل تصوير الخلايا الحية (وسائط الخلية الحية)

  1. ملحق شنايدر Drosophila المتوسطة مع 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 0.6x البنسلين / العقدية. ضبط درجة الحموضة إلى حوالي 7.0.
  2. قبل استخدام الوسيطة مباشرة، أضف الأنسولين إلى تركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام/مل.
    ملاحظة: هذه الوسائط أمر بالغ الأهمية للحفاظ على انقسام الخلايا الطبيعية وتطوير الخصية Drosophila أثناء التصوير الفاصل الزمني10،14.

2. إعداد طبق زجاج زراعة الخلايا السفلية

  1. استخدم طبق زراعة الخلايا الزجاجية المغلفة بالزجاج من L-lysine بقطر 35 مم لاختبار Drosophila.....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر تصوير الخلايا الحية خارج حدود الحيود في أنسجة دروسوفيلا، وخاصة بالنسبة ل GSCs، فرصة للتحقيق في ديناميكيات الأحداث دون الخلوية في سياق تطور دورة الخلية. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة تستخدم هذا البروتوكول أن أنشطة microtubule في مركز الأم مقابل سنتروسوم الابنة غير متماثلة زمنيا في GSCs10. تنبعث النيتروسوم الأم من البيبات الدقيقة قبل حوالي 4 ساعات من دخول الميتوتيك ، في حين أن القنطور الصغير لا ينبثق إلا من الميكروبات في بداية الانقسام. تتفاعل البيبوليتولات النشطة للغاية من المركز ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر طرق الفحص المجهري فائقة الدقة دقة مكانية عالية يصل إلى 10s من نانومتر4،5،6. تسمح طرق الفحص المجهري STORM و PALM بدقة تصل إلى 20 إلى 50 نانومتر (دقة XY)، في حين يوفر المجهر STED دقة تتراوح بين 20 و100 نانومتر (دقة XY). الدقة المكانية للميكروسكوبي SIM يقتصر على 100 إلى 130 نانومتر15. ومع ذلك ، نظرا لكثافة الفوتون العالية ووقت الاستحواذ الطويل ، فمن الصعب للغاية استخدام هذه التقنيات لتصوير الخلايا الحية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا مرفق التصوير المتكامل الأساسي في جامعة جونز هوبكنز على المجاهر وبرامج تحليل البيانات. نشكر ج. سنيدكر وس. إ. يو على التدقيق اللغوي والاقتراحات، وأعضاء المختبر .C العاشر على المناقشات والاقتراحات المفيدة. بدعم من NIGMS / NIH R35GM127075 ، ومعهد هوارد هيوز الطبي ، ومؤسسة ديفيد ولوسيل باكارد ، وصناديق الشركات الناشئة في جامعة جونز هوبكنز (X.C).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Adobe Illustrator CS6 (برنامج صنع الشكل)AdobeN / A
غشاء غسيل الكلىSpectra / Por 1-4 غشاء غسيل الكلى القياسي RCCat رقم 08-67121
FBSThermo Fisher ScientificCat. رقم 2614007915٪ (V / V)
فيجي (برنامج تحليل)المعاهد الوطنية للصحةغير / أالقياس
الكمي لشدة مضان الصورةأطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي (FluroDish)World Precision Instrument، Inc.FD35PDL-100
Imaris (برنامج إعادة بناء الصور) BitplaneN / Aإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد
زيت ImerssionZeissImmersol 518F / 30 & deg ؛ سي
الأنسولينسيجماالقط. رقم 15550200 & ميكرو ؛ جم / مل
Penicillin / StreptomycinInvitrogenCat No. - 15140-1220.6x
Schneider ذبابة الفاكهة وسائطInvitrogenCat No. - 11720-034
المجهر متحد البؤر للقرص الدوارZeissN / Aمزود بكاميرا متطورة (القياسات الضوئية) ، باستخدام هدف 63x Zeiss (1.4 NA).
المناديل الورقيةKimwipe N/ Aمبلل لتشكيل مجهر متحد البؤر LSM
800 للغرفة الرطبة مع وحدة AiryScan فائقة الدقةZeissN / Aمجهزة بكاشفات GaAsP (فوسفيد زرنيخيد الغاليوم) عالية الحساسية باستخدام هدف 63x Zeiss (1.4 NA)
ZEN (برنامج تصوير) ZeissN / A

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312(2020).
  2. Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymolo....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Airyscan

مقالات ذات صلة