تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو حل حساس وسريع للكشف عن المتغير الجيني. ذلك يعتمد على الاختلافات التسلسل التي تؤدي إلى تغيير شكل heteroduplexes منحنى ذوبان. من خلال تمشيط HRM و agarose هلام الكهربائي، يمكن تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية مثل indels.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف الجيني المتغير في الجين CALR باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو وسيلة قوية لل genotyping والمسح الجيني الاختلاف. تعتمد معظم تطبيقات إدارة الموارد البشرية على تشبع أصباغ الحمض النووي التي تكشف عن اختلافات التسلسل ، واللاتيرودوبلس التي تغير شكل منحنى الذوبان. وهناك حاجة إلى دقة ممتازة للصك وبرامج خاصة لتحليل البيانات لتحديد الاختلافات الصغيرة في منحنى الذوبان التي تحدد متغيرا أو نمطا جينيا. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد للمرضى الذين يعانون من مرض معين ، وخاصة السرطان وفي جين CALR في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية النقوية السالبة للكروموسوم في فيلادلفيا. يمكن الكشف عن التغيرات النيوكليوتيدات واحد، الإدراج و / أو الحذف (indels) في الجين من الفائدة من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويستند تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية في الغالب على الضوابط المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية QPCR. ومع ذلك ، مع زيادة طول المنتج ، يصبح الفرق بين منحنيات البرية والهتيروزيجوتي أصغر ، ونوع المتغير الجيني أكثر صعوبة في تحديده. لذلك ، حيث indels هي البديل الجيني السائد المتوقع في جين الاهتمام ، يمكن استخدام طريقة إضافية مثل إلكتروفورسيس هلام الآغاروز لتوضيح نتيجة إدارة الموارد البشرية. في بعض الحالات، يجب إعادة فحص/إعادة تشخيص نتيجة غير حاسمة من خلال تسلسل سانجر القياسي. في هذه الدراسة بأثر رجعي، طبقنا هذه الطريقة على JAK2 V617F-المرضى الذين يعانون من MPN.
المقدمة
تم التعرف على المتغيرات الوراثية الجسدية في جين السعرات الحرارية(CALR)في عام 2013 في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية (MPN) مثل تجلط الدم الأساسي والتليف النقوي الأولي1،2. ومنذ ذلك الحين، تم اكتشاف أكثر من 50 متغيرا جينيا في جين CALR، مما أدى إلى تحول إطاري +1 (−1+2)3. المتغيران الجينيان الأكثر شيوعا في CALR هما حذف 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46))، وتسمى أيضا طفرة من النوع 1، وإدخال 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47))، وتسمى أيضا طفرة النوع 2. يمثل هذان المتغيران الجينيان 80٪ ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت لجنة الأخلاقيات الطبية في جمهورية سلوفينيا على الدراسة. وكانت جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي.
1. الفلورسينس القائم على الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) وتحليل ما بعد qPCR من قبل إدارة الموارد البشرية
- Resuspend التمهيديات المدرجة في جدول المواد إلى 100 ميكرومتر مع عقيمة، RNase و DNase الحرة H2O (انظر جدول المواد). جعل 10 ميكرومتر عمل تركيز التمهيدي. تم نشر المبرمجين المستخدمة في البروتوكول قبل2.
- الكمية المحببة الحمض النووي من قبل طريقة تلطيخ مضان بعد تعليمات الشركة المصنعة11 (انظر جدول المواد). إعدا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إن منطقة الحمض النووي التي تم تضخيمها بنجاح مع زيادة هائلة في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35 والقيم الضيقة للغاية لدورة القياس الكمي (Cq) في جميع العينات والضوابط المكررة(الشكل 2)هي شرط أساسي لتحديد المتغيرات الجينية الموثوق بها من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويتحقق ذلك باستخدام تحديد دقيق للحمض النووي مع تلطيخ الفلورسينس وكمية متساوية من الحمض النووي في تجربة إدارة الموارد البشرية QPCR (انظر الخطوة 1.2). ويبين الشكل 2 التضخيم الناجح لمنطقة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ذوبان عالية الدقة من الحمض النووي هو حل بسيط ل genotyping والمسح الجيني المتغير14. يعتمد ذلك على اختلافات التسلسل التي تؤدي إلى الترودوبليكس التي تغير شكل منحنى الذوبان. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد لمجموعة معينة من المرضى المصابين بالسرطان1و2و15و16و10. يمكن الكشف عن عمليات الحذف أو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع الخبراء الأكاديميين والموظفين في مختبر أمراض الدم المتخصص، قسم أمراض الدم، شعبة الطب الباطني، المركز الطبي الجامعي ليوبليانا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| E-Gel EX 4٪ Agarose | Invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase و E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix | 2X Applied Biosystem ، Thermo Fischer Scientific | 4415440 | المكونات: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase ، صبغة MeltDoctor trade HRM ، مزيج dNTP بما في ذلك dUTP ، أملاح المغنيسيوم ومكونات العازلة الأخرى ، تمت صياغتها بدقة للحصول على أفضل نتائج إدارة الموارد البشرية |
| تفاعل MicroAmp Fast 96 جيدا (0.1 مل) | الحيوية التطبيقية ، Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp فيلم لاصق بصري | Applied Biosystems ، Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | أنظمة توثيق جل |
| التمهيدي CALRex9 Forward | Eurofins | الجينوم: 5'GGCAAGGCCCTGAGGT'3 (عالي النقاء وخالي من الملح) | |
| التمهيدي CALRex9 تسلسل | الجينوم | العكسي Eurofins: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (عالي النقاء وخالي من الملح) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | طقم عزل الحمض النووي مع المخزن المؤقت لتخفيف الحمض النووي. |
| أنابيب فحص كيوبيت | Invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen ، Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder يتكون من 13 جزءا فرديا مع النطاقات المرجعية عند 2000 و 1500 و 600 نقطة أساس. |
| ViiA7 نظام PCR في الوقت الحقيقي | للأنظمة الحيوية التطبيقية ، Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| الماء خالية | من نوكلياز VWR ، علوم الحياة | 436912C | RNase ، DNase ومياه خالية من البروتياز |
المراجع
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproli....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
