مقالة منهجية

استكشاف بنية الأنسجة الدهنية من ميثيل ساليسيلات المقاصة والتصوير ثلاثي الأبعاد

DOI:

10.3791/61640

⸱

أغسطس 19, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن وصف طريقة بسيطة وغير مكلفة وسريعة المقاصة لحل هيكل 3D من كل من الماوس والبشر الأبيض الدهني باستخدام مزيج من علامات لتصور الأوعية الدموية، والنوى، والخلايا المناعية، والخلايا العصبية، والبروتينات معطف قطرات الدهون عن طريق التصوير الفلورسنت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمنة هي قضية الصحة العامة الرئيسية في جميع أنحاء العالم التي تزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري من النوع 2، وأمراض الكبد. تتميز السمنة بزيادة في الأنسجة الدهنية (AT) كتلة بسبب فرط التنسج الدهني و / أو الفرط في التروبيه، مما يؤدي إلى إعادة عرض عميقة لهيكلها ثلاثي الأبعاد. في الواقع ، فإن القدرة القصوى لـ AT على التوسع أثناء السمنة أمر محوري لتطوير الأمراض المرتبطة بالسمنة. هذا التوسع AT هو آلية هامة المثلية لتمكين التكيف مع زيادة كمية الطاقة وتجنب الآثار الضارة للدهون إلى الأجهزة الأيضية الأخرى, مثل العضلات والكبد. ولذلك، فهم إعادة البناء الهيكلية التي تؤدي إلى فشل التوسع AT هو مسألة أساسية مع تطبيق السريرية عالية. في هذه المقالة، نحن وصف طريقة بسيطة وسريعة المقاصة التي تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لاستكشاف مورفولوجيا الماوس والبشر الأبيض الدهني الأنسجة عن طريق التصوير الفلورسنت. يتم تنفيذ طريقة إزالة AT المحسنة هذه بسهولة في أي مختبر قياسي مجهز بغطاء كيميائي، وشاكر مداري يتم التحكم فيه بدرجة الحرارة ومجهر فلوري. وعلاوة على ذلك، فإن المركبات الكيميائية المستخدمة متاحة بسهولة. الأهم من ذلك، هذه الطريقة تسمح لأحد لحل هيكل AT 3D عن طريق تلطيخ علامات مختلفة لتصور على وجه التحديد adipocytes، والشبكات العصبية والأوعية الدموية، وتوزيع الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتميز السمنة بزيادة في كتلة الأنسجة الدهنية وأصبحت قضية رئيسية في مجال الصحة العامة في جميع أنحاء العالم، بالنظر إلى أن الأشخاص الذين يعانون من السمنة لديهم خطر متزايد للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري من النوع 2، وأمراض الكبد وبعض أنواع السرطان.

وظيفة فسيولوجية أساسية من الأنسجة الدهنية هو تعديل الجلوكوز في الجسم كله والدهون التوازن1,2. خلال فترة التغذية، يخزن الخلايا الشحمية (أي الخلايا الرئيسية للأنسجة الدهنية) الفائض من الجلوكوز والدهون التي توفرها وجبة في الدهون الثلاثية. أثناء الصيام ، تقوم الخلايا الشحمية بتكسير الدهون الثلاثية إلى أحماض دهنية غير مُهجنة وغليسيرول للحفاظ على الطلب على الطاقة في الجسم. خلال تطور السمنة، يوسع النسيج الدهني عن طريق زيادة حجم (الضخام) و /أو عدد (فرط تنسج) من الخلايا الشحمية1، لزيادة قدرتها التخزينية. عندما يصل توسع الأنسجة الدهنية إلى حده الأقصى، وهو متغير ثابت للغاية بين المرضى، تتراكم الدهون المتبقية في الأجهزة الأيضية الأخرى بما في ذلك العضلات والكبد3،4، مما يؤدي إلى فشلها الوظيفي وبدء مضاعفات القلب والتمثيل الغذائي المرتبطة بالسمنة1،5. ولذلك، فإن تحديد الآليات التي تحكم توسع الأنسجة الدهنية هو تحد سريري رئيسي.

ترتبط التعديلات المورفولوجية الموثقة داخل الأنسجة الدهنية أثناء السمنة بخللها المرضي. وقد استخدمت العديد من إجراءات تلطيخ لوصف تنظيم الأنسجة من الأنسجة الدهنية، بما في ذلك actin6، علامات الأوعية الدموية7، علامات قطرات الدهون8، وعلامات محددة الخلايا المناعية9،10. ومع ذلك، بسبب القطر الضخم من adipocytes (50 إلى 200 ميكرومتر)11، فمن الضروري لتحليل جزء كبير من الأنسجة كلها في ثلاثة أبعاد من أجل تحليل دقيق التغيرات DRAMATIC AT الهيكلية لاحظت أثناء السمنة. ومع ذلك، لأن الضوء لا يخترق نسيجًا مبهمًا، فإن التصوير ثلاثي الأبعاد داخل عينات الأنسجة الكبيرة باستخدام المجهر الفلوري غير ممكن. وقد تم الإبلاغ عن طرق تطهير الأنسجة لجعلها شفافة في الأدبيات (للمراجعة ، انظر12)مما يسمح للمرء بمسح الأنسجة وإجراء مجهر مجهري فلورانس الأنسجة بالكامل. هذه الأساليب توفر فرصا غير مسبوقة لتقييم التنظيم الخلوي 3D في الأنسجة الصحية والمامراضة. كل من الطرق الموصوفة لها مزايا وعيوب، وبالتالي تحتاج إلى أن يتم اختيار بعناية اعتمادا على الأنسجة درس (لاستعراض، انظر13). في الواقع، تتطلب بعض الأساليب فترة حضانة طويلة و / أو استخدام المواد أو المركبات التي هي إما مكلفة أو سامة أو يصعب الحصول على14،15،16،17،18،19. الاستفادة من واحدة من أول المركبات المستخدمة قبل قرن من قبل فيرنر Spalteholz لمسح الأنسجة20، وضعنا بروتوكول سهل الاستعمال وغير مكلفة التي هي مكيفة بشكل جيد جدا لتطهير جميع الماوس ومستودعات الأنسجة الدهنية البشرية في أي مختبر مع معدات نموذجية بما في ذلك غطاء محرك السيارة الكيميائية ، وشاكر المداري درجة الحرارة التي تسيطر عليها والمجهر confocal.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختبار هذا البروتوكول ويتم التحقق من صحة جميع الماوس ومستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء البيضاء البشرية. تم جمع الأنسجة الدهنية البشرية والفأر وفقا للقوانين الأوروبية ووافقت عليها اللجان الأخلاقية الفرنسية والسويدية.

1. تثبيت الماوس والبشر الأنسجة الدهنية البيضاء

  1. غمر الماوس المحاصَد أو الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية في 10 مل على الأقل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ شبهفورمالدهيد (PFA) في أنبوب بلاستيكي 15 مل.
  2. يهز أنبوب من البلاستيك في درجة حرارة الغرفة على لوحة المتداول لمدة 1 ساعة.
  3. ترك أنبوب من البلاستيك في 4 درجة مئوية على لوحة المتداول بين عشية وضحاها، لإكمال التثبيت.
    ملاحظة: يتم تكييف هذا البروتوكول لعينات الأنسجة الدهنية الكبيرة، مثل منصات الدهون الظهارية الكاملة التي تم الحصول عليها من الفئران تغذية نظام غذائي عادي (≈250 ملغ - ≈0.6 سم3). للحصول على عينات أكبر مثل منصات الدهون الظهارية التي تم الحصول عليها من الفئران تغذية نظام غذائي عالي الدهون (≈1.5 ز - ≈4 سم3)أو عينات الأنسجة الدهنية البشرية، على الرغم من أن بروتوكول المقاصة يجب أن تعمل تماما للعينة بأكملها (عن طريق توسيع نطاق PFA ومخاليط الأجسام المضادة)، بشكل عام، نحن قطع قطع الأنسجة حول 1 ز (≈2.5 سم3)لحجز العينات المتبقية إما لتلطيخ إضافية أو تطبيقات. بالنسبة ل PFA (الخطوة 1.1.) نوصي باستخدام ما يقرب من 10 أضعاف حجم الأنسجة. بالنسبة لخلائط الأجسام المضادة (الخطوات 3.1. و 3.4.) ، قم بزيادة الحجم لتزج تماما في الأنسجة ، واستخدام أنبوب بلاستيكي 15 مل (انظر جدول المواد)إذا كان النسيج كبيرًا جدًا على 1.5 مل من الأنابيب البلاستيكية الدقيقة (انظر جدول المواد).

2. Permeabilization وتشبع الماوس والبشر الأنسجة الدهنية البيضاء

  1. شطف الأنسجة الدهنية البيضاء الثابتة في 10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة جميع آثار PFA.
  2. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكية 15 مل يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 0.3٪ جليسين (انظر جدول المواد)وهز الأنبوب في درجة حرارة الغرفة في شاكر المدارية لمدة 1 ساعة في 100 الثورات في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لإرواء المجموعات الألدهيد الحرة المتبقية.
  3. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من PBS مستكملا بنسبة 0.2٪ تريتون X-100 (انظر جدول المواد)ويهز الأنبوب عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري يتم التحكم فيه بدرجة حرارة لمدة 2 ساعة عند 100 دورة في الدقيقة.
  4. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من PBS تكملها 0.2٪ تريتون X-100 و 20٪ DMSO (انظر جدول المواد)وهز الأنبوب عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري يتم التحكم فيه بدرجة حرارة عند 100 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  5. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكية 15 مل تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 0.1٪ توين-20 (انظر جدول المواد)،0.1٪ تريتون X-100، 0.1% deoxycholate (انظر جدول المواد)و 20% DMSO واهتزاز الأنبوب عند 37 °C في درجة حرارة الحرارة في 100 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة على الأقل.
  6. شطف الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 0.2٪ تريتون X-100 وهز الأنبوب في درجة حرارة الغرفة في شاكر المدارية في 100 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
  7. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من PBS مكمّل مع 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA (انظر جدول المواد) ويهز الأنبوب عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري يتم التحكم فيه بدرجة حرارة عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة، لتشبع أي مواقع يمكن أن تربط الأجسام المضادة بشكل غير محدد.
    ملاحظة: في الخطوة 2.7، يمكن استبدال BSA بمصل الدم من الأنواع من الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة.

3. تلطيخ الإجراء للماوس والبشر الأنسجة الدهنية البيضاء

  1. نقل الأنسجة في 1.5 مل البلاستيك microtube التي تحتوي على 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تكملها 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO، 3٪ BSA والأجسام المضادة الأولية (10x أكثر تركيزا من لتلوين البكاء ولكن ينبغي تقييم تركيز الأجسام المضادة الأمثل لكل الأجسام المضادة). حماية أنبوب من الضوء عن طريق تغطية مع رقائق الألومنيوم وهز الأنبوب في 37 درجة مئوية في درجة حرارة الحرارة في هزة المدارية في 100 دورة في الدقيقة لمدة يومين على الأقل (انظر الملاحظة في الخطوة 1.1 والخطوة 3.7.1).
  2. شطف الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من PBS تكملها 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA وهز الأنبوب المحمي من الضوء في 37 درجة مئوية في شاكر المداري الذي تسيطر عليه درجة الحرارة في 100 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعات. تنفيذ هذه الخطوة مرتين.
  3. شطف الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من PBS تكملها 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO و 3٪ BSA وهز الأنبوب، محمية من الضوء، في 37 درجة مئوية في شاكر المداري درجة الحرارة التي تسيطر عليها في 100 دورة في الدقيقة لليلة واحدة إلى يومين.
  4. نقل الأنسجة إلى 1.5 مل البلاستيك microtube التي تحتوي على 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تكملها 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO، 3٪ BSA والأجسام المضادة الثانوية (10x أكثر تركيزا من تلطيخ الصراخ). حماية أنبوب من الضوء عن طريق تغطية مع رقائق الألومنيوم وهز الأنبوب في 37 درجة مئوية في درجة حرارة الحرارة في هزة المدارية في 100 دورة في الدقيقة لمدة يومين على الأقل (انظر الملاحظة في الخطوة 1.1 والخطوة 3.7.1).
  5. شطف الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من PBS تكملها 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO، و 3٪ BSA وتهز الأنبوب، محمية من الضوء، في 37 درجة مئوية في شاكر مداري درجة حرارة تسيطر عليه عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعات. تنفيذ هذه الخطوة مرتين.
  6. شطف الأنسجة في أنبوب بلاستيكية 15 مل تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ DMSO، و 3٪ BSA وهز الأنبوب، محمية من الضوء، في 37 درجة مئوية في شاكر المدارية التي تسيطر عليها درجة الحرارة في 100 دورة في الدقيقة لمدة ليلة واحدة إلى يومين.
  7. شطف الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني وهز الأنبوب، المحمي من الضوء، في 37 درجة مئوية في شاكر المدارية التي تسيطر عليها درجة الحرارة في 100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: لوضع العلامات من هياكل محددة مثل النوى أو actin، إضافة 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI أو ما يعادلها) و/ أو الفلورسنت المسمى-phalloidin يجب أن تضاف في الخطوة 3.1. عندما يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية ذات العلامات الفلورية فقط، أو في الخطوة 3.4. عندما يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية.
    ملاحظة: بالنسبة لإجراء التلطيخ، يمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة بالفعل مع الفلوروكرومات (مثل تلك المستخدمة في قياس التدفق) ونوصي بها لتحقيق كسب الوقت وخصوصية. في الواقع، حتى لو يمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية الماوس متبوعة بالأجسام المضادة المضادة ماوس الثانوية، كما أظهرنا هنا، لاحظنا في كثير من الأحيان غير محددة تلطيخ الأوعية الدموية بسبب تعميم الغلوبولين المناعي. لذلك ، لتجنب هذه المشكلة ، يوصى بشدة بالأجسام المضادة الأولية التي تم وضع علامات عليها ، وهنا نقدم أدلة على أن الأجسام المضادة المستخدمة في قياس تدفق المضادات تتوافق مع الإجراء الخاص بنا. ومع ذلك، في حالة مستضد معين يتم التعبير عنه بمستويات منخفضة، فإن خطوة تضخيم الإشارة عبر الأجسام المضادة الثانوية هي إلزامية؛ عندما يتم إجراء الأجسام المضادة الأولية الوحيدة المتاحة في الماوس، القلب- الضخ من الفئران مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على الأقل في التضحية يمكن إزالة نسبة كبيرة من الغلوبولين المناعي المتداولة وبالتالي تلطيخ غير محددة.

4. إجراء المقاصة للماوس والبشر الأنسجة الدهنية البيضاء

  1. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من الإيثانول 50٪ وهز الأنبوب ، محمي من الضوء ، في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
  2. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من الإيثانول 70٪ وهز الأنبوب ، محمي من الضوء ، في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
  3. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من الإيثانول 95٪ وهز الأنبوب ، محمي من الضوء ، في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
  4. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من الإيثانول 100٪ وهز الأنبوب ، محمي من الضوء ، في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
  5. غمر الأنسجة في أنبوب بلاستيكي 15 مل يحتوي على 10 مل من الإيثانول 100٪ وهز الأنبوب ، المحمي من الضوء ، في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  6. غمر الأنسجة في زجاجة 20 مل مع غطاء بلاستيكي (انظر جدول المواد) يحتوي على 5 مل من salicylate الميثيل (انظر جدول المواد)تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية ويهز حاوية الزجاج، محمية من الضوء، في درجة حرارة الغرفة في شاكر المدارية في 100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن تسريع إجراء المقاصة بشكل ملحوظ (إذا لزم الأمر) عن طريق تجنب الخطوات 4.3. و4.5.، على الرغم من أن جودة المقاصة النهائية ستنخفض قليلاً.

5.3D confocal التصوير من الأنسجة الدهنية البيضاء مسح

  1. نقل الأنسجة إلى غرفة التصوير المعدنية مجهزة بأسفل زجاجي (انظر جدول المواد)تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية وملء الغرفة مع الساليسيلات الميثيل الطازجة.
    ملاحظة: لتأمين الأنسجة في مكانها، وبالتالي لمنعها من العائمة أو تتحرك جانبية في الغرفة، وتطبيق 18 مم متعددة غطاء الزجاج المستديرة (انظر جدول المواد)على رأس الأنسجة عند تركيبها في الغرفة.
  2. ضع غرفة التصوير على مجهر مقلوب.
  3. صورة الأنسجة باستخدام هدف التكبير منخفضة (على سبيل المثال، الهدف 4x) لتوليد بضعة سم3 3D خرائط من الأنسجة الدهنية كاملة أو عينة الأنسجة البشرية.
  4. حدد عدة مناطق لأخذ عينات الأنسجة عند التكبير الأعلى. عادة، استخدام هدف الهواء لمسافات طويلة 20x التي توفر نسبة جيدة بين القرار والعمق. نحصل على صور فسيفساء كبيرة مع z-مكدسات بين عمق 600 و 2000 μm.
    ملاحظة: استخدم هدفًا بعيدًا للصورة بشكل أعمق في الأنسجة.

6. استخراج النتائج الكمية من صور الأنسجة الدهنية 3D

ملاحظة: يمكن تنفيذ تجزئة الهياكل المختلفة والاستخراج اللاحق للمعلومات الكمية من رزمة الصور ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها في النقطة 5 باستخدام أي من خيارات برامج تحليل الصور العديدة الموجودة، سواء كانت تجارية أو مجانية. في النقاط التالية، نحن وصف استراتيجية التي تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لاستخراج المعلومات الكمية من صور الأنسجة الدهنية 3D باستخدام البرمجيات التجارية (انظر جدول المواد).

  1. قم بتحويل المكدسات ثلاثية الأبعاد إلى تنسيق البرنامج إلى مساحة ذاكرة حرة.
  2. تجزئة الخلايا.
    1. افتح وحدة الخلية للبرنامج.
    2. تغيير إعداد الكشف عن الخلايا إلى تلطيخ غشاء البلازما.
    3. اختيار قناة الفلورسنت من علامة تستخدم لتحديد محيط الخلية (phalloidin الذي تسميات actin القشرية أو علامات غشاء البلازما مثل F4/80 للغامة، TCR-β للخلايا التائية، أو مجموعة من البروتينات CD التمايز محددة لفئات الخلايا المناعية الفرعية).
    4. إعداد العتبات وتوفير نطاق من حجم الخلية المتوقعة (أي 1 إلى 200 ميكرومتر للكشف عن الخلايا).
    5. تشغيل التجزئة. سيتم إنشاء وحدة تخزين مطابقة إلى z-المكدس مع الخلايا المجزأة تلوينها بلون مختلف لكل من الخلايا المجاورة.
    6. تطبيق المرشحات الإحصائية (الحجم، والتدوير، والتدوير، الخ) في علامة التبويب الإحصائية لاستبعاد القطع الأثرية و/ أو لصقل الخلايا المجزأة إلى الخلية ذات الأهمية على أساس حجمها (أي 20-200 ميكرومتر للنوعات الدهنية؛ 5-25 ميكرومتر للبانوميات؛ 1-3 ميكرومتر لللمفيات).
    7. استخراج القياسات والبيانات الكمية (الحجم، العدد، الحجم، القطر، الخ) من علامة التبويب الإحصاءات.
  3. جزء المكونات الخلوية (النوى، الفويصلات، الخ) أو السفن كهيكل.
    ملاحظة: على الرغم من أن تجزئة خيوط مفيدة جدا لدراسة اتصال الأوعية، ونحن نستخدم تجزئة وحدة السطح لاستخراج البيانات عن حجم وحجم وأقطار السفن. في الواقع ، يتم فقدان القياس الكمي لأحجام الأوعية عند استخدام وحدة الخيوط.
    1. افتح وحدة Surface للبرنامج.
    2. حدد قناة الفلورسنت للعلامة المستخدمة لتسمية المكون دون الخلوية على وجه التحديد لإعادة بنائها في 3D.
    3. إعداد العتبات وتوفير مجموعة من حجم القطر المتوقع للهيكل (أي 0.5-5 ميكرومتر للنيوية؛ 0-100 ميكرومتر للسفن؛ إلخ.
    4. تشغيل التجزئة. سيتم إنشاء وحدة تخزين مع بنية الخلوية المجزأة. يمكن استخلاص القياسات والبيانات الكمية (الحجم، العدد، الحجم، القطر، إلخ) من علامة تبويب الإحصاءات.
  4. تجزئة السفن كسلسلة انبوبية.
    ملاحظة: على الرغم من أن تجزئة خيوط مفيدة جدا لدراسة اتصال الأوعية، ونحن نستخدم تجزئة وحدة السطح لاستخراج البيانات عن حجم وحجم وأقطار السفن. في الواقع ، يتم فقدان القياس الكمي لأحجام الأوعية عند استخدام وحدة الخيوط.
    1. افتح وحدة الخيوط للبرنامج.
    2. حدد قناة الفلورسنت المقابلة لتلوين السفينة.
    3. قم بإعداد عتبات شدة الفلورسينس وحدد العدد المناسب للعقد التي يتم توصيلها.
    4. تشغيل التجزئة. سيتم إنشاء خيوط تمثل شبكة السفن في 3D. يمكن استخلاص القياسات من علامة التبويب الإحصاءات، مما يسمح بالحصول على بيانات كمية بما في ذلك طول السفينة، وعدد المتفرعة عن السفينة، وما إلى ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الإجراء الموصوف هنا وتلخيص في الشكل 1، كنا قادرين على وصمة عار ووضوح بصريا الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية والفأر كما هو موضح في الشكل 2A والشكل 2B، على التوالي. تم نقل الأنسجة المُبرّة إلى غرفة التصوير المعدنية لإجراء التصوير confocal (الشكل 3A). المقاصة تحسنت بشكل كبير عمق الصور الأنسجة التي كنا قادرين على الحصول على (الشكل 3B والشكل 3C

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديلات التي تحدث داخل الأنسجة الدهنية على مدى التقدم المرضي ، مثل السمنة ، أمر أساسي لفهم الآليات وراء علم الأمراض. وقد استندت الدراسات الرائدة التي كشفت عن هذه الآليات في الأنسجة الدهنية على المقاربات العالمية مثل بروتيوميكس الأنسجة الدهنية21، تدفق الخلايا22،23، و24transcriptomics ،25. وبالإضافة إلى ذلك، بذلت جهود لاستكشاف التغيرات الهيكلية التي تحدث في الأنسجة الدهنية باستخدام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ أي تنازع للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل من قبل INSERM، جامعة كوت دازور، وبمنح من الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR) من خلال الاستثمارات في المستقبل لابكس SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01)، وبرنامج UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) عبر الأكاديمية 2 "مجمعات Systèmes" وأكاديمية 4 "Complexité eté التنوع du vivant", مؤسسة من أجل الـ Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587)، وبرنامج المحققين الشباب إلى J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي لـ C3M الذي يموله مجلس إدارة ألب- ماريتام و Région PACA، والذي تدعمه أيضًا منصة المجهر والتصوير IBISA Côte d'Azur (MICA). نشكر ماريون دوسوت على المساعدة التقنية في إعداد الأنسجة. نشكر آبي كوتريسس، الرؤية العلمية الدولية في جامعة UCA، على قراءة المخطوطة كدليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب دقيقةأنابيب Eppendorff - Dutscher33528
أنابيب بلاستيكية 15 مل أنابيبFalcon - Dutscher352096
غطاء زجاجي دائري 18 ممMariendfeld0117580 زجاجة زجاجية سعة 20
ملWheaton986546
الأجسام المضادة المترافقة للفأرJackson ImmunoResearch715-605-150التخفيف: 1/100
الأجسام المضادة المضادة للأرانب Alexa647 المترافقةJackson ImmunoResearch711-605-152التخفيف: 1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE الجسم المضادBiolegendBLE145703التخفيف: 1/100
CD31 الجسم المضادAbCamab215912التخفيف: 1/50
برنامج تحليل ثلاثي الأبعاد تجاري - أداةIMARIS Oxfordمع مجهر متحد البؤر لوحدة الخلية
- نيكون A1Rنيكون
دابيثيرموفيشرD1306تركيز المخزون: 5 مجم / مل ؛ التخفيف 1/1000
ديوكسي كولاتسيجما ألدريتشD6750
DMSOسيجما-ألدريتشD8418
Glut4 الجسم المضادسانتا كروزsc-53566التخفيف: 1/50
جلايسينسيجما-ألدريتشG7126
ليكتين-ديلايت 649مختبر ناقلاتDL-1178-1تركيز المخزون: 2 & ميكرو; ز /& مايكرو ؛ L; الحقن الوريدي: 50 وميكرو. L / فئران
غرفة تصوير معدنية مجهزة بقاع زجاجي - AttoFluorChamber ThermofisherA7816
ميثيل ساليسيلاتسيجما-ألدريتشM6752
الجسم المضاد بيريليبين651156التخفيف: 1/50
فالويدين أليكسا 488ثيرموفيشرA12379التخفيف: 1/100
TCR- & beta ؛ -PB الجسمالمضادBiolegendBLE109225التخفيف: 1/100
TH الجسم المضادAbCamab112التخفيف: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
  3. Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
  4. Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
  5. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).
  6. Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
  7. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  8. Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).
  9. Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
  10. Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
  11. Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
  12. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).
  15. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).
  16. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).
  17. Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).
  18. Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).
  19. Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).
  20. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
  21. Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
  22. Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
  23. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  24. Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
  25. Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).
  26. Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
  27. Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
  28. Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
  29. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
  30. Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).
  31. Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Triton X 100

مقالات ذات صلة