نهج لدراسة النسخ المعتمدة على الشكل على مستوى خلية واحدة

Summary

تعرض هذه الورقة طرقًا لنمو الخلايا القلبية ذات الأشكال المختلفة ، والتي تمثل أمراضًا مختلفة ، وفرز هذه الخلايا القلبية المؤمنة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. توفر المنصة المقترحة نهجًا جديدًا في الإنتاجية العالية وفحص الأدوية لأنواع مختلفة من قصور القلب.

Abstract

وقد ارتبطت أنواع مختلفة من تضخم القلب مع زيادة حجم myocytes القلب (CMs), جنبا إلى جنب مع التغيرات في مورفولوجيا CM. في حين أن آثار حجم الخلية على التعبير الجيني معروفة جيدا، فإن آثار شكل الخلية ليست مفهومة جيدا. تصف هذه الورقة طريقة تم تصميمها لتحليل تأثيرات مورفولوجيا CM على التعبير الجيني بشكل منهجي. وهو تفاصيل تطوير استراتيجية جديدة لملاءمة الخلية الواحدة التي يتبعها بعد ذلك تسلسل مرنا أحادي الخلية. كما تم تصميم رقاقة صغيرة ، والتي تحتوي على 3000 مستطيلة الشكل micropatterns الليفية. وهذا يجعل من الممكن أن تنمو CMs في طول واضح: عرض نسب العرض إلى الارتفاع (AR)، المقابلة لأنواع مختلفة من فشل القلب (HF). كما تصف الورقة بروتوكولًا تم تصميمه لالتقاط الخلايا الفردية من نمطها ، باستخدام منتقي الخلايا الصغيرة شبه المؤتمتة ، وحقنها بشكل فردي في مخزن منفصل للتحلل. وقد جعل هذا من الممكن لمحة transcriptomes من CMs واحد مع أنماط مورفوفيلية هندسية محددة وتوصيف لهم وفقا لمجموعة من الظروف العادية أو المرضية: اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) أو ما بعد تحميل / متحدة المركز مقابل اعتلال عضلة القلب المتوسع (DCM) أو التحميل المسبق / غريب الأطوار. باختصار، تعرض هذه الورقة طرقًا لزراعة CMs ذات أشكال مختلفة، والتي تمثل أمراضًا مختلفة، وفرز هذه CMs الملتمَكة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. ويوفر البرنامج المقترح نهجا جديدا في الإنتاجية العالية وفحص المخدرات لأنواع مختلفة من الترددات العالية.

Introduction

ووفقا لمنظمة الصحة العالمية، فإن أمراض القلب والأوعية الدموية هي أحد الأسباب الرئيسية للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. يؤثر المرض القلبي الوعائي بشكل كبير على نوعية حياة الناس وله تأثير اجتماعي واقتصادي كبير. اعتلالات القلب، مثل الهدّان و DCM، هي اضطرابات أولية في عضلة القلب والأسباب الرئيسية ل HF ارتبطت بارتفاع معدلات المراضة والوفيات. هناك العديد من أسباب HF، بما في ذلك الآثار البيئية، مثل العدوى والتعرض للسموم أو بعض الأدوية⁸. HF يمكن أيضا أن يكون سببها الاستعداد الوراثي، وهي الطفرات⁹. ويعتقد أن التغيرات في التكوين الجيني التي تؤثر على المصفوفة خارج الخلية (ECM) جزيئات، integrins أو البروتينات الهيكلية الهيكلية يمكن أن تكون مسؤولة عن ضعف mechanosensation وأنواع مختلفة من أمراض القلب¹⁰.

السمة الرئيسية لHCM هو تضخم غير المبررة من البطين الأيسر¹¹، وأحيانا من البطين الأيمن¹²، وهذا كثيرا ما يقدم مع المشاركة السائدة من الحاجز المتدخل. كما يتميز HCM بالخلل الانبساطي والفوضى والتليف^{العضلي 13}. في معظم الحالات، يتأثر الجهاز العقدي للقلب بالطفرات في البروتينات الساركية، مما يؤدي إلى زيادة قابلية التقلص من myocytes¹⁴. في المقابل، يتميز DCM بتمدد واحد، أو كليهما، البطينين ولديه مسببات الأسرة في 30٪ إلى 50٪ من الحالات¹⁵. يؤثر DCM على مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية ، مما يؤدي إلى ضعف تقلص الخلايا العضلية ، وموت الخلايا وإصلاح ليفي¹⁶.

وقد أظهرت علم الوراثة أن أنواع معينة من الطفرات قوة CMs واحدة لاعتماد خصائص شكل معين خلال HCM³، وهي الخلايا على شكل مربع مع طول : عرض AR الذي يساوي تقريبا 1:1⁴ (AR1). وينطبق الشيء نفسه على DCM، مع خلايا ممدود مع AR الذي يساوي تقريبا 11:1 (AR11). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون سبب ارتفاع الترددات (مثل ارتفاع ضغط الدم). في هذه الحالات، مطالب الدم الديناميكية قوة CMs لاتخاذ على الأشكال المربعة، وفقا لقانون لابلاس، والتغييرات AR من 7:1⁵ (AR7) إلى 1:1^6،7. ويمكن أن يكون سبب ارتفاع الحمولة العالية أيضاً زيادة في الحمولة المسبقة (مثلاً، في الظروف التي تؤدي إلى زيادة الحجم الزائد). عندما يحدث هذا، القيود الحيوية الفيزيائية تفرض CMs على الإطالة وتغييرات AR من 7:1 إلى 11:1.

يعتمد نشاط الإشارة في الأغشية على معلمات هندسة الخلايا العالمية، مثل AR الخلوية، والحجم، ومساحة سطح الغشاء وانحناء الغشاء¹⁸. عندما تم مطلية CMs الفئران حديثي الولادة على ركائز التي تم نقشها لتقييد الخلايا في طول محدد: عرض AR، أنها أظهرت أفضل وظيفة انكماش عندما كانت النسب مماثلة للخلايا في قلب الكبار صحية. في المقابل، كان أداؤها ضعيفا عندما كانت النسب مماثلة لتلك التي من myocytes في قلوب الفشل¹⁹. في المراحل المبكرة من تضخم، تصبح الخلايا أوسع، كما يتجلى في زيادة في منطقة المقطع. يحدث HF في المراحل اللاحقة من تضخم والخلايا تظهر عادة ممدود. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن في نماذج الفئران الحية من تضخم مزمن قد أبلغت عن زيادة في طول myocyte البطين الأيسر من حوالي 30٪²⁰، ولكن الكبار CMs من نموذج الفأر المعدلة وراثيا التي تم علاجها بشكل حاد مع المحفزات الضخامي في المختبر أظهرت زيادات مماثلة في عرض الخلية بدلا من²¹.

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، والذي يسمح بتحليل دقيق لنسخ الخلايا الفردية ، يحدث حاليًا ثورة في فهم بيولوجيا الخلايا. كانت هذه التقنية هي الطريقة المفضلة عندما يتعلق الأمر بالإجابة على السؤال عن كيفية تأثير أشكال الخلايا الفردية على التعبير الجيني. قارنا الخلايا الفردية ذات الأشكال المختلفة، خاصة مع ARs من 1:1، 7:1 أو 11:1. وقد تم ذلك عن طريق بذر CMS البطين الفئران حديثي الولادة على رقاقة مصممة خصيصا مليئة micropatterns الليفية المغلفة² مع ARs محددة من 1:1، 7:1 أو 11:1. تم تصنيع micropatterns باستخدام تكنولوجيا الطباعة الضوئية. كانت مطلية micropatterns بواسطة فيبرومينيكتان ، وتحيط بها سطح السيتوبوب. ولذلك، سوف CMs إرفاق، وانتشار والتقاط AR المحدد من micropatterns فقط من خلال النمو على الركيزة الليفية، مع تجنب المنطقة السيتوبوب. لا توجد الـ micropatterns في شكل جيد. بدلا من ذلك، ومستوى فيبرومينكتين هو بالضبط في نفس الارتفاع من المنطقة السيتوبوب المحيطة. هذا توفير ظروف مماثلة لتنامي الخلايا في طبق بيتري، كما لا يوجد أي إجهاد من الجدران المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مساحة السطح من micropatterns مع ARs مختلفة متساوية.

كان هناك جانبان مهمان بشكل خاص من التصميم التجريبي ، مما أدى إلى استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بدلاً من تسلسل الحمض النووي الريبي السائب. أولاً، يمكن شغل نسب قليلة فقط من الterns الصغيرة بواسطة خلية واحدة. ثانياً، في بعض الأحيان لا تشغل خلية واحدة سطح micropattern بشكل كامل. يجب اختيار الخلايا الفردية التي تغطي سطح micropattern بشكل كامل لتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. لأن مجموعة فرعية فقط من الخلايا مطلي على رقاقة راض عن كلا المعيارين، لم يكن من الممكن ببساطة لـ trypsinize رقاقة كاملة وجمع جميع الخلايا لتسلسل RNA السائبة. تحتاج الخلايا المؤهلة إلى أن يتم انتقاؤها بشكل فردي باستخدام منتقي الخلايا شبه المؤتمتة.

لا يزال من غير المعروف حاليا ما إذا كان شكل CM، في حد ذاته، له تأثير داخل وظيفية على التزامنية عضلة القلب. وكان الغرض الرئيسي من الأساليب المقترحة في هذه الورقة لتطوير منصة جديدة لدراسة ما إذا كان شكل الخلية في حدّها كان له تأثير على نسخة^17. على الرغم من أن الدراسات في المختبر يختلف عن الدراسات في الجسم الحي، كان الغرض من هذه الدراسة للتحقيق في تأثير أشكال الخلايا المختلفة على التعبير الجيني، مع الأخذ في الاعتبار أن مقارنة الخلايا ذات الأشكال المختلفة في الجسم الحي هو طالب للغاية. وقد استلهمت هذه التجارب من Kuo وآخرون¹⁹، الذين استخدموا نهجا مماثلا وأفادوا بأنهم لاحظوا تغيرات في المعلمات الفسيولوجية بسبب التغيرات في شكل الخلايا.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات متفقة مع لوائح لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة لمعهد كارولينسكا، ستوكهولم، السويد.

1. تخطيط رقاقة منقوشة الصغرى

1. استخدام رقاقة مصممة خصيصا (جدول المواد)(الشكل 1A):19.5 مم × 19.5 ملم مع الأغطية micropatterns المنشط، المطبوعة عن طريق التصوير الضوئي على زجاج البورسليكات.
   ملاحظة: هذه micropatterns محاطة منطقة cytophobic. لذلك، يمكن لخلية مبذرة فقط إرفاق وتنمو على واحدة من هذه micropatterns والتقاط AR من أن micropattern. وتنقسم الرقاقة إلى ثلاث مناطق وتتكون كل منطقة من ميكروباتينترنس مع AR محددة. يظهر تخطيط الشريحة في الشكل 1B. يتم عرض هندسة ARs المعرفة في الجدول 1. يتم عرض الصور الفلورية المكبرة من الأشكال المختلفة للminectin micropatterns في الصور السفلي في الشكل 1B.

2. رقائق طلاء micropatterned

1. إعداد 2x محلول بروتين الطلاء لكل رقاقة عن طريق إضافة 80 ميكروغرام من الليفي إلى 2 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS^-/-).
2. نقل رقاقة إلى 35 ملم جرينر بيتري طبق وعلى الفور إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني^-/-. ثم إضافة 2 مل من 2x طلاء محلول البروتين.
3. احتضان رقائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
4. غسل حل الطلاء من قبل خطوات التخفيف المتعاقبة مع برنامج تلفزيوني^-/-. يجب أن يكون سطح الشريحة رطبًا دائمًا. ثم، استبدال برنامج تلفزيوني مع 2 مل من المتوسطة الطلاء واحتضان في 37 درجة مئوية حتى خلايا البذر.

3- عزل الآليات CMs

1. إعداد المتوسطة الطلاء من خلال المكمل DMEM:M199 (4:1) مع مصل الخيل 10٪ ، 4 ٪ مصل الأبقار الجنينية ، 2 ٪ HEPES (1 M) و 1 ٪ من البنسلين / ستربتوميسين (10000 U / مل)²².
2. تشريح الأنسجة من البطين الأيسر من قلوب الفئران حديثي الولادة 2 يوما ونقلها إلى طبق 10 سم تحتوي على برنامج تلفزيوني. قطع الأنسجة إلى ما يقرب من 1 ملم³ قطع.
3. نقل الأنسجة المحصودة إلى أنبوب الدوار الغطاء، ومجهزة الدوار في الغطاء لتفكك الأنسجة (جدول المواد). دع الأنسجة تستقر ثم إزالة الماسخ بعناية.
4. إضافة 2.5 مل من خليط من مزيج انزيم 1 و 2، أعدت باستخدام طقم تفكك القلب حديثي الولادة (جدول المواد)،إلى أنبوب C وإغلاق الغطاء بإحكام.
5. أدخل أنبوب الدوار غطاء على كم من الفصام، ومجهزة سخانات (الشكل 2ألف وباء) ( جدولالمواد). تشغيل برنامج الحضانة 37C_mr_NHDK_1 (الشكل 2C) ، الذي يستمر حوالي ساعة.
6. في حين أن برنامج الحضانة قيد التشغيل، وإعداد PEB العازلة التي تحتوي على 2 mM EDTA و 0.5٪ البوم الدم البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني، درجة ح O 7.2، والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية.
7. بعد إنهاء برنامج الحضانة، فصل أنبوب الدوار كاب(الشكل 2D)وإضافة 7.5 مل من قبل تدفئة التصفيح المتوسطة.
8. Resuspend العينة وتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة 70 ميكرومتر.
9. غسل مصفاة مع آخر 3 مل من المتوسطة الطلاء.
10. الطرد المركزي تعليق الخلية في 600 × ز لمدة 5 دقائق. استلهموا المُتفوّك تماماً
11. Resuspend بيليه الخلية في 60 ميكرولتر من الباردة PEB العازلة.
12. أضف 20 ميكرولتر من كوكتيل عزل القلب الوليدي(جدول المواد)،الذي يحتوي على حبات بحجم ميكرون تستهدف غير CMs.
13. إضافة 20 ميكرولتر من الخرز المضادة للحمض الأحمر خلايا الدم (جدول المواد).
14. اخلطي التعليق وحضنيه عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
15. إضافة 400 μL من PEB العازلة.
16. تطبيق تعليق الخلية على العمود LD(جدول المواد)،والتي تم إدراجها عموديا في موقف المغناطيس وغسلها جيدا مع المخزن المؤقت PEB.
17. جمع الخلايا غير المُعتمَمة وغسل العمود مع 0.5 مل من العازلة PEB.
18. إضافة 8 مل من المتوسطة الطلاء ونقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة⁷⁵ سم 2 غير المصقول واحتضان في 37 درجة مئوية ل 1.5 ساعة. سوف تبدأ CMs غير المتبقية إلى الانضمام إلى ثقافة الخلية غير المصقول وسيتم إثراء تعليق الخلية بواسطة السكان CM.

4. نمط CMs

ملاحظة: قارنا CMs واحد مع ARs من 1:1، 7:1 أو 11:1. ويتم ذلك عن طريق بذر CMs الفئران حديثي الولادة المعزولة على شريحة مصممة خصيصًا مليئة بمرقات صغيرة مغلفة بالليفية مع ARs محددة من 1:1 أو 7:1 أو 11:1. كانت مطلية micropatterns بواسطة فيبرومينيكتان ، وتحيط بها سطح السيتوبوب. لذلك، سوف CMs إرفاق، انتشار والتقاط AR المحدد من micropatterns فقط من خلال النمو على الركيزة fibronectin. نقش CMs المعزولة وفقا للخطوات التالية.

1. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل، عد الخلايا وتمييع إلى تركيز 100،000 الخلايا في مل عن طريق إضافة المتوسطة الطلاء المناسبة.
2. إضافة 2 مل من تعليق الخلية على رقاقة، والتي قد غمرت بالفعل في 2 مل من المتوسطة الطلاء الدافئ داخل 35 ملم طبق غرينر بيتري.
3. احتضان الطبق في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ للسماح CMs نعلق على micropatterns المغلفة في الليفية والسماح لكل CM للحصول على ع من micropattern الركيزة.
4. بعد 18 ساعة، تحقق من رقاقة. إذا كانت معظم الخلايا قد تعلق، فصل وإزالة الحطام والخلايا الميتة التي تعلق على الخلية منقوشة. القيام بذلك عن طريق إزالة المتوسطة الطلاء وإضافة بلطف PBS^-/- dropwise، بدءا من مركز رقاقة ثم تتحرك نحو الجانبين. كرر مرتين.
5. التعرق برنامج تلفزيوني مع وسط الصيانة الطازجة من خلال المكمل DMEM:M199 (4:1) مع مصل الحصان 4٪ ، 4 ٪ مصل الأبقار الجنينية ، 2 ٪ HEPES (1 م) و 1 ٪ البنسلين / ستريبتوميسين (10000 U / مل).

5. اختيار CMs الملتزمة

ملاحظة: بعد فترة زراعة 72 ساعة، يتم انتقاء CMs واحدة منقوشة من micropatterns في الليفية باستخدام منتقي الخلايا شبه الآلي(جدول المواد)(الشكل 3). يستخدم منتقي الخلايا برنامج²³ للتحكم في المرحلة الآلية (الشكل 3A). ويستخدم 70 ميكروميلا الزجاج 70 ميكروميلا(الشكل 3B) لاختيار وحقن CMs الفئران حديثي الولادة منقوشة. يقوم منتقي الخلايا بفرز الخلايا الملتنقة عن طريق توليد فراغ وحقن الخلايا عن طريق الضغط. يتم تطبيق الفراغ في عدد حقنة 1 عن طريق سحب حقنة باستخدام مضخة الحقنة (الشكل 3C). ويستند الضغط الهيدروستاتيكي على الجاذبية ويستحث عن طريق وضع حقنة رقم 2 على مسافة 87 سم فوق مكتب المجهر. ترتبط المحاقن 1 و 2 على التوالي عبر أنابيب PTFE ، إلى الصمامات 1 و 2 ، والتي هي جزءا لا يتجزأ من وحدة التحكم (الشكل 3D). تمتلئ أنابيب PTFE بالكامل بالماء الخالي من الماء RNase. ثم يتم حقن الخلية المفردة التي تم اختيارها إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الذي يحتوي على 3.55 ميكرولتر من عازلة التحلل.

1. بعد فترة زراعة من 72 ساعة، وإزالة المتوسطة القديمة وشطف بلطف سطح رقاقة مع DPBS الحارة^-/-.
   1. الحفاظ على طبق مسطحة وpirate المتوسطة القديمة بلطف مع ماصة 1000 ميكرولتر من جانب واحد من الطبق. تأكد من أن الرقاقة لا تزال رطبة في جميع الأوقات.
   2. إضافة 2 مل من DPBS^-/- بلطف وإسقاط الحكمة فصل معظم الخلايا الميتة التي تعلق على الخلايا المنقوشة، بدءا من مركز رقاقة ومن ثم الانتقال إلى جوانبها.
   3. استلهم معظم DPBS لإزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا العائمة المنفصلة ، بدءًا من مركز الشريحة ثم الانتقال إلى الجوانب.
   4. كرر الخطوات 5.1.2 و 5.1.3 مرة أخرى.
2. استخدام ملقط الزاوية للاستيلاء على حافة رقاقة ونقلها على الفور إلى صحن جديد معقمة 35 ملم جرينر بيتري للحد من عدد الخلايا العائمة في حين قطف.
3. على الفور إضافة 1.5 مل من DPBS^-/- بحيث رقاقة لا تجف.
4. إضافة 1.5 μL من دورة صبغ نابضة بالحياة الخضراء لتصور نواة الخلايا الحية.
5. ضع الرقاقة في وسط طبق غرينر بيتري باستخدام طرف ملقط.
6. وضع غرفة (جدول المواد) على رقاقة. سوف تقوم الغرفة بإصلاح الرقاقة إلى أسفل الطبق، دون منع الوصول إلى أنماط الخلايا.
7. جبل طبق غرينر بيتري على حامل طبق من مرحلة منتقي الخلية وإدراج الغطاء المغناطيسي.
8. معايرة الحقن الآلي.
   1. حدد موقع التقاطع، الذي نقش على المسرح بمحركات في منتصف الصورة في نافذة Live View.
   2. التركيز على التقاطع وحدد المعايرة للحقن الآلي زر في المسح الضوئي وفرز النافذة.
9. استبدال DPBS^-/- مع 1.5 مل من DPBS/تريبسين^-/- (1:1) بينما الطبق على خشبة المسرح، لتخفيف الخلايا من فيبرومينكتين بحيث يمكن استخدام فراغ مائع لاختيار الخلايا.
10. امسح الشريحة بالكامل باستخدام علامة التبويب المسح الضوئي في نافذة المسح الضوئي والفرز. حدد موقع الزاوية اليسرى العليا من الشريحة في مجال الرؤية وانقر على الحصول على موقف المجهر الحالي في أعلى الصف الأيسر الزاوية.
    1. ثم، نقل المرحلة الآلية إلى أسفل الزاوية اليمنى من رقاقة. التركيز على المجهر وانقر على الحصول على موقف المجهر الحالي في الصف السفلي الأيمن.
11. انقر على زر تعيين الطائرة sharpest وعلى برزت نافذة فوق الذهاب إلى الزاوية اليمنى العليا. التركيز على المجهر وانقر على الذهاب إلى أسفل الزاوية اليسرى وتعيين التركيز. عند الانتهاء من النقر على زر إنهاء وبدء المسح الضوئي.
12. عند إنهاء المسح الضوئي، انتقل إلى علامة التبويب تحليل وحدد الخلايا المفردة التي تجتاز معايير الدراسة.
13. تأكد من أن الزجاج microcapillary في منتصف عرض المجهر الحية.
14. التحكم في مضخة حقنة باستخدام نافذة مضخة من البرنامج. خلق فراغ عن طريق سحب 4 مل من 50 مل عدد 1 حقنة، والتي يبلغ قطرها 27 ملم.
15. في علامة التبويب فرز
    1. تعيين المعلمات حقن الصمامات. وقد حسبت أن حجم الحقن الذي قدم خلية واحدة منتقية كان 1 ميكرولتر، إذا تم فتح الصمام 2 لمدة 120 مللي ثانية ثم فتح الصمام 1 لمدة 20 كان ميلي ثانية بعد مرور 200 مللي ثانية. نظرا لمرونة الأنابيب، وفتح صمام 1 لوقف حقن التدفق.
    2. تعيين المعلمات البيك اب من الصمامات. وقد حسبت أنه إذا تم فتح الصمام 1 لمدة 20 مللي ثانية ثم تم فتح الصمام 2 لمدة 10 مللي ثانية ، بعد مرور فترة زمنية قدرها 10 مللي ثانية ، يمكن التقاط معظم الخلايا المنقوشة. وذلك لأن تم تخفيف الارتباطات فيبرومنيكتين بعد أن تعامل بواسطة التربسين.
    3. انقر على زر حساب المسار. يحسب البرنامج المسار الأسرع من خلية إلى خلية ، لالتقاط وضخ الخلايا المحددة في جميع أنحاء الشريحة.
    4. ركز المجهر على خلية منقوشة على سطح الشريحة.
    5. باستخدام عصا التحكم، قم بتحريك الكابيلا الصغير إلى أسفل بعناية، بحيث يمكن الحصول على أوضح صورة لـ طرف الكابيلا الدقيقة دون لمس الخلية.
    6. انقر فوق الزر تعيين في قسم الإزاحة Micropipette. نافذة جديدة سوف يطفو على رأس الباب، تظهر المقطع العرضي للميكريلايري. انقر على مركز الدقيق من الشعرية. البرنامج ثم تسجيل إزاحة تلميح من الشعرية في س، ص و الإحداثيات ض.
    7. بدء الفرز باستخدام الزر بدء الفرز.

Results

تم تشريح الأنسجة من البطين الأيسر لقلوب الفئران الوليدية التي يبلغ عمرها يومين وقسمت إلى خلايا مفردة. ثم تم زرع CMs المخصب على رقاقة تحتوي على أنماط fibronectin مع ARs متميزة. بعد 72 ساعة من الاستزراع، تم استبدال المتوسطة بنسبة 1:1000 Vibrant صبغ دورة خضراء في DPBS^-/- لمدة 2 دقيقة لتصور نواة الخلايا الحية. بعد ذلك ، تم علاج الخلايا مع DPBS^{-/ -}/ التربسين (1:1) لتخفيف الخلايا من الليفية ، بحيث يمكن استخدام فراغ سائل لتسهيل التقاط الخلايا. وفي الوقت نفسه، تم مسح الشريحة بأكملها في تكبير 10x، وذلك باستخدام مجهر مقلوب متصلة منتقي الخلايا. وقد تم ذلك قبل أن تصبح الخلايا مقربة بسبب العلاج التربسين. تم اختيار الخلايا المؤهلة، استناداً إلى الصورة الممسوحة ضوئياً، وتم حفظ إحداثياتها في برنامج منتقي الخلايا. تم اختيار micropatterns فقط إذا كانت تحتوي على خلية واحدة أحادية النواة وفقط عندما تغطي الخلية بالكامل micropattern الليفية الخاصة بها. اختار فارز الخلية الخلايا المختارة واحدة تلو الآخرة، وتم على الفور حقن كل خلية واحدة تم انتقاؤها بنجاح في أنبوب PCR فردي ووضعت على مرحلة المجهر. كل أنبوب PCR تحتوي على 3.55 ميكرولتر من العازلة تحلل(الجدول 2). وقد اكتملت عملية الفرز، التي بدأت بإزالة الوسائط، في غضون 40 دقيقة. تم إجراء تخليق حمض deoxyribonucleleic (cDNA) التكميلي ، والتشويه قبل البوليصة والتنقية على الخلايا المفردة ، استنادًا إلى بروتوكول Smart-Seq2²⁴ (الجدول 3). تم فحص جودة cDNA المنقى من قبل محلل كهربائي آلي. يتم تقديم مخطط كهربية من cDNA قبل تضخيم من خلية واحدة التقطت في الشكل 4. تم إعداد مكتبات RNA-Seq وفقا لبروتوكول سمارت-Seq2²⁴.

لمراقبة بنية الساركومير لـ CMs المنقوشة ، كانت CMs المنقوشة ملطخة بالأجسام المضادة α actinin. كانت الخلايا محتضنة مع حمار مكافحة الماوس IgG اليكسا فلور 488 1:800 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لطخة الثانوية. كانت النوى ملطخة بـ 1 ميكروغرام/مل من DAPI. تم الحصول على صور مناعية مع مجهر مقنن ، باستخدام 63x النفط الغمر (NA 1.4) الهدف (الشكل 5).

الشكل 1: تخطيط الرقاقة مع micropatterns فيبرومينيكتان.
(A) صورة للرقاقة المصممة خصيصا. الرقاقة هي 19.5 مم × 19.5 ملم مع أغطية صغيرة الليفية ، مطبوعة بواسطة الطباعة الضوئية على زجاج البورسليكات. (B) تخطيط رقاقة. وتنقسم الرقاقة إلى ثلاث مناطق وتتكون كل منطقة من micropatterns fibronectin مع محددة AR. يتم عرض الصور الفلورسنت من أشكال مختلفة من micropatterns في الليفية في عرض مكبرة لكل منطقة. وقد تم تعديل هذا الرقم من"المواد التكميلية 1"بواسطة هافباراداران أصفهاني وآخرون²، المستخدم تحت http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: انفصام مجهزة جهاز سخانات.
(أ) كامل جهاز الفصام المستخدمة في تفكيك مؤتمتة بالكامل من الفئران الوليدية 2-day القديمة غادر البطينين. (B) وحدة التدفئة. (C) الدوار - غطاء أنبوب. (D) برامج جاهزة للاستخدام لسير عمل مؤتمت بالكامل من تفكك الأنسجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: جهاز منتقي الخلايا.
(A) عرض موسع للمرحلة الآلية من منتقي الخلايا. حامل بتري طبق و 80 حفرة ل10 شرائط PCR وثقب للمعايرة متقاطعة هو جزء لا يتجزأ على المسرح. (B) عرض الموسع من الزجاج microcapillary. (C) مضخة الحقنة. (D)وحدة التحكم، التي تسيطر على نافذة وقت الفتح والإغلاق للصمامات 1 و 2، مثبتة داخل وحدة التحكم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: المخطط الكهربائي للcDNA قبل تضخيم من واحد اختار خلية واحدة.
19 دورة PCR من ما قبل التضخيم استخدمت للحصول على 15 ميكرولتر من 1 نانوغرام / ميكرولتر من العائد cDNA المنقى. لوحظ شريط واضح في مؤامرة قياس كثافة هلامية تشبه الذي يتوافق مع الذروة في 1852 bp في electropherogram. متوسط حجم الشظايا هو 1588 نقطة أساس. وعلاوة على ذلك، فإن كمية صغيرة من الشظايا التي هي أقصر من 300 bp يشير إلى مكتبة cDNA جيدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تلطيخ مناعي من بنية ساركوميركية α actinin (الأخضر) ونواة (الأزرق) من CMs منقوشة مع مختلف ARs.
الكروماتين كان ملطخاً من قبل DAPI. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مورفوتايب	ع	الطول (ميكرومتر)	العرض (ميكرومتر)	منطقة فيبينينكات (μm2)
AR1	1:1	47	47	2209
AR7	7:1	126	18	2268
AR11	11:1	155	14	2170

الجدول 1: هندسة نظام إدارة المباني منقوشة.

مكون	حجم (ميكرولتر)
مياه خالية من النوى	0.65
(0.4٪ وحدة/وحدة) تريتون X-100	1.8
dNTP مزيج (25 mM)	0.8
مثبط RNase (40 U μL-1)	0.1
Oligo-dT30VN oligonucleotides (100 ميكرومتر)	0.1
ERCC RNA سبايك-إن ميكس (2.5 × 105 تخفيف)	0.1
حقن خلية واحدة	1
الحجم الإجمالي	4.55

الجدول 2: خلية واحدة مخصصة تحلل العازلة.

مكون	حجم (ميكرولتر)
العازلة العازلة الأولى للسوبرسكريبت الثاني (5x)	2
DTT (100 mM)	0.5
البيتين (5 م)	2
مغكل2 (1 م)	0.1
مثبط RNase (40 U μL-1)	0.25
Superscript II النسخ العكسي (200 U μL-1)	0.5
TSO (100 ميكرومتر)	0.1
الحجم الإجمالي	5.45

الجدول 3: النسخ العكسي (RT) مزيج لتفاعل RT واحد لتوليف أول حبلا cDNA من lysate من CM واحد.

Discussion

استخدمت هذه الدراسة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وهي تقنية جديدة وقوية يمكنها اكتشاف نسخة الخلايا الفردية. وقد اقترن بنهج مبتكر في زراعة تدابير البرمجة المشتركة الوحيدة، بحيث أنها أخذت على مختلف المفاعلات ARs التي، خلاف ذلك، كان يمكن أن يكون فقط لوحظ في الجسم الحي.

وكان للدراسة بعض القيود. على سبيل المثال، كان يجب استخدام CMs الوليدي لإنشاء أنواع مختلفة من المورفولوجيين، لأنها تشكل تحديًا استثنائيًا للثقافة بما يكفي من CMs الحيوية للبالغين لمدة 72 ساعة في أشكال محددة. وعلاوة على ذلك، تم استزراع CMs لمدة 72 ساعة السابقين vivo، والتي قد يكون لها تأثير على نمط التعبير الجيني. ومع ذلك ، كان هذا الزرع ضروريًا ، بحيث يمكن للخلايا أن تشكل أنواعًا محددة من المورفو. وعلاوة على ذلك، تم اختيار الخلايا الوحيدة التي كانت أحادية النواة وتغطي بالكامل micropattern الليفية للفرز. يجب فرز الخلايا المنقوشة على كل رقاقة فقط في جولة واحدة من الفرز. وأخيراً، تم التقاط حوالي 50 خلية تبلغ حوالي ثلث الخلايا المختارة بنجاح من كل رقاقة. هناك سببان تقييد عدد الخلايا التي تم انتقاؤها بنجاح. أولاً، كانت بعض الخلايا متصلة بإحكام بنمط الليفي ولم يكن تدفق البيك آب قسريًا بما يكفي لالتقاطها بنجاح. ثانيا، بسبب العلاج التربسين، أصبح المرفق بين بعض الخلايا وليفية فضفاضة جدا. وبالتالي، تم دفع هذه الخلايا بعيدا عن micropatterns فينينيكتين، عندما اقترب من الكابيليا الدقيقة لهم، وأنها لم يتم التقاطها. المؤلف لا يدعي أن هذا الإعداد هو نفسه في بيئة الجسم الحي ، لكنه ثبت أن يكون نهجا قابلا للتطبيق للإجابة على السؤال البحثي.

والطريقة المقترحة قابلة للتطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال، بالنسبة لـ hiPS-CMs). ومع ذلك، يجب أن يكون الأمثل العوامل التالية لدراسة أنواع الخلايا الأخرى. وينبغي استخدام جزيئات لاصقة مناسبة ECM للتعلق من نوع الخلية محددة لطلاء micropatterns. وينبغي تعديل هندسة micropatterns وفقا لمسألة الدراسة ونوع الخلية. يمكن تعديل فترة الاستزراع بناءً على سؤال الدراسة. يجب تحسين مفرزة وحضانة الوقت بدقة لخلية الدراسة. على سبيل المثال، Accutase يمكن استخدامها بدلا من TryplE فصاخلة الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا العصبية. وينبغي فحص المعلمات وقت الافتتاح للصمامات لاختيار الخلايا بنجاح، ولكن بلطف. باختصار، قمنا بتصميم منصة جديدة لدراسة شكل الخلايا التي يمكن أن توفر موردا قيما للباحثين في هذا المجال. في هذا السياق ، قمنا بتصميم نهج تجريبي يحاكي الأشكال المميزة في المختبرات المفروضة على CM في الجسم الحي من القيود الديناميكية الدموية لتحديد التفاعل بين العمارة الخلوية والتعبير الجيني. كما نبلغ عن تطوير منصة جديدة لدراسة HF في المختبر وتحديد شكل الخلايا كمحدد قوي للتعبير الجيني. هذه ملاحظة جديدة ذات آثار بعيدة المدى على علم الأحياء والطب.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 أداة التحليل الحيوي	Agilent Technologies	G2939BA	الرحلان الكهربائي الآلي
المضاد لخلايا الدم الحمراء MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-109-681
Axio Observer المجهر	Zeiss	Z1	المجهر المقلوب
محلول البيتين (5 م)	سيجما ألدريتش ، MERCK	B0300
CellSorter	CELLSORTER	https://www.singlecellpicker.com/	منتقي الخلايا
CYTOOchamber	CYTOO	30-010	رقاقة مصممة خصيصا
CYTOOchip	CYTOO	10-950-00-18	Chamber
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31966-021	نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX
مزيج dNTP (25 ملم)	Thermo Fisher Scientific	R1122
الحمار المضاد للفأر IgG Alexa Fluor 488	Abcam PLC	ab150105
DTT (100 ملم)	Thermo Fisher Scientific	18064071
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	4456740
مصل الأبقار	الجنيني Thermo Fisher Scientific	10082-147
Fibronectin	Sigma-Aldrich ، MERCK	F4759
gentleMACS C Tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	أنبوب دوار بغطاء
لطيفMACS Octo Dissociator مع سخانات	Miltenyi Biotec	130-096-427	Dissociator مع سخان
Greiner CELLSTAR طبق بتري	Sigma-Aldrich ، MERCK	P6987
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-056
مصل الحصان	Sigma-Aldrich ، MERCK	H0146
LD العمود	Miltenyi Biotec	130-042-901
متوسط 199	ثيرمو فيشر العلمي	31150-022
NE-1000 مضخة حقنة	أنظمة مضخات العصر الجديد	NE-1000	مضخة حقنة
كوكتيل عزل خلايا عضلة القلب لحديثي الولادة ، الفئران	Miltenyi Biotec	130-105-420
طقم تفكك قلب حديثي الولادة ، الفأر والجرذان	Miltenyi Biotec	130-098-373
Oligo-dT30< / sub>VN قليل النوكليوتيدات	IDT Technology	5 & prime; – AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3 &
مثبط RNAse (40 وحدة & micro; L-1< / sup>)	Clontech	2313A
sarcomeric & alpha & actinin	Sigma-Aldrich ، MERCK	EA-53
SP8 مجهر متحد البؤر	Leica Microsystems	SP8	مجهر متحد البؤر
Superscript II أول حبلا عازل (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Superscript II النسخ العكسي (200 U & micro; L-1< / sup>)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Triton X-100	Sigma-Aldrich ،	T9284
TryplE Express ، لا يوجد فينول أحمر	Thermo Fisher Scientific	12604013
TSO (100 & micro ؛ م)	QIAGEN	5 & prime ؛ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG + G-3 &
صبغ نابضة بالحياة خضراء	ثيرمو فيشر Scientific	V35004