نموذج حلقة الدم في المختبرية للتحقيق في التوافق الهيموسيتوفية وتنشيط الخلية المضيفة للأجهزة الطبية الوعائية

اختبار الهيموابل للأجهزة الطبية هو خطوة حاسمة في تطوير أجهزة جديدة مثل الدعامات الوعائية أو أنابيب النزف لاوكسيجين الغشاء خارجcorporeal. حتى اليوم، تعتبر النماذج الحيوانية كأدوات قياسية لإنهاء إجراءات اختبار الأجهزة الطبية قبل تنفيذها في البشر. ومن الآن فصاعدا، من الضروري إيجاد نماذج بديلة في المختبر تساعد بقدر أكبر في التقليل من التحقيقات المتعلقة بالحيوانات. في هذه الدراسة، ونحن، لذلك، قد استكشفت مصغرة في المختبرية نموذج حلقة الدموية. والهدف من هذه الطريقة المعروضة هو اختبار توافق الدم في المختبر من الأجهزة الطبية وفقا لمعيار ISO 10993-4.

ISO 10993-4 القياسية يصف مجموعات موحدة من المعلمات السريرية التي سيتم التحقيق فيها على عينة الدم¹. باختصار، هذه هي تجلط الدم (تجميع الصفائح الدموية وعدد)، والتخثر (الفيبرينوبيبتايد A، FPA)، وتحليل الدم (عدد خلايا الدم الكاملة)، مؤشر الانحلال (الهيموجلوبين البلازما الحرة) ونظام مكمل (محطة تكملة مجمع، sC5b9). ومع ذلك ، يمكن أيضًا حساب علامات إضافية ، مثل العدلات المتعددة الأشكال من elastase (PMN) ، interleukin 6 (IL-6) وعامل نخر الورم - ألفا (TNF) التي تعكس حالة تفعيل الكريات البيض . لتحديد وقياس البروتينات الخالية من الخلايا المتداولة الموجودة في بلازما الدم، ساندويتش enzymatic ربط المناعة المقايسة (ELISA) يمثل طريقة تقليدية وموثوق بها أكثر^2،3. وبالمثل، يمكن تحديد نوع ظاهري وحالة التنشيط للخلايا المضيفة (مثل الكريات البيض) عن طريق الكشف عن تعبير سطح الخلية من الجزيئات عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة (FACS) التي توفر قراءات أحادية قائمة على التعليق الخلوي، حيث ترتبط الأجسام المضادة المحددة المسماة بالفلورسنت بجزيئات سطح الخلايا المستهدفة^4. كما يوصى بمسح المجهر الإلكتروني (SEM) لتحديد تكوين الخثرة على المواد المختبرة بواسطة معيار ISO 10993-4^1. يمكن أن تكمل هذه الطريقة مع الأشعة السينية microtomography (μCT)، لإجراء تحليل هيكلي لثرومبوس على سبيل المثال، سمكها، وحجمها وتوطينها في صورة 3D المقدمة⁵.

الأساس المنطقي وراء استخدام هذا النموذج في المختبر هو فحص أفضل أداء والأجهزة الطبية المتوافقة من خلال فهم الديناميات الفسيولوجية الأساسية لمكونات الدم مثل الصفائح الدموية، التي تشارك في الهيماسيس الأولية أو الكريات البيض وتفاعلها مع أنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية. هذه النظم في المختبر هي المطلوبة للغاية لأنها تقلل من الحاجة إلى الدراسات الحيوانية.

نموذج حلقة المقدمة هنا يفي هذه المطالب. وقد وصفت لأول مرة هذا النموذج من قبل A.B. تشاندلر في عام 1958 لإنتاج الدم thrombi و, ولذلك, كما دعا تشاندلر حلقة نموذج⁶. حتى الآن، وقد استخدم هذا النموذج في سلسلة من التجارب والتعديلات للتحقيق في التوافق الحيوي للدم من الأجهزة الطبية^{7،8،9،10،11،12،13،14}. وهو يتألف من أنابيب البوليمر، والتي تمتلئ جزئيا مع الدم وشكلت في حلقات إعادة انسداد. تدور هذه الحلقات في حمام مائي يتم التحكم فيه بدرجة حرارة لمحاكاة ظروف تدفق الأوعية الدموية مع تأثيراته النزفية. وقد وصفت بالفعل أساليب بديلة مثل نماذج مضخة مدفوعة أو النماذج التي تستخدم صمامات الكرة الميكانيكية داخل الحلقات للحث على تدفق الدم داخل أنابيب البوليمر^15,16. ومع ذلك ، فإن الميزة العامة للطريقة المعروضة هنا هي أن القوة الميكانيكية المطبقة على خلايا الدم والبروتينات منخفضة ، وتجنب الانحلال ، وليس هناك اتصال بين الدم والموصلات ، التي يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات التدفق وتنشيط مكونات الدم. العوامل الرئيسية في الحلقة هي مواد الاختبار نفسها والهواء الذي يقع داخله. وهذا يساعد على تقليل مصادر الخطأ في القياس وتقديم قابلية عالية للتكرار، حتى لو كان يمكن أن تؤدي واجهة الدم والهواء إلى¹⁷من التكاثات البروتينية . ومن الممكن أيضا للتحقيق في أصناف من مواد الأنابيب وأقطار الدعامة دون قيود على الطول أو الحجم مما يسمح باستخدام أنابيب مختلفة الطول وقطرها الداخلي. وعلاوة على ذلك، مضيف hemocompatibilities على إغلاق حلقة غير دقيقة والتعرض لسطح أنبوب غير المصقول هي أيضا من الممكن التحقيق. تطبيقات طبية أخرى مماثلة من هذا في المختبر في شكل حلقة الدم هو أنه يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة التفاعلات بين العلاج المناعي (المخدرات) ومكونات الدم خلال التنمية قبل السريرية أو فحص سلامة الدواء الفردية قبل أول في الرجل المرحلة الأولى من التجربة السريرية الأولى، أو لتوليد المواد الخثرة التي يمكن استخدامها في مزيد من التجارب^18،19،20.

تصف هذه الدراسة بروتوكول مفصل لاختبار الهيموكوكومباتيبيليتات أنابيب الضخ و / أو الدعامات. هنا، المقارنة بين أنابيب PVC غير المصقول والمغلف (hepPVC: طلاء الهيبارين، بولي بي في سي: طلاء مع بوليمر نشط بيولوجيا). تم العثور على تنشيط خفض الصفائح الدموية، ولكن تم العثور على تنشيط أعلى من نظام التخثر (FPA) لكلا الأنابيب المغلفة بالمقارنة مع أنابيب غير المصقول. يتم تعديل أنابيب hepPVC المستخدمة هنا مع الهيبارين ملزمة بشكل متكن لجعلها thromboresistant²¹ وقد تم بالفعل توظيفها في نموذج حلقة لتحسين وتوصيف معلمات مختلفة²². أنابيب بوليبVC المستخدمة في هذه الدراسة هي أنابيب متاحة تجاريا تستخدم في الإعدادات السريرية من سفك الدم خارجcorporeal ومغلفة مع البوليمر الهيبارين للحد من الجلطات²³. في بعض الأحيان، في التطبيقات السريرية حتى تستخدم أنابيب PVC غير المصقول. ولذلك، قمنا بتضمين أنابيب اللاتكس كمجموعة تحكم إيجابية أظهرت التنشيط المفرط للصفائح الدموية، ونظام التخثر، وعوامل قابلة للذوبان مثل IL-6، TNF وPMN elastase. وقد لوحظ تشكيل خثرة عندما تم محاكاة إغلاق حلقة غير دقيقة. أدى هذا إلى تنشيط التخثر ونظام مكمل وكذلك الكريات البيض والصفائح الدموية مقارنة مع الظروف الأساسية. وعلاوة على ذلك، فإن ملامسة الدم للمادة الدعامة المستخدمة هنا (دعامة نيتينول المعدنية العارية، المغطاة ببروتين ثيرافلورو إيثيلين الموسع المشبع بالكربون) أدت إلى زيادة تنشيط الصفائح الدموية والكريات البيض من حيث PMN elastase. وعموما، لم النموذج المقدمة الحث على الانحلال في أي من أجهزة الأوعية الدموية اختبارها كما كانت مماثلة لخط الأساس أو الظروف الثابتة، باستثناء أنابيب اللاتكس، حيث خلايا الدم الحمراء (RBC) الانحلال كان واضحا. وعلاوة على ذلك، يمكن فحص هذه الأنابيب التسريب إما عن طريق التصوير أو عن طريق علم الأنسجة. على الرغم من أن التقييمات النسيجية قد تكون مجدية، ركزنا بشكل رئيسي على ELISA و تدفق قياس الاستئصال الخلوي لإجراء هذه التجارب وبالتالي تمكين جدوى إجراء التجارب على أساس النموذج المعروض هنا للعديد من المختبرات. وبالتالي، فإن هذه الطريقة تمثل طريقة مجدية لاختبار التوافق الحيوي للدم من الأجهزة الطبية الوعائية وفقا لتوصيات معيار ISO 10993-4. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة كلما التفاعل بين الدم والمواد ينبغي اختبارها في ظل ظروف التدفق، محاكاة في الظروف الجسمية.

وقد وافقت على هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في مستشفى جامعة ماغديبورغ (الطلب رقم 88/18) وقدمت المواد الموافقة الخطية عن علم قبل إجراء سحب الدم.

1- تحضير مخزون الهيبارين وأخذ عينات من الدم

1. حساب كمية الدم اللازمة للتجارب بأكملها.
   ملاحظة: تقريبا، مطلوب 5 مل من الدم heparinized لكل جهاز الأوعية الدموية في التكرارات (الحلقات). وبالمثل، مطلوب 5 مل من الدم لكل شرط خط الأساس والساكتة التي يتم الاحتفاظ جانبا في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد محلول مخزون الهيبارين بتركيز 100 وحدة دولية/مل من خلال تخفيف الهيبارين غير المفرّق (على سبيل المثال، Rotexmedia) في المياه الأيونية. استخدام 150 μL من هذا الحل للهبرين من الدم الطازج 10 مل.
3. حساب كمية الدم وكذلك البلازما التي هي اللازمة لعدد خلايا الدم كله, ELISA وFACS المقايسة.
   ملاحظة: يتم الحصول على القياسات الممثلة في هذه الدراسة من حلقتين تعملان بالتوازي (واحدة مكررة) بحجم دم إجمالي قدره 10 مل.
4. بناء على الكمية المطلوبة من الدم، ملء 10 مل الحقن مع 150 ميكرولتر من محلول مخزون الهيبارين لمنع تخثر الدم مع تركيز هيبارين النهائي من 1.5 وحدة دولية / مل الدم.
5. رسم الدم باستخدام فراشة (حجم: 21 G). ملء المحاقن بلطف شديد لتجنب الانحلال أو تنشيط الخلية بسبب الفراغ المفرط.
   ملاحظة: يجب الحصول على إذن من اللجنة الأخلاقية المحلية قبل بدء التجارب. الحصول على موافقة مستنيرة من كل متبرع بالدم البشري. تأكد من أن المتبرع بالدم صحي ولا يتناول أي دواء ، خاصةً عدم وجود عوامل مضادة للصفيحات أو أدوية مضادة للالتهابات غير الستيرويدية لمدة 10 أيام على الأقل قبل التجارب. وتجدر الإشارة إلى أن نفس المتبرع يفضل عند مقارنة أنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية لأول مرة كما هو معروض في هذه المخطوطة. ولزيادة تقييم الاختلافات بين الأفراد، يمكن تكرار البروتوكول مع مختلف المانحين.
6. جمع الدم في كوب الزجاج، وتجنب التحريض المفرط.

2. في المختبر الدموية الدموية حلقة الجمعية

1. ملء حمام الماء حتى يصل منسوب المياه إلى مركز وحدة التناوب. تعيين درجة حرارة المياه إلى 37 درجة مئوية.
2. حلقة الجمعية لاختبار مواد أنابيب مختلفة (polyPVC، hepPVC، PVC و اللاتكس)
   1. قطع قطعتين 50 سم طويلة من كل مادة أنبوب (القطر الداخلي 5 مم) مع القاطع أنبوب. تأكد من أن سطح القطع مسطح ، لأن هذا مهم بشكل خاص لاغلاق مثالي لالحلقات ذات القطرات الصغيرة بحيث يتدفق الدم دون أي تشويه على حافة المناسب.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بأكمله الأنابيب التي يبلغ قطرها الداخلي 5 مم.
   2. لتسهيل التعامل مع وتجنب تأخير معالجة ما بعد العينة بعد التدوير، تشغيل فقط أربع حلقات (2 مواد في التكرارات) في موازاة ذلك.
   3. لتوليد شكل حلقة، سد النهايات المفتوحة للأنابيب في قطعة قصيرة من أنبوب السيليكون تركيب القطر الخارجي للأنبوب التحقيق.
   4. استخدام نطاقات التوتر البولي لضمان إغلاق السليم من الحلقات. عند استخدامها لأول مرة، ضبط طول العصابات لتناسب القطر الخارجي لللحلقة عن طريق قطع الفرقة التوتر مع مقص في أطوال المطلوبة وتأمينه مع وجع عزم الدوران 3 مم.
   5. تشديد بعناية المسمار قفل موصل الفرقة التوتر تحت التفتيش من نهايات أنبوب. ضبط قوة الإغلاق بحيث لا توجد فجوة بين نهايات الأنبوب. إذا تم تشديد المسمار قفل تماما والتوتر من الفرقة البولي يبدو منخفضا جدا لسد الفجوة بين نهايات أنبوب، وفتح قفل النظام وقطع عدد قليل مم من الفرقة التوتر. كرر هذا، حتى يتم تحقيق إغلاق حلقة دقيقة(الشكل 1A).
   6. إذا كانت المواد الأنابيب لينة جدا ويميل إلى الانزلاق داخل عصابات التوتر، وإصلاح حلقة مع الشريط الكهربائي إلى الفرقة التوتر(الشكل 1B, C).
   7. إعداد حلقة إضافية من PVC للتحكم في درجة الحرارة مع نفس الأبعاد مثل حلقات الاختبار.
   8. تأمين الحلقات في حلقة مهد وحدة دوران خارج حمام الماء. بعد ذلك، نعلق مهد حلقة إلى وحدة دوران داخل حمام الماء (الشكل 1E).
   9. تفكيك الفرقة التوتر جزئيا من الحلقات وافصل نهاية واحدة من كل أنبوب لفتح الحلقة.
   10. ملء بلطف كل حلقة مع 5 مل من الدم مع ماصة المصلية 5 مل. مزيج الدم بلطف مرتين في كوب الزجاج عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا قبل التحميل في الحلقات.
   11. خذ ميزان الحرارة المتاح وضعه داخل حلقة التحكم في درجة الحرارة. إذا كان ميزان الحرارة كبيرًا جدًا ، فقطعه بمقص ليناسب أنابيب أصغر. ملء حلقة مع 5 مل من المياه ديوند في درجة حرارة الغرفة.
   12. أغلق الحلقات وتأكد من تركيب الحلقات ونطاقات التوتر والحامل بشكل صحيح.
   13. تعيين سرعة دوران إلى 30 جولات في الدقيقة (دورة في الدقيقة) وتدوير ل 3 ساعة.
3. تجميع حلقة لاختبار تأثير إغلاق حلقة غير لائق (الفجوة)
   1. إعداد أربع حلقات (polyPVC) كما هو موضح في 2.2.
   2. إغلاق اثنين من الحلقات بشكل صحيح مع عصابات التوتر وتجنب أي فجوة بين نهايات أنبوب.
   3. بالنسبة للأخرى اثنين من الحلقات سد النهايات المفتوحة في أنبوب أكبر كما هو موضح في 2.2.3، ولكن ترك فجوة من 1-2 ملم بين نهايات الحلقة. لا تستخدم نطاقات التوتر لهذه الحلقات (الشكل 1D).
   4. قم بإعداد حلقة تحكم درجة حرارة واحدة كما هو موضح في 2.2.7 و2.2.11.
   5. ملء جميع الحلقات بالدم كما هو موضح في 2.2.10.
   6. تعيين سرعة دوران إلى 30 دورة في الدقيقة وتدوير ل 3 ساعة.
4. تجميع حلقة لاختبار الدعامات
   1. إعداد أربع حلقات كما هو موضح في 2.2 وما يليها.
      ملاحظة: لتقييم التوافق الحيوي للدم من الدعامات، ينبغي اختبار مادة الأنابيب نفسها لتكون قابلة للتكوابل البيولوجي من أجل منع إخفاء تنشيط الخلية. إذا لم تكن هناك بيانات، يمكن اختبار مادة الأنبوب نفسها كما هو موضح في 2.2. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق النطاق القطر داخل الدعامة (انظر تعليمات الشركة المصنعة) وينبغي أن تناسب القطر الداخلي للمادة أنبوب.
   2. فتح اثنين من الحلقات واتخاذ أنبوب من نظام الفرقة التوتر.
   3. أدخل الدعامة في منتصف الأنبوب حسب تعليمات الشركة المصنعة.
   4. استخدام الحلقات الأخرى اثنين دون الدعامات كتحكم. ملء جميع الحلقات بالدم كما هو موضح في 2.2.10.
   5. ضبط سرعة دوران إلى 30 دورة في الدقيقة وتدوير ل 3 ساعة.
5. التحكم في درجة الحرارة
   1. في أي وقت خلال مدة وعند توقف دوران، ودرجة حرارة الدم داخل الحلقات هو مبين من قبل ميزان الحرارة داخل حلقة التحكم في درجة الحرارة. لقراءة درجة الحرارة، ووقف دوران وقراءة فورا قبالة درجة الحرارة المشار إليها من قبل ميزان الحرارة.

3. معالجة عينة الدم

1. بعد دوران، والسماح للحلقة الوقوف في الرف لمدة 2 دقيقة في وضع تصاعدي للسماح للدم تتراكم في الجزء السفلي من الحلقات، وتجنب أي سفك في حين فتح الحلقات.
2. فحص الدم اليسار لظروف ثابتة: إذا تم تخثر هذا الدم، يشتبه في نهاية المطاف heparinization غير لائق. في هذه الحالة ، كرر التجربة ويفضل أيضا مع متبرع آخر بالدم.
3. تأخذ بعناية الحلقات من الرف. فتح الموصلات والسماح للتدفق الدم في كوب الزجاج 10 مل.
4. تجمع الدم من الأنابيب التي يتم تشغيلها في التكرارات.
5. اسحب دماء جديدة لتحليل خط الأساس من نفس الجهة المانحة كما هو موضح في 1.5 و 1.6.
6. جمع دم سترات الصوديوم
   1. لجمع الدم سيترات الصوديوم، ملء أربعة أنابيب 1.5 مل، كل مع 111 ميكرولتر الصوديوم حل جمعت من أنابيب سيترات الصوديوم، لتوليد تركيز النهائي من 3.2٪ من سترات الصوديوم.
   2. ملء كل أنبوب مع 1 مل من الدم من الكؤوس الزجاجية كما هو موضح في 1.6 و 3.3.
   3. الحفاظ على الدم في درجة حرارة الغرفة واستخدام هذا الدم لتحليلات FACS كما هو موضح في 12.
      ملاحظة: لتغيير طول الحلقات ل setups التجريبية مختلفة، خطة aliquots بشكل صحيح استناداً إلى مقدار القياسات التي سيتم إجراؤها. قد يكون من الضروري إنشاء جميع القياسات المطلوبة مع الدم الطازج قبل التجارب الحقيقية لضمان حجم الدم في الحلقات يكفي لجميع القياسات.
7. جمع عينات من حمض الإيثيلين الدييتامينتراستيك (EDTA) عينات الدم والبلازما.
   1. من كل كوب زجاجي بالدم (انظر 1.6 و 3.3) نقل 4.5 مل من الدم في أنبوب EDTA 5 مل. ملء اثنين من أنابيب EDTA من كل 10 مل كوب زجاجي بالدم.
   2. خلط بلطف الدم والاحتفاظ بها على الجليد.
   3. نقل 2 مل من الدم في أنبوب الطرد المركزي قفل 2 مل واستخدام هذا الدم لعدد خلايا الدم وقياس الهيموغلوبين الحرة كما هو موضح في 5. و6.
   4. جهاز طرد مركزي الدم المتبقي في 3500 س ز لمدة 20 دقيقة.
   5. جمع البلازما بعناية في عظمى في 500 ميكرولتر aliquots وتجميد على الفور في -80 درجة مئوية.

4. مسح المجهر الإلكتروني وصور ميكروتك

1. بعد معالجة عينة الدم، شطف الحلقات الفارغة التي أعدت كما هو موضح في 2.3 مع 10 مل من المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) لكل من.
2. قطع بعناية عينة 1 سم طويلة من كل نهاية كل أنبوب مع مشرط.
3. عينة احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في محلول جلوتارالديهيد 2٪ .
   تنبيه: يمكن أن يسبب استنشاق أبخرة الألدهيد أعراضًا أنفية مثل سيلان من خام الأنف المستمر وتهيج مجرى الهواء ، والتلامس مع الجلد يسبب التهاب الجلد. يجب التعامل مع ألدهيدس في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات وثوب الحماية ونظارات السلامة.
4. شطف العينة (3 مرات) مع برنامج تلفزيوني.
5. إعداد 1٪ من محلول تتراوكسيد أوسميوم (OsO₄₎في المياه deionized وعينة احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: OsO₄ هو عامل مؤكسد قوي، يمكن تقليله عن طريق التعرض للضوء. لتجنب التخفيض أثناء التحضير، قم بتخزين OsO₄ في زجاجة زجاجية بنية. OsO₄ متقلب للغاية ، أبخرةها سامة للعينين والأنف والحنجرة. دائماً العمل تحت الأبخرة غطاء محرك السيارة واستخدام قفازات وحماية الملابس، وضمان أن أي جزء من الجسم يتعرض لOsO₄. اتصل بالمبادئ التوجيهية لمؤسستك فيما يتعلق بمعالجة التخلص من النفايات وتخزينها. بشكل عام ، OsO₄ قابل لستور لعدة أشهر ، لكنه يحتاج إلى زجاجات زجاجية خاصة مع بطانة تفلون و desiccator ، لأن OsO₄ يمكن أن تلون الأسطح الداخلية ومحتويات الثلاجة في وجود أبخرة متسربة.
6. إخراج العينات، ونقلها في أنابيب جديدة للطرد المركزي 15 مل وشطف العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
7. تحضير سلسلة من الإيثانول بتركيزات متفاوتة (25%، 50%، 75%، 95%، 100%)
8. عينات التجفيف في الإيثانول: احتضان لمدة 20 دقيقة لكل من 25٪ ، 50 ٪ ، 75 ٪ و 90 ٪ و 30 دقيقة في 100 ٪.
9. أخذ عينات من 100٪ الإيثانول والسماح لها الهواء الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
10. فحص العينات في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي في الجهد تسارع 5 كيلوفولت ومع الأشعة السينية μCT الماسح الضوئي.

5. عدد خلايا الدم

1. خذ 2 مل من الدم EDTA التي تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.3
2. أدخل الأنبوب في محلل أمراض الدم الآلي واتبع تعليمات الشركة المصنعة.

6. قياس الهيموغلوبين الحرة (fHb) في البلازما

1. ذوبان عينة بلازما واحدة من كل حالة تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5. يُحفظ على الجليد بعد الذوبان.
   ملاحظة: دائماً قم بذوبان عينات البلازما المجمدة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ونقلها على الفور إلى الجليد، التي تحتوي على بعض الماء، لخفض درجة الحرارة. وهذا أمر مهم لتجنب تنشيط مكونات الدم أثناء الذوبان.
2. استخدم كاشف fHb واتبع تعليمات الشركة المصنعة. تجنب التلوث بعد فتح وحماية الكاشف من الضوء المباشر (الشمس، ضوء الأشعة فوق البنفسجية).
3. استخدم مخطط التنقيط (انظر إرشادات الشركة المصنعة) مع تخفيف 1:5.
4. إضافة 1000 μL من كاشف الهيموغلوبين في cuvette 1.6 مل شبه الصغر. استخدم هذا cuvette لتحديد قيمة فارغة.
5. إضافة 1000 μL من كاشف الهيموجلوبين و 250 ميكرولتر من عينة البلازما في آخر cuvette شبه الصغرى.
6. اخلطي المحتويات في كل من الحفّاضات عن طريق مسح الماصة جيداً عن طريق ملء الخليط المتكرر من التفاعل، وحضن على الأقل 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. تحديد انقراض (E) العينة ضد كاشف fHb كمكشف فارغ. حساب تركيز fHb (مليمول / لتر) من العينة: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0.452.

7. قياس FPA

1. ذوبان عينة البلازما من كل شرط تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5 وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد.
2. استخدام FPA إليسا عدة واتبع تعليمات الشركة المصنعة.

8. قياس sC5b9

1. ذوبان عينة البلازما من كل شرط تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5 وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد.
2. استخدم مجموعة SC5b-9 ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة.

9. قياس PMN

1. ذوبان عينة البلازما من كل شرط تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5 وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد.
2. استخدم مجموعة PMN-Elastase ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة.

10. قياس TNF

1. يجب أن تكون مغلفة microplates يوم واحد قبل تشغيل ELISA. للطلاء، إضافة 100 ميكرولتر من التقاط محلول الأجسام المضادة لجميع الآبار، لوحة الختم واحتضان بين عشية وضحاها في 2 درجة مئوية-8 درجة مئوية.
2. ذوبان عينة بلازما واحدة من كل حالة تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5. يُحفظ على الجليد بعد الذوبان.
3. استخدم مجموعة TNF ELISA واتبع إرشادات الشركة المصنعة.

11. قياس IL-6

1. يجب أن تكون مغلفة microplates مع الأجسام المضادة التقاط يوم واحد قبل التجربة. للطلاء، إضافة 100 μL من التقاط حل الأجسام المضادة لجميع الآبار من microplate المقدمة مع مجموعة، لوحة الختم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية
2. ذوبان عينة البلازما من كل حالة تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5. وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد.
3. استخدم مجموعة IL-6 ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة..

12 - تحليلات نظام مراقبة الأصول الميدانية

1. إعداد 500 مل من العازلة FACS عن طريق إضافة 10 مل من مصل عجل الجنين و 2 مل من EDTA حل (0.5 M) إلى 488 مل من 1X PBS. يمكن تخزين المخزن المؤقت FACS لمدة 4 أسابيع عند 4 درجات مئوية.
2. استخدام 100 ميكرولتر من الدم سيترات الصوديوم (انظر 3.6.3) لكل عملية تلطيخ (مجاميع الصفائح الدموية أحادية الكيس (MPA)، تنشيط الصفائح الدموية (السلطة الفلسطينية)، كريات الدم الكريات البيض (LI)).
3. Pipette 100 ميكرولتر من الدم من كل عينة إلى أنبوب FACS 5 مل. من كل عينة، وإعداد 3 أنابيب لتلوين الأجسام المضادة والتسمية مع MPA (مجاميع الصفائح الدموية أحادية الكيس) لوحة، السلطة الفلسطينية (مجاميع الصفائح الدموية) ولوحة LI (الكريات البيض integrin).
4. اخلط باقي العينات 4 في أنبوب واحد 5 مل فاكس. استخدم هذا المزيج لعناصر التحكم غير المطّوعة والمفلورة ناقص واحد (FMO).
5. إعداد 6 أنابيب FACS عن طريق الأنابيب 100 ميكرولتر من الدم عينة مختلطة في كل أنبوب. تسمية 3 أنابيب كما غير المطهية و 3 أنابيب كما FMO-CD41، FMO-CD62P و FMO-CD162.
6. إضافة 100 μL من 4٪ حل شبه شكلي واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: البارفورمالديهايد سام للبشرة والعينين. يمكن أن يسبب تهيج رئوي خطير عند استنشاقه ويمكن أن يؤدي إلى تلف الرئة بعد التعرض لفترات طويلة. وعلاوة على ذلك، فإنه يصنف على أنه مادة مسرطنة وسموم تناسلي. دائما ارتداء القفازات ونظارات السلامة والعمل تحت غطاء محرك الدخان.
7. إضافة 1 مل من العازلة غسل لكل أنبوب والطرد المركزي في 287 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل سوبرنات وكرر خطوة الغسيل مرتين.
8. لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) ، أضف 1 مل من 1x العازلة RBC تحلل العازلة (تمييع 10x RBC تحلل العازلة في المياه deionized) ، مزيج عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
9. إعداد الخرز التعويض عن البقع واحد. إلى 1 مل من المخزن المؤقت FACS إضافة 4 قطرات من كل حبات إيجابية وسلبية. دوامة شاملة وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الخرز إلى أنبوب واحد FACS 5 مل.
10. إعداد 4 أنابيب مع الخرز والتسمية كما CD14-FITC، CD41-BV421، CD45-APC و CD62P-PE. إضافة 1 مل من العازلة FACS إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 287 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل عظمى والحفاظ على الجليد.
11. بعد تحلل RBC ، أضف 1 مل من عازلة FACS لكل أنبوب ويغسل كما هو موضح في 12.7. تجاهل مُتفوّك.
12. إعداد كوكتيلات الأجسام المضادة:
    1. لوحة MPA: إضافة 4 ميكرولتر من CD45-APC، 4 ميكرولتر من CD14-FITC و4 ميكرولتر من CD41-BV421 إلى 388 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    2. لوحة السلطة الفلسطينية: إضافة 1.6 ميكرولتر من CD41-BV421 و 12 ميكرولتر من CD62P-PE إلى 386.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    3. لوحة LI: إضافة 4 ميكرولتر من CD45-APC و 8 ميكرولتر من CD162-BV421 إلى 388 ميكرولتر من مخزن FACS. حافظ على الثلج.
13. إعداد البقع واحد: إضافة 0.5 μL إلى 499.5 ميكرولتر من FACS العازلة لكل من CD14-FITC، CD41-BV421 و CD45-APC. بالنسبة لـ CD62P-PE، أضف 0.3 ميكرولتر إلى 499.7 ميكرولتر من مخزن FACS. حافظ على الثلج.
14. إعداد عناصر التحكم FMO: (i) لوحة MPA (FMO-CD41): أضف 1 ميكرولتر 1 ميكرولتر مضادة CD14-FITC و 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD45-APC إلى 98 ميكرولتر فاكس العازلة. لوحة السلطة الفلسطينية (FMO-CD62P): تضاف 0.4 ميكرولتر من CD41-BV421 إلى 99.6 ميكرولتر من مخزن فاكسات. '3' لوحة LI (FMO-CD162): يضاف 1 ميكرولتر من CD45-APC إلى 99 ميكرولتراً من مخزن احتياطي فاكس. الحفاظ على ضوابط FMO على الجليد.
15. دواتكس كوكتيلات الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولتر من كل كوكتيل الأجسام المضادة كما أعدت في 12.12 إلى كل من الأنابيب ذات العلامات (MPA، السلطة الفلسطينية ولوحة LI) كما هو موضح في 12.3 ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إبقاء على RT في الظلام.
16. دوامة واحدة وصمة عار تخفيف الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة وصمة واحدة كما أعدت في 12.13. لكل من الأنابيب المسماة مع الخرز كما هو موضح في 12.7 ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إبقاء على RT في الظلام.
17. Vortex FMO الأجسام المضادة الكوكتيلات وإضافة 100 ميكرولتر من كل كوكتيل الأجسام المضادة FMO-1 كما أعدت في 12.14. لكل من الأنابيب المسماة (FMO الضوابط) كما هو موضح في 12.5. وخلط بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. إبقِ في الـ RT في الظلام.
18. احتضان جميع الأنابيب مع جسم مضاد تلطيخ لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
19. اتخاذ الأنابيب الثلاثة للسيطرة غير الملطخة (انظر 12.4) وبيدية ريسوسيبوسنيد في 250 ميكرولتر من العازلة FACS. حافظ على الثلج.
20. بعد فترة الحضانة، وغسل جميع الأنابيب باستثناء غير المطّط الضوابط مرة واحدة مع العازلة FACS كما هو موضح في 12.7. إعادة بناء بيليه في 250 ميكرولتر من العازلة FACS والحصول على البيانات على مقياس التدفق.
21. استخدام الخلايا غير المُطَوَّتة للإعدادات السلبية وخرز الماوس التعويضي للإعدادات الإيجابية في برنامج FACS. وعلاوة على ذلك، استخدم FMO للسيطرة على استراتيجية الغاء، حيث يتم استخدام FMO-CD41 في لوحة MPA، يتم استخدام FMO-CD62P في لوحة السلطة الفلسطينية ويستخدم FMO-CD162 في لوحة LI.
22. الحصول على ما يقرب من 0.5 × 10^{6 -} 0.25 × 10⁶ أحداث لكل أنبوب لـ FACS. حفظ البيانات وتحليلها باستخدام برنامج تحليل (الإصدار 9.9.6).

وقد تم تحليل جميع البيانات المقدمة، باستثناء مخططات FACS، باستخدام برنامج إحصائي. تم تحليل مخططات FACS باستخدام برنامج تدفق القياسات الكيسية.

لم يظهر تحليل تعداد خلايا الدم الكاملة أي اختلافات كبيرة فيما يتعلق بالكريات الحمراء بين جميع الحالات المختبرة (الشكل 2). ولكن، خفضت الصفائح الدموية وleukocytes بشكل كبير في مجموعة اللاتكس، مما يشير إلى ضعف التوافق الحيوي للغاية من اللاتكس. وهذا ما يؤكده كذلك زيادة مستويات الهيموغلوبين الحرة في مجموعة اللاتكس، مما يشير إلى أنه باستثناء مجموعة اللاتكس، لم تؤد أي من أجهزة الأوعية الدموية الأخرى أو الظروف إلى انحلال الدم على نطاق واسع(الشكل 2). وعلاوة على ذلك، فإن أنابيب PVC المغلفة، بولي بي في و hepPVC، فضلا عن الدعامة اختبارها لم يؤدي إلى تجلط الدم عن طريق فقدان الصفائح الدموية وleukocyte، في حين أظهرت اللاتكس أعلى فقدان الصفائح الدموية وleukocyte، تليها أنابيب PVC غير المصقول التي أظهرت انخفاض الاتجاه.

في حين أن جميع أجهزة الأوعية الدموية اختبارها أدت إلى زيادة تنشيط نظام التخثر (FPA) وعنصر مكمل (sC5b-9)، حلقات hepPVC أظهرت اتجاها لانخفاض مستويات FPA وsC5b-9 عند مقارنتها خصيصا لحلقة بوليبVC(الشكل 3). ومن المثير للاهتمام، أظهرت حلقات PVC والفجوة غير المصقول مستويات أقل من FPA مقارنة بـ polyPVC، على الرغم من عدم الوصول إلى مستوى الأهمية الإحصائية. ومع ذلك، أظهرت حلقات اللاتكس زيادة كبيرة في مستويات FPA بالمقارنة مع خط الأساس والظروف الثابتة.

وفقا لجميع تعدادات خلايا الدم، أظهرت حلقات اللاتكس أعلى مستوياتTNF، IL-6 وPMN elastase(الشكل 4)،لتصل إلى مستوى الأهمية الإحصائية بالمقارنة مع بقية المجموعات من حيث TNF و IL-6(الشكل 4A,B)،في حين أن الشروط الثابتة وخطوط الأساس من حيث PMN elastase(الشكل 4C). هذه النتائج تشير إلى تنشيط قوية من الكريات البيض من قبل اللاتكس. كانت مستويات خط الأساس لعلامات التنشيط قابلة للمقارنة دائمًا مع الظروف الثابتة ، مما يشير إلى حدوث هدّان مناسب للدم.

ومن المثير للاهتمام، فقد تبين أن الصفائح الدموية و كريات الدم الكريات البيض التهم لفجوة الحلقات الناجمة عن خفضت قليلا فقط مع تنشيط معتدل من نظام التخثر (FPA) و الكريات البيض (PMN elastase)، على الرغم من إغلاق حلقة غير لائق مع الاضطرابات تدفق الناتجة والاتصال بالدم إلى سطح غير المصقول، وقطع تقريبا أدى إلى جلطات مرئية العيانية في splice(الشكل 1F). كانت الجلطات وتوزيعها على سطح العبوة بأكملها واضحًا مع صور μCT و SEM ، في حين لم يتم العثور على جلطة عندما تم إغلاق الحلقات مع جهاز الإغلاق الخارجي مما لا يترك أي فجوة بين نهايات الحلقة (الشكل 5).

تحليل التدفق السيتوميتري لخلايا الدم المضيفة التي كانت ملطخة بعلامات محددة من الصفائح الدموية ، CD41 وعلامة تنشيط الصفائح الدموية CD62P ، تظهر في الشكل 6A ، B. هنا، أظهرت أنابيب اللاتكس عالية للغاية كثافة الفلوروس الوسيط (MFI) لCD62P على الصفائح الدموية، تليها الدعامة، في حين أن أنابيب البولي بيVC المغلفة الهيبارين أظهرت الحد الأدنى من التنشيط من الصفائح الدموية التي تصور الملكية المضادة للتخثر من أنابيب بولي بي سي. وعلاوة على ذلك، تم تصنيف الكريات البيض على أساس CD45 وSSC (الجانب المبعثر) الحبوبية القائمة على أساس '1' الحبيبات؛ (ii) وحيدات و (3) الخلايا الليمفاوية (الشكل 7) ، وتم الكشف عن التعبير عن CD162+ integrin على كل مجموعة فرعية من الكريات البيض التي من المعروف أنها تتفاعل مع CD62P على الصفائح الدموية24. ولوحظ أن التعبيرات integrin خفضت بشكل كبير على المحببات والخلايا الليمفاوية في الحلقات اللاتكس. وكانت هذه النتيجة تمشيا مع انخفاض مستويات مجموع ترددات الكريات البيض في الحلقات اللاتكس (الشكل 2). بشكل عام، كانت مستويات integrin أعلى بين أحاديات عندما مقارنة الحبيبات الحبيبية والخلايا الليمفاوية، مما يشير إلى احتمال لتفاعل أحادية مع الصفائح الدموية المنشطة. وفي هذا الصدد، تم تقييم مجاميع الصفائح الدموية أحادية الخلايا أيضا عن طريق تلطيخ خلايا الدم مع CD14 (كما علامة أحادية) وD41 (كما علامة الصفائح الدموية) وفي نهاية المطاف لتحديد الخلايا الإيجابية المزدوجة أي CD14+CD41+MPA (الشكل 8). هنا، لاحظنا أن مجموعة الدعامات أظهرت أعلى مستويات التعبير CD41 على MPA، تليها مجموعة اللاتكس، مما يشير إلى زيادة الميل إلى تشكيل MPA، على الرغم من انخفاض وتيرة أحادية (< 1 %) في حلقات اللاتكس.

الشكل 1: نظرة عامة على نموذج حلقة الدموية في المختبر الصناعي وتعديلاته. (A) حلقة لتجربة الفجوة مع نظام إغلاق حلقة خارجية ، وترك أي فجوة في لصق. (B) حلقة مصنوعة من مادة البولي بي سي المغلفة أنبوب PVC والدعامات داخل (السهم). (C)حلقة مصنوعة من أنبوب اللاتكس. (D)حلقة لتجربة الفجوة دون نظام إغلاق حلقة خارجية ترك فجوة بين نهايات أنبوب (السهم). (E)الحلقات وضعت في حلقة مهد داخل حمام الماء ومليئة بالدم. (F) ثركمبوس مما أدى إلى وجود فجوة في لصق (السهم) بعد التناوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نتائج عدد خلايا الدم والهيموجلوبين البلازما. (أ) عدد كريات الدم الحمراء. (ب) الصفائح الدموية العد. (F) عدد الكريات البيض. (D) الهيموجلوبين البلازما الحرة. وتشير النتائج إلى ضعف التوافق البيولوجي للماتكس، مما يؤدي إلى الانحلال الانحلالي المفرط. وتقدم البيانات على أنها قيمة متوسطة؛ تشير أشرطة الخطأ SEM. n = 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نتائج تفعيل نظام التخثر والتكميل. (أ)تفعيل نظام التخثر، تقاس بمستويات فيبرينوبيبتايد A (FPA) (B) مكملة لتنشيط النظام، تقاس بمستويات sC5b-9. في حين أن أنابيب اللاتكس أثارت مستويات مرتفعة كبيرة من FPA، وكان التنشيط تكملة قوية لجميع المواد اختبارها. يتم عرض البيانات على أنها قيمة متوسطة، وتشير أشرطة الخطأ إلى SEM. * p<0.05, n=1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: علامات تنشيط الكريات البيض. (A) الورم معامل نخر ألفا (TNF). (ب) إنترلوكين 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. وتشير النتائج إلى زيادة تنشيط الكريات البيض بسبب ارتفاع مستويات العلامات المحللة، تليها حلقات الدعامة، التي أدت فقط إلى زيادة مستويات PMN Elastase ولكن ليس TNF أو IL-6. يتم عرض البيانات على أنها قيمة متوسطة، وتشير أشرطة الخطأ SEM. * p<0.5; **p<0.01, n=1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تصوير لصق الحلقات. (A) μ الكمبيوتر (μCT) من الحلقات مع إغلاق غير لائق (الفجوة). المناطق الحمراء تشير إلى مواد خثرة. (ب) تقديم الجانب اللمبّر من الأنبوب. يشير التحديد المستطيل إلى منطقة المسح المجهري الإلكتروني (SEM) (C). (D) μCT من الحلقات مع جهاز إغلاق حلقة خارجية ولا توجد فجوة في لصق ، و (E) تقديم وعرض السطح اللمبين. لم يتم العثور على أي مواد خثرة. (F) SEM صورة من اختيار مستطيلة في (E). لم يتم العثور على أي مواد خثرة على سطح القطع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: مؤامرة FACS لتنشيط الصفائح الدموية (CD62P). (أ) ممثل FACS مؤامرة (شرط أساسي) تظهر الدم CD41+ الصفائح الدموية. (B) رسم بياني يوضح حالة تنشيط الصفائح الدموية التي تعكسها شدة الفلور (MFI) المتوسط لأنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية بالمقارنة مع RT الثابتة وظروف خط الأساس. تقدم أشرطة البيانات بيانات من قياسات مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: مؤامرة FACS للتكريس البيض integrin (CD162). (أ) ممثل FACS مؤامرة (شرط أساسي) تظهر الدم CD45+ الكريات البيض والمجموعات الفرعية (B) الرسم البياني يظهر الكريات البيض CD162+ integrin متوسط كثافة الفلور (MFI) من أنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية بالمقارنة مع الظروف الثابتة والظروف الأساسية. تقدم أشرطة البيانات بيانات من قياسات مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: مؤامرة FACS للمجاميع أحادية الصفيحات (CD41/CD14). (أ) ممثل FACS مؤامرة (شرط أساسي) تبين الغاء ل monocytes الدم (CD45++ CD14+) ، الصفائح الدموية (CD41+ +) ومجاميع الصفيحات أحادية الخلايا (CD41+/ CD14+) (B) الرسم البياني يظهر CD41+ متوسط شدة الفلوريسنس (MFI) على مجاميع صفيحة أحادية الخلايا لمختلف الأجهزة الوعائية مقارنة بالشروط الثابتة وخطوط الأساس. تقدم أشرطة البيانات بيانات من قياسات مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الممول [ebo kunze industriedign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, ألمانيا] قدمت دعما ماليا في شكل المواد الاستهلاكية ورسوم النشر لمؤلف هذه المخطوطة [ماكس واكر]. لم يكن للممولين أي دور إضافي في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعدادها.